Введение к работе
Актуальность проблемы. Вопрос о нейрональной основе поведения является одним из главных в современной нейробиологии. В последние годы возрос интерес к изучению свойств нейронных сетей и синапсов, а также связи между их функцией и простыми формами поведения.
ЦНС моллюсков имеет малую численность нейронов, многие из которых неизменно участвуют в выполнении строго определенных функций. Ввиду этого морфо-функциональные соответствия между структурой нервной системы и поведением выражено у этих животных в высшей степени. Принципы строения нервных сетей в нервных системах беспозвоночных и позвоночных во многом сходны. Поэтому изучение нервной системы двустворок поможет понять пути по которым шло формирование нервных систем высокоорганизованных животных. Особое значение имеют нейрохимические исследования, которые позволят выявить морфологический субстрат интеграции нервной системы и значение отдельных её клеточных популяций для осуществления различного рода врождённых поведенческих актов. Кроме того, нервная система морских беспозвоночных, двустворчатых моллюсков в частности, секретирует гормоны, которые, как показали экспериментальные исследования, способны стимулировать некоторые функции организма млекопитающих. Поэтому органы нервной системы этих животных могут стать источником биологически активных веществ. Это вероятно, петому что двустворчатые моллюски становятся объектом управляемой хозяйственной деятельности человека. Между тем, в современной литературе должного внимания нервной системе этих животных не уделяется (Мотавкин, Ва-раксин, IS63; Motavkine , Varaksine , 1969; Мотавкин с соавт.,
- A -
1990).
Цель и задачи исследования. Изучить общие закономерное и особенности организации ЦНС у некоторых видов двустворчаты моллюсков с различным образом жизни.
В работе решались следующие задачи:
-
В сравнительном плане изучить анатомию ЦНС нескольки: видов двустворчатых моллюсков.
-
Морфологическими и морфометрическими методами исследс клеточный состав ганглиев.
-
Дать гистохимическую и ультраструктурную характерней основных типов нейронов - пептидергических, холинергических V аминергических.
Научная новизна. Впервые представлена гистохимическая, м
фологическая и ультраструктурная характеристика ЦНС 5 видов
двустворчатых моллюсков. Установлены видовые различия в топог
фии и строении нервных узлов и нервов в зависимости от образа
жизни. Показано, что у моллюсков обладающих большей подвижное
увеличивается общее количество нейронов на единицу веса и воз'
растает число крупных клеток. Выделено 5 типов пептидергическі
нейронов, различающихся цитохимической и ультраструктурной орі
низацией и морфологией секреторных гранул. Идентифицированы и
дана ультраструктурная характеристика 4 типам аминергических
нейронов. Определён количественный и качественный состав биоге
ных аминов. Проведена диагностика нейронов холинергической сиь
тической передачи на световом п электронно-микроскопическом урс
Теоретическая и практическая значимость. Полученные резу
таты исследования дополняют и детализируют существующие предст
ления по гистофизиологии ЦНС двустворчатых моллюсков. В частно
ти вносят определённый вклад в развитие представлений о законах формирования нервных связей и является основой для составле' ния химической карты ЦНС двустворчатых моллюсков по медиагорным свойствам нейронов. Анатомические исследования нервной системы разных видов моллюсков представляют интерес в сравнительном и эволюционном плане. Они дополняют сведения о нервной системе низкоорганизованных животных и могут найти применение при рас- смотрении вопросов систематики и филогении. Полученные нами данные по цитохимической и ультраструктурной диагностике холи-нергических, моноаминергических и пептидергических нейронов и их количественному составу могут быть приняты во внимание при диагностике их в других нервных системах.
Апробация диссертационной работы. Материалы изложены и обсуждены на заседаниях Приморского отделения ВНО АГЭ (Владивосток, 1968, I9S9, 1990), на конференции молодых учёных ВШИ (Владивосток, 1990).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы.
Объём и структура диссертации: диссертация состоит из вве-"дения, обзора литературы, двух глав собственных данных, обсуждения, выводов, указателя литературы, приложения. Работа содержит 160 страниц машинописного текста, 8 таблиц, 55 рисунков. Указатель литературы включает 33 отечественных и 157 зарубежных источников. Диссертация изложена на русском языке.
Изучали ЦНС 5 видов двустворчатых моллюсков из трёх отрядов (анадару Броутона - Anadara broughtoni , глицемериса Приморского - Glycyraeris yessoensis , мерценарию Стимпсона - Hercenaria
- б -
stinpsoni , мактру полосатую - Mactra sulcatoria , гребеші Свифта - Pecten swifti . Половозрелых животных собирали в ливе Петра Великого (Японское море) в течение 1937-1990 гг. Для исследования использовали особей женского пола в перио; гаметогенеза, в связи с чем параллельно изучались гонады эт животных. В работе использовано 887 моллюсков.
Топография узлов, комиссур, коннектив и нервов изучала
. методом препарирования нефиксированных животных под бинокул
МБС-І, в отдельных случаях с докраской нервной ткани метиле
Для светооптических исследований узлы и кусочки гонады фиксировали А% формалином, спирт-уксусной кислотой (3:1) и . ном. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали по Нисслга : железный гематоксилином по Гейденгайну. Абсолютное количест: клеток каждого ганглия подсчитывали на серийных срезах толщ 15 мкм в узлах, иыпрегнированных по Кахалю. Количественные ; ные обрабатывали статистически согласно рекомендациям (Блині Глезер, 1964; Автандилов, 1990). Разницу между средними ари] тическими считали достоверной при Р<0,05. Размеры клеток ог деляли с помощью окуляр-микрометра.
Для решения поставленных задач в работе использован кої. леке гистохимических,электронно-микроскопических, биохимичес и экспериментальных методов исследования. I. Гистохимические методы:
а) Для выявления мукополисахаридов использовали ШИК pea цию по методике Мак-1ануса (Луппа, I960). Для дифференцировк углеводов делали контрольные исследования с ^- амилазой и фильтрованной слюной.
б) Для определения липидов срезы окрашивали Суданом чёрным
В по Лизону (I960).
в) Для выявления моноаминергических нейронов использовали
флуоресцентно-гистохимические методы Фалька (1962) и Фурнесс и
Коста (1975). При изучении нервных ганглиев методом Фалька крио^
статные срезы выдерживали в парах параформа при температуре
80С, при исследовании методом Фурнесс и Коста, исследуемые
образцы обрабатывали 2% раствором глиоксиловой кислоты на 0,Ш
какодилатном буфере в течение 30 минут при комнатной температу
ре. РН глиоксиловой кислоты подбирали экспериментально, уста
новлено, что наиболее полное выявление аминергических нейронов
моллюсков достигается'при рН 6,8. Реакцию конденсации проводили
при температуре І00С в течение 4 мин. Препараты изучали под
люминесцентным микроскопом МЛ-2, используя светофильтры ФС-І и
СЭС-7.
г) Для определения локализации ацетилхолинэстеразы (АХЭ) применяли метод Карновского и Руте в модификации Куглера (1937). Отпрепарированные ганглии помещали в I мл инкубационной среды с ацетилхолиниодидом на 30 минут при 20С. Неспецифическуга холинэстеразу ингибировали диизопропилфторфосфатом (ДФФ) в концентрации ІхІОчЛ. Суммарную активность холинэстераз подавляли раствором эзерина в концентрации 5xI0~4iL
д) Для выявления холинацетилтрансферазы (ХАТ) использовали метод Берта (1973). Ганглии фиксировали в течение 2ч в 1% растворе формальдегида на 0,1М какодилатном буфере (рН 5,2) с 0,32 М сахарозой. Затем I сутки промывали при температуре 4С в какодилатном буфере. Изготовленные в криостате срезы толщиной
- О -
15 мкм помещали в прединкубационную среду с ДФФ на Г ч при 4 С Инкубацию проводили при 20С в течение 2,5 ч.- Для проверки спє цифичности реакции проводили контрольные опыты: В I опыте из инкубационной среды исключали ДФФ - ингибитор неспецифических ферментов. Во 2 опыте в инкубационную среду не вводили ацетил -КоА. В третьем опыте в среду не вводили холинхлорид. В 4 опыт в среду вводили специфический ингибитор активности ХАТ -хлор-ацетилхолинперхлорат.
е) Нейросекреторный материал выявляли паральдегидфуксином по Гомори-Габу.
2. Электронно-микроскопические методы. Для ультраструктури исследований фиксацию материала прогодили 2,Ь% глютаральдегидрі на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2), дофиксацию проводили в
После промывки и обезвоживания материал заливали в эп( или эпон-аралдит. Срезы изготавливали на ультрамикротоме ЬКВ-^ Срезы контрастировали 2% уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу (1963). Изучение и фотографирование материала проводили под электронным микроскопом JEM-I00B. Для ориентации в пс лученных блоках и изучения микроанатомии выбранных участков hcj ных узлов использовали срезы толщиной 0,8-1 мкм, окрашенные по методу Логинова (1967).
3.Электронно-гистохимические методы. а) Для выявления норадреналина использовали хромафинную реакцию по Буду и Барнетту (1964), кусочки нервной ткани инкуби ровали в среде, содержащей бихромат калия, в течение 24 ч. Зате обезвоживали и заливали в аралдит. Срезы контрастировали цитратом свинца. Изучение и фотографирование материала проводили на электронном микроскопе jEM-IOOB.
б) ХАТ выявляли методом Берта (1973). Послеинкубации мате
риал промывали и дофиксировали 1% 0S0^ (рН 6,0). После обезво
живания образцы заливали в эпон. Приготовленные на ультрамикро
томе срезы контрастировали цитратом свинца и фотографировали в
электронном микроскопе.
в) АХЭ выявляли по Карновскому и Рутсу в модификации Кугле-
ра (1937). После инкубации в среде, содержащей ацетилтиохолин-
иодид, материал дофиксировали 1% OsCb. Затем обезвоживали и зали
вали в смесь эпон-аралдита. Контрастированные цитратом свинца
»
срезы просматривали и фотографировали в электронном микроскопе. 4. Биохимические методы.
Биохимическими методами определяли количество дофамина, се-ротонина, триптамина и норадреналина в ганглиях (Манухин с соавт. 1975). Определение моноаминов проводили по флуоресценции продуктов конденсации и измеряли на флуоресцентном спектрофотометре фирмы "Хитачи" (Япония). Все этапы обработки проводили при значении рН 7,0, что способствует более полному сохранению аминов. Расчёты количества каждого моноамина производили вмкг.на I г нервной ткани.
5. Экспериментальные исследования.
а) При изучении биогенных моноаминов использовали рауседил,
оказывавший опустошающее действие на депо биогенных аминов. Пре
парат вводили в течение 5 дней инъекциями по 5 мл, содержащими
0,1 мг/мл. Для изучения реакции моноаминергических нейронов ку
сочки нервной ткани фиксировали для электронно-микроскопических
исследований через 12, 24 и 48 часов после последней инъекции.
б) Для дифйеренцировки индолалкиламинов использовали 5,7-
дигидрокситриптамин. Препарат вводили в дозе 0,5 мл, содержащей
0,05 мг/мл. Материал для электронно-микроскопического исследов; ния брали через 12, 24 и 48 часов после введения этого вещесті в) Для идентификации пуринергических структур иcпoльзoвaJ дипиридамол, ингибирующий захват пуринергическими нейронами аденозина, необходимого для синтеза АТФ. Препарат вводили в дс 100 мг/кг. Материал фиксировали через 6 часов после введения дипиридамола.