Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Данные литературы
1.1 Современное состояние проблемы 15
1.2 Иммуноциты кожи человека 21
1.3 Реакция иммуноцитов кожи на повреждение 33
1.4 Современные представления о роли иммуноцитов в динамике формировании рубцов кожи после повреждения 36
1.5 Взаимодействие иммуноцитов в ходе репаративной регенерации 42
Глава 2 Материалы и методы исследования
2.1 Клиническая характеристика материала 45
2.2 Морфологические методы исследования 58
2.2.1 Метод окрашивания гематоксилин–эозином 59
2.2.2 Метод Ван–Гизона 60
2.3 Иммунная гистохимия 60
2.3.1 Идентификация антигенов 61
2.3.2 Иммуногистохимическая идентификация белка гена Ki67 66
2.4 Морфометрия 66
Глава 3 Результаты исследования и их обсуждение
3.1 Структура дефинитивной кожи человека в группе контроля 67
3.2 Взаимодействие иммуно–компетентных клеток в физиологической регенерации кожи человека 76
3.3 Мониторинг репаративной регенерации кожи после повреждения 84
3.4 Характеристика иммуноцитов в процессе репаративной регенерации кожи человека 103
Заключение 120
Выводы 130
Практические рекомендации 131
Список сокращений 132
Список литературы 134
- Иммуноциты кожи человека
- Идентификация антигенов
- Взаимодействие иммуно–компетентных клеток в физиологической регенерации кожи человека
- Характеристика иммуноцитов в процессе репаративной регенерации кожи человека
Иммуноциты кожи человека
Одним из представителей дифферонов кожи человека являются клетки Лангерганса (КЛ), которые как дендритные клетки (ДК) были обнаружены немецким учным Паулем Лангергансом в 1868 году в коже. Гипотеза Лангерганса о нейрогенном происхождении этого типа клеток впоследствии оказалось ошибочным, как и представление о них, как о внутриэпидермальных макрофагах, мигрирующих из дермы в эпидермис. После того, как в 1973 году R. Steinman и Z. Cochn были выявлены подобные клетки в селезнке мышей, они были представлены как особый новый вид лимфоидных клеток, входящих в единую систему морфо-функционально идентичных клеток, распределенных по всему организму. Морфологические особенности ДК заключаются в наличии многочисленных цитоплазматических отростков, их низкой плотностью, но высокой подвижностью, а также способностью индуцировать мощный иммунный ответ [106, 118, 189, 345].
Морфологическое подобие с макрофагами, незначительное содержание в органах и тканях затрудняет исследования этих клеток, которые начали стремительно развиваться после идентификации поверхностных антигенов, характерных именно для ДК, и внедрения в широкую практику иммуногистохимических исследований.
В настоящее время известно, что ДК происходят из костно–мозговых предшественников миелоидного и лимфоидного дифферонов и до встречи с антигенами (АГ) не являются эффекторными, находятся в неактивированном состоянии [312]. Захватывая и процессируя АГ, они проходят стадию дифференцировки, созревания и специализации, мигрируют в лимфатические узлы и селезнку, где выполняют антигенпредставляющую функцию [106, 193, 342].
Стандартные классические методы исследования практически не выявляют ДК. Наиболее верное распознавание этих клеток проводилось с помощью иммунной гистохимии.
Главный морфологический признак ДК – наличие многочисленных длинных (до 10 мкм и более) подвижных цитоплазматических отростков, определивших название этих клеток. Отростки образуются в процессе активации и дифференцировки ДК и в зависимости от типа ткани, окружающей клетки, могут быть самой разнообразной формы – нитевидными, в виде пластин (вуали) или луковичных псевдоподий [127,106]. С помощью фазово–контрастной микроскопии имеется возможность наблюдать активные движения отростков живых ДК [128]. Способность к изменению формы и размеров обеспечивает их высокую подвижность и уникальные межклеточные контактные взаимодействия с другими клетками. Предположение о том, что в организацию микрофиламентов клеточного цитоскелета ДК вовлечн белок р55 было подтверждено тем, что в отличие от моноцитов/макрофагов ДК содержат мало актиновых волокон, но около 80% этих клеток экспрессируют высокий уровень белка р55 [106, 118, 293].
ДК в целом характеризуются небольшим количеством органелл, наличием крупных митохондрий, сильно развитым аппаратом Гольджи и неправильной формой ядра, с кариолеммой, имеющей обычно многочисленные вдавления [106, 118, 360, 106].
В 1995 г. M. Kleijmeer с соавторами продемонстрировали наличие в ДК эндосом и лизосом, имеющих большое значение для функциональной активности ДК [106, 242]. Для клеток Лангерганса характерно присутствие в цитоплазме особых мембранных гранул Бирбека, имеющих форму теннисной ракетки, выявляющихся только с помощью метода трансмиссионной электронной микроскопии, с неизвестной пока функцией [118]. Было показано, что в организации гранул Бирбека участвует лангерин (Са–зависимый лектин II типа, экспрессируемый только клетками Лангерганса) АГ–связывающие свойства которого, возможно, обеспечивают новый, неклассический путь процессинга АГ [106, 118, 346].
Для ДК характерно низкое содержание таких ферментов, как пероксидаза, 5-нуклеотидаза, дипептид-пептидаза I и катепсин, что отличает их от макрофагов. Другие внутриклеточные энзимы, например неспецифические эстеразы, кислотные фосфатазы и лизосомальные АГ (СД68), в ограниченных количествах могут присутствовать в ДК, но их внутриклеточное распределение отличается от распределения в макрофагах.
Как и макрофаги, ДК обладают адгезивными свойствами, однако в процессе созревания эти свойства частично утрачиваются [106, 118, 377]. При этом, несмотря на морфологическую схожесть с макрофагами, клетки Лангерганса имеют ряд отличительных морфо-функциональных особенностей, в большей степени, количественного уровня [106, 118, 233].
Стволовая кроветворная клетка (СКК), а затем СD14-CDla+ предшественник дат начало КЛ – эпидермальным ДК, которые фенотипически характеризуются экспрессией Lag-AГ и лиганда для Е-кадгерина[118]. Морфологически эти клетки отличаются от всех других типов ДК не только наличием гранул Бирбека, но и более высоким уровнем экспрессии белка р55 [ 192]. В норме клетки Лангерганса локализуются в эпителиальных пластинках над базальным слоем пролиферирующих кератиноцитов и ассоциированы с нервными окончаниями [156, 106]. В 1 мм2 эпителиальной пластинки слизистых оболочек человека содержится примерно 103 клетки Лангерганса. Высвобождаемые нервными окончаниями ген–кальцитониновый пептид, гастрин–рилизинг–пептид, вазоинтестинальный пептид, гипофизарный полипептид, активизирующий аденилатциклазу, a–меланоцитстимулирующий гормон, а также в–эндорфин могут регулировать функциональную активность клеток Лангерганса, воздействуя на соответствующие рецепторы, имеющиеся на их поверхности [74, 106].
Дифференцировке предшественников (СКК) преимущественно в ДК, а не в гранулоциты способствуют такие цитокины, как ГМ-КСФ, ИЛ-4, ИЛ-6, c-KitL и Fit-3L (лиганды тирозин-киназного рецептора). При этом ИЛ-13 и ИЛ-7 могут в два раза усиливать эффект ИЛ-4, а фактор некроза опухоли (ФНО) и CD401 блокируют образование гранулоцитов и стимулируют окончательные этапы созревания ДК. В отличие от клеток Лангерганса, интердигитирующие клетки (ИДК) экспрессируют СD2, CD9, CD68, а также фактор коагуляции Xilla, но не экспрессируют Lag-AГ и лиганд для Е-кадгерина [106, 118, 217].
Также особенностью ДК является не только свойство осуществлять иммунную защиту, но и выделение ростовых факторов, поддерживающих жизнедеятельность клеток различных тканей [89]. ДК лимфоидного происхождения образуются в тимусе из унипотентного предшественника Т-лимфоцитов CD38dim (CD11c) под действием таких цитокинов, как ИД-1 и ФНО. ИЛ-7, ИЛ-3, c-KitL и Fit-3L и СL40L также увеличивают продукцию этого типа ДК. Эти клетки регулируют ДК-Т-В клеточное взаимодействие, обеспечивая жизнеспособность высокоаффинных В клеток, в то время как антигеннезависимые низкоаффинные В-клетки апоптозируют и фагоцитируются макрофагами [106, 327].
Небольшое количество ДК миелоидного ряда может дифференцироваться из предшественников в эффекторные клетки непосредственно в кровеносном русле [103,106].
Таким образом, иммунофенотипически, морфологически и функционально различные пулы ДК, имеющие происхождение из разных гемопоэтических предшественников и мигрирующие в разные ткани организма, образуют единую систему клеточных популяций, распознающих и представляющих АГ Т- и В-лимфоцитам для индуцирования иммунного ответа на чужеродные АГ или способствуя развитию толерантности к ауто-АГ [8, 118].
Для морфологически незрелых ДК характерно, как правило, отсутствие цитоплазматических отростков [270]. Также они имеют ряд отличительных морфологических особенностей, способствующих им фагоцитировать и представлять АГ более эффективно в сравнении с другими антигенпрезентирующими клетками. Так, незрелые АГ могут не только захватывать экзогенные АГ, но и образовывать везикулы для микро– и макро– пиноцитоза растворимых форм АГ [199, 106]. Кроме этого, ДК имеют экспрессирующиеся рецепторы, обеспечивающие адсорбцию экзогенных АГ, например, тип С лектиновых рецепторов, подобных маннозным рецепторам макрофагов, а также рецепторы DEC-205,Fcy и Gce [90]. Сочетание макропиноцитоза и рецепторо–опосредованного захвата АГ приводит к необычайно эффективному представлению АГ: достаточно пикомолярной или наномолярной концентрации АГ для мощного иммунного ответа, в то время как другие АПК чувствительны только к микромолярным концентрациям [141, 106]. ДК способны экспрессировать на плазмолемме комплексы АГ-МНС II, содержащие более крупные пептидные фрагменты АГ (до 26 аминокислот), отличающиеся высокой иммуногенностью [106, 268], что отличает их от макрофагов, способных разрушать экзогенные АГ с помощью гидролитических ферментов лизосомного аппарата до простых аминокислот и связывать в комплексы МНС II фагоцитированных АГ [118].
Идентификация антигенов
Идентификация локализации антигенов проводилась по одинаковой схеме в рамках протоколов производителя реактивов, несмотря на различную локализацию антигена в клеточных структурах: мембраны, лизосомы, ядра, комплекс Гольджи.
С целью определения фенотипа иммунокомпетентных клеток методом иммунной гистохимии биоптаты фиксировали в 10%–ном формалине на фосфатном буфере рН 6,8–7,2 в течение 24 часов. Затем промывали в проточной воде в течение 2 часов и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации в течение 1 часа в каждой порции спирта. В спирте 96 выдерживали в течение 1, 2, 1 часа и 4 часов, а затем помещали в абсолютный спирт 5 раз по 30 минут и оставляли в последней порции на ночь. После этого материал погружали в смесь абсолютного спирта и ксилола в соотношении 1:1 на 0,5 часа, а затем проводили в 3 сменах ксилола в термостате при 37 по 0,5 часа в каждой. Затем использовали смесь ксилол/парафин (1:1) при 56 по 20 минут в 2 порциях, а затем в 2 порциях парафина при 56 в течение 1 часа в обеих порциях. После этого производили заливку. Парафиновые блоки выдерживали в течение суток в термостате при температуре 37, а затем приготавливали срезы. Срезы и вся дальнейшая обработка материала (депарафинирование и обезвоживание) производились на автоматизированной аппаратуре лаборатории патоморфологии Медицинского университета Ниигаты (Япония), дающей высокую чувствительность к маркировке , в En Vision -системе. С помощью моноклональных антител (МКА) клон КР1, код № М 0814, лот, выявляли макрофаги по маркру CD68 (высокогликозилированный трансмембранный гликопротеин, который локализуется в лизосомах).
Молекулярный клон CD68 показал, что LGP (семейство лизосомальных гликопротеинов) с плазматическими мембранными белками играют роль в лизосомальных трафиках и эндоцитозе, включая лизосомальные ассоциации мембранных протеинов 1 и 2 (LAMP-1 и LAMP-2).
Для маркировки CD163 использовали клон 10 D6, класс иммуноглобулинов igG1. Демаскировка антигенных детерминант проводилась в стеклянном контейнере, заполненном восстанавливающим раствором и созданием условий водяной бани в течение 1 часа. Часть препаратов обработана с помощью микроволнового излучения, которое дат лучший демаскировочный эффект, в течение получаса. Использовали для демаскировки антигенов 10 ммоль/л цитратный буфер, рН 6,0 или DАКО TRS (Target retrieval solution, сode № S 1700). Остывшие препараты промывали в дистиллированной воде. Использовали антитела в разведении 1:50 и 1:100. Окраска коричневого цвета свидетельствовала о положительной реакции.
Фиксация и проводка материала:
– фиксация в 10%–ном забуференном формалине в течение суток;
– промывка в проточной воде - 3 часа;
– этанол 96 градусов - 1 час;
– этанол 96 градусов - 2 часа;
– этанол 96 градусов - 1 час;
– три смены этанола по 0,5 часа;
– абсолютный этанол - на ночь;
– смесь абсолютный этанол/ксилол - (1:1) - 30минут;
– три смены ксилола при 37 градусах - по 30 минут;
– смесь ксилол/парафин (1:1) при 56 градусах 30 минут;
– парафин-1 при 56 градусах - 1 час;
– парафин-2 при 56 градусах - 1 час; – заливка.
Депарафинирование и обезвоживание препаратов:
– ксилол - 2 смены по 5 минут;
– этанол абсолютный - 2 смены по 5 минут;
– этанол 96 градусов - две смены по 3 минуты;
– этанол 70 градусов - 3 минуты;
– ополаскиваем в дистиллированной воде;
– помещаем в фосфатно–солевой буфер (ТБС).
Маркировка иммуноцитов
Демаскировку антигенов и усиление иммуногистохимической маркировки антигенов проводили по методу HIAR с использованием водяной бани и ТRS (Target retrieval solution фирмы Dako, код S 1700) в течение 2 часов; если по протоколу HIAR проводили с использованием микроволновой печи, то демаскировка антигенов проводилась 2 раза по 5 минут. Открывание антигенов, индуцированное HIAR, дат хорошие результаты даже в том случае, если антиген после фиксации и заливки в парафин вообще не выявляется, что связано с энергозависимым разрушением мостиков между белками, которые образовались в процессе фиксации в формалине.
– Промывка в дистиллированной воде;
– помещаем срезы в ТБС;
– помещаем сткла в перекись водорода на 15 минут;
– промывка в ТБС;
– раскапать блокирующий реагент на 5 минут во влажной камере;
– раскапать МКА (моноклональные антитела) на 45 минут;
– промыть в трех порциях ТБС;
– раскапать связывающие антитела - 30 минут;
– промыть в трех сменах ТБС;
– раскапать конъюгированный с пероксидазой стрептавидин - 30 минут;
– промыть в трех сменах ТБС;
– нанести ДАБ на срезы от 10 до 20 минут под визуальным контролем;
– промыть в дистиллированной воде;
– докрасить гематоксилином ядра;
– заключить в бальзам.
Подсчт клеток производили в 100 полях зрения в 198 срезах. При этом подсчитывали общее количество иммуноцитов в поле зрения и анализировали степень их окрашивания.
Фон и неспецифическое окрашивание исключали, строго соблюдая условия окрашивания – температуру, рН, время. Для блокирования неспецифического окрашивания срезы в течение 20 минут инкубировали с неиммунной сывороткой, а уже затем инкубировали с первичными антителами. Для контроля и исключения артефактов при выполнении исследований часть препаратов обрабатывали дважды только неиммунной сывороткой.
Взаимодействие иммуно–компетентных клеток в физиологической регенерации кожи человека
В наших исследованиях в группах контроля в срезах, изготовленных из биоптатов кожи любой локализации, идентифицированы клетки CD дифференцировки: CD4, CD8, CD68, CD163, CD203а (Рисунок 12).
Динамика изменений соотношений иммуноцитов в коже человека нами отражена в диаграмме (Рисунок 13).
Локализация маркера CD4 не только в клетках дермы, прилежащей к базальной мембране эпидермиса, но и в кератиноцитах подтверждает барьерные свойства эпителия покровных тканей, а также является отражением их барьерной функции по отношению к внешним физическим воздействиям и микробной контаминации.
Выявление СD34 – трансмембранного фосфогликопротеина, впервые выявленного на гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках, показало, что СD34–позитивные клетки являются мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (МСК), в отличие от утверждений многих авторов о том, что МСК не несут маркеров для СD34. В большинстве полей зрения СD34(+) клетки составляют небольшую долю от общей клеточной популяции в структуре дермы. Клетки, которые несут маркеры СD34, одного из представителей рецепторов для фактора роста эндотелия сосудов, являются молекулами адгезии для представителей дифферонов СКК, участвующих в гистофизиологических процессах в коже человека, включая обеспечение потенциала дифференцировки кератиноцитов, а также фагоцитоза апоптозирующих клеток. Следует отметить, что полный спектр функций СD34 еще предстоит выяснить. Снижение или повышение экспрессии СD34 реализуется через изменение скорости миграции прогениторных клеток СКК в определнную зону для выполнения функции.
В наших исследованиях метки идентифицированы как в стромальных клетках, так и на эндотелиоцитах кровеносных сосудов. Учитывая значение фактора роста эндотелия для метаболизма и перестройки тканей, можно считать, что идентификация изменений рецепторов для него в эндотелиоцитах связана с изменением регенеративных способностей соединительной ткани дермы и эпидермиса. Следует отметить, что идентифицированные нами капилляры сосочкового слоя в нормальной коже группы контроля имели форму вертикальных дугообразных петель, не достигающих базальной мембраны и эпидермиса (Рисунок 14).
В связи с тем, что белок p53, являющийся транскрипционным фактором, который регулирует клеточный цикл и выполняет функцию супрессора образования злокачественных опухолей, ген, ответственный за его синтез, TP53, является антионкогеном. Это подтверждается также тем, что в клетках около 50% раковых опухолей обнаруживаются мутации гена TP53. Поскольку многие авторы рассматривают неконтролируемые келоидные разрастания как опухолевый рост, нами проведено исследование для получения характеристики локализации этого белка в коже человека в норме и в условиях репаративной регенерации. В коже группы контроля локализация р53 отмечалась исключительно в структурах дермы (Рисунок 15).
На современном этапе получены данные, свидетельствующие о том, что ген р63 необходим для коммитирования стволовых клеток эпидермиса в эмбриональном развитии. В то же время р63 обеспечивает проявление многих функций, которые необходимы для самоподдержания эпидермальных стволовых клеток взрослого эпидермиса. Его экспрессия обеспечивает адгезию кератиноцитов и подавление апоптоза, а также поддержание целостности эпидермиса как ткани (Celli et al., 1999). Эти фенотипические проявления, связанные с эктодермальной дисплазией и расщеплением лица, позволяют предположить, что первичная функция p63 заключается в регуляции развития. Одновременно сильная экспрессия гена р63 в базальном слое многих эпителиальных тканей и фенотип мышей р63- позволяют предположить, что этот ген имеет первостепенное значение для развития эпителиев и поддержания стволовых клеток. Принято считать, что в пренатальный период экспрессия р63 требуется для коммитирования эпидермальных клеток в незрелой эктодерме, в то время как в постнатальном онтогенезе р63 необходим для сохранения пролиферативного потенциала эпидермальных стволовых клеток. Поэтому данные об экспрессии белка р63 могут быть информативными не только в плане изучения возрастных изменений кожи, но и очень важны для оценки способности структур кожи к дифференцировке в условиях репаративной регенерации кожи после повреждений различной этиологии. Нами установлено, что р63 в коже группы контроля локализуется в камбиальных слоях эпидермиса, в кератиноцитах базального и шиповатого слоя (Рисунок 16).
Для оценки регенераторного потенциала структур кожи человека нами изучена характеристика возрастных изменений кожи в плане выявления клеток, необратимо вступивших в митоз, выявленных с помощью меток на белок гена Ki67. Было установлено, что в коже пациентов контрольной группы митотическая активность выявляется в клетках преимущественно шиповатого слоя в рядах клеток, прилежащих к камбиальному слою (Рисунок 17).
Данные о пролиферативной активности структур кожи человека в возрастном аспекте отражены в диаграмме (Рисунок 18).
По нашим данным и результатам анализа литературных данных, пролиферативная активность структур кожи в группах контроля имеет наивысшие показатели в возрасте от 12 до 25 лет. При этом значения количества клеток, вступивших в митоз, в эпидермисе выше, чем в дерме. Это является отражением того, что скорость обновления кератиноцитов выше, чем стромальных клеток дермы.
Характеристика иммуноцитов в процессе репаративной регенерации кожи человека
В наших наблюдениях, как и по результатам авторов других исследований, обычными местами возникновения келоидных рубцов являются области грудной клетки, мочек и ушных раковин, кожи лица, значительно реже поверхность суставов. Классически келоидные рубцы в своем развитии проходят каскад сложных, динамических и перекрывающихся процессов, состоящих из воспалительных, пролиферативных и ремоделирующих реакций [12].
Стадия эпителизации начинается после получения травмы, поврежденный участок затягивается тонкой эпителиальной пленкой, которая в течение 7–10 дней уплотняется, грубеет, приобретает бледную окраску и остается в таком виде 2–2,5 недели.
На стадии набухания рубец увеличивается, возвышается над прилегающими кожными покровами, становится болезненным. В продолжение 3–4 недель болезненные ощущения ослабевают, а рубец приобретает более интенсивную красноватую окраску с цианотичным оттенком.
Стадия уплотнения. Происходит уплотнение рубца, в отдельных его местах возникают плотные бляшки, поверхность становится бугристой. Внешняя картина рубца представляет келоид, который характеризуется ростом рубцовой ткани за пределы крав поврежднного участка кожи. На стадии ремоделирования рубец окончательно приобретает келоидный характер. Он отличается бледной окраской, мягкостью, подвижностью и безболезненностью, а его регрессия может длиться на протяжении многих лет [3].
В фазу эпителизации происходит восстановление кожного покрова с формированием рубца, окончательное заживление раны. Клеточные популяции келоидных рубцов представлены многочисленными фибробластами, среди которых значительно содержание атипичных гигантских фибробластов, снижено количество плазматических клеток и лимфоцитов. Отмечается склонность фибробластов к симпластообразованию. В зоне повреждения и подлежащей верхним слоям соединительной ткани появляются клетки, отвечающие за реструктуризацию кожного покрова. Мониторинг показал, что на этом этапе идентифицируются CD8 и CD163 макрофаги, фибробласты, тучные клетки (Рисунок 28, указаны стрелками).
Поскольку в третьей фазе следует обеспечить максимальную защиту раны кожи от внешних воздействий, чтобы способствовать полноценной регенерации, появляются CD8+–лимфоциты, которые продуцируют те же цитокины, что и CD4+-Тх1 (ФНО-альфа и бета, ИЛ-2,3, гамма-ИФ, ГМ-КСФ). Эти иммуноциты ограничивают иммунный ответ, предотвращая реакции гиперчувствительности ИС и запуск аутоиммунных процессов.
Полученные нами данные являются результатом того, что в острую стадию повреждения структур кожи в результате активации парасимпатической системы происходит расширение концевых артериол и начинается перфузия крови по капиллярному руслу и миграция эффекторных клеток иммунофагоцитарного звена в поврежднную ткань. Но одновременно с этим начинается массивный выход в кровеносное русло продуктов распада некротических тканей из зоны поражения. Это вызывает явления эндотоксикоза, что негативно влияет как на саму сосудистую стенку капилляров и артериол, так и на ее проницаемость. В результате этого количество функционирующих капилляров хоть и выше, чем в стадию альтерации, но тем не менее значительно ниже нормальных значений.
В келоидных рубцах кожи ушных раковин и мочек ушей распределение иммуноцитов находилось в соответствии с полученными данными по ожогам кожи различной локализации и повреждений кожи вследствие хирургических операций, сопровождающихся образованием келоидных рубцов. Нами отмечено, что в келоидных рубцах кожи мочек ушей и ушных раковин отмечаются формирование коллагеново–волокнистого остова и приобретение кератиноцитами эпидермиса веретеновидной формы не только в верхних слоях, но и в базальных, при этом для расположения клеток характерно строго упорядоченное направление параллельными рядами в соответствии с поверхностью эпидермиса. Макрофаги и тучные клетки также располагаются параллельно поверхности эпидермиса и идентифицируются у базальной мембраны, утолщнной до 100 мкм и имеющей на всм протяжении неоднородную структуру (Рисунок 29, 30).
Нами отмечено, что в отличие от репаративной регенерации кожи мочек ушей на гистологических срезах из биоптатов келоидных рубцов ушной раковины прилежащая к эпидермису соединительная ткань организована не так упорядоченно, как в мочках ушей. Направление коллагеновых волокон хаотичное, а кератиноциты утратили тканевую полярность. Регенерация произошла без восстановления формы.
В процессе разрастания келоидных рубцов выявляется большое количество макрофагов и тучных клеток, что может свидетельствовать о том, что эти клетки необходимы не только для фагоцитоза, но и активно участвуют в перестройке и индукции ангиогенеза.
Пролиферативная активность кератиноцитов в коже, покрывающей келоидный рубец низкая, а в дерме, по нашему мнению, за счт активности фибробластов выше, чем в коже с регенерацией, сопровождающейся выполнением функции (Рисунок 31, 32).
Наши исследования позволили установить, что количество клеток в структуре эндотелиоцитов существующих и вновь образующихся сосудов, содержащих рецепторы на белки VEGF, являющиеся активаторами ангиогенеза, в условиях рубцевания увеличивается (Рисунок 33), что связано с повышением физиологических запросов растущей рубцующейся ткани. Известно, что белки VEGF существуют в рамках системы, отвечающей за обеспечение подачи кислорода к тканям на фоне недостаточной циркуляция крови.
Одной из основных функций VEGF является индукция ангиогенеза, образования новых кровеносных сосудов при повреждении, обеспечение коллатерального кровообращения для создания новых сосудов при разрушении имеющихся. Эти факты можно использовать в разработке новых стратегий лечения келоидных рубцов и келоидной болезни через ингибирование тканевого роста выключением адекватного физиологическим запросам новообразованной ткани кровообращения. При этом прогностически более эффективно воздействие на рецепторы VEGF, а не на синтез белка.
В наших исследованиях в растущих келоидных рубцах отмечена высокая достоверность повышения экспрессии CD34, которая идентифицируется как в стенке новообразующихся и растущих сосудов, так и в строме ткани рубца. Рецепторы к VEGF выявляются в фибробластах, что свидетельствует о том, что клетки, продуцирующие коллаген, могут быть мишенями для подавления синтетической функции ингибиторами факторов роста эндотелия, синтезируемого макрофагами и лимфоцитами. VEGF регулирует практически все функции клеток эндотелия, необходимые для формирования капилляров: миграцию, пролиферацию, дифференцировку и выживание эндотелиальных клеток, поэтому может представлять собой один из ключевых факторов в разработке клеточных технологий в лечении келоидной болезни.
По нашим данным, количество капилляров в келоидных рубцах выше, чем в здоровой коже, а также при формировании гипертрофических рубцов, относительное уменьшение общей площади сосудистого русла может быть связано с отком, инфильтрацией лейкоцитами воспалнной ткани.
Учитывая тот факт, что белок р53 активируется при повреждении генома клеток, запуская апоптоз, отсутствие экспрессии этого белка в материале пациентов с формированием келоидных рубцов после повреждений кожи свидетельствует о том, что истинные келоидные рубцы имеют общие признаки с опухолевыми процессами, при которых экспрессировано 50% р53.
Известно, что ген р63 необходим для комитирования стволовых клеток эпидермиса в эмбриональном развитии. Одновременно р63 обеспечивает реализацию множества функций, которые необходимы для самоподдержания эпидермальных стволовых клеток дефинитивного эпидермиса. Экспрессия р63 обеспечивает адгезию кератиноцитов и ингибирование апоптоза, а также сохранение целостности эпидермиса как ткани. В наших исследованиях в ткани рубца отмечается высокая экспрессия белка р63. Положительная реакция идентифицирована не только в базальном слое эпидермиса, но и все ряды кератиноцитов шиповатого слоя экспрессируют этот белок (Рисунок 34).