Функциональная морфология мукоцилиарной транспортной системы трахеи крыс в постнатальном онтогенезе Есев Леонид Иванович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Структура и функция мукоцилиарного аппарата трахеи в различные возрастные периоды (обзор литературы)

2.1. Понятие, структурные компоненты 11

2.2. Эпителиальная выстилка

2.2.1. Клеточный состав зрелого эпителиального пласта 12

2.2.2. Гистогенез, возрастные изменения 19

2.3. Подслизистые железы 22

2.2.1. Структура, локализация 22

2.2.2. Гистогенез, возрастные изменения 24

2.4. Механизмы поддержания тканевого гомеостаза в зрелом эпителиальном пласте 26

2.4.1. Размножение и дифференцировка клеток 26

2.4.2. Элиминация клеток из пласта 29

2.5. Мукоцилиарный транспорт 32

2.5.1. Методические подходы к изучению

функции мукоцилиарного аппарата 32

2.5.2. Возрастные и региональные особенности 37

2.6. Заключение 41

Глава 2. Материал и методы исследования

Глава 3. Гистофизиология мукоцилиарной транспортной системы трахеи крыс в постнатальном развитии

4.1. Микроскопическое строение 54

4.1.1. Эпителиальная выстилка 54

4.1.2. Подслизистые железы 55

4.2. Количественные характеристики респираторного эпителия 55

4.2.1. Реснитчатые клетки 55

4.2.2. Бокаловидные клетки 66

4.2.3. Базальные и промежуточные клетки 66

4.3. Количественные параметры мукоцилиарного клиренса 33

4.3.1. Скорость движения слизи 44

4.3.2. Средняя площадь эпителиальной выстилки

4.3.3. Среднее время обновления слизи 44

4.4. Прижизненные наблюдения процессов элиминации клеток из эпителиального пласта

4.5. Объективная периодизация процессов 44

Глава 4. Обсуждение результатов исследования 84

Выводы 94

Практические рекомендации 96

Список литературы

• Клеточный состав зрелого эпителиального пласта
• Механизмы поддержания тканевого гомеостаза в зрелом эпителиальном пласте
• Возрастные и региональные особенности
• Количественные характеристики респираторного эпителия

Введение к работе

Актуальность проблемы Выбор темы настоящей работы связан с

необходимостью углубленного изучения клеточных основ развития респираторного эпителия - сложной тканевой системы, играющей ключевую роль в реализации защитных функций слизистой оболочки воздухоносных путей (Шубникова Е.А.,2011). В основе мукоцилиарного транспорта лежит эффективная работа реснитчатого аппарата мерцательных клеток, погруженного в жидкий перицилиар-ный слой и перемещающего за счет биения ресничек более вязкий поверхностный слой слизи, между этими слоями расположен тонкий слой сурфактанта (Рихель-манн Г., Лопатин А.С,1994; Захарова Г.П. с соавт., 2010; Завалий М.А., 2014 а, б). Основными источниками слизи являются бокаловидные экзокриноциты и подсли-зистые железы (Puchelle E.,1981; Пискунов С.З., 2001;). Мерцательные и секреторные элементы формируют мукоцилиарную транспортную систему (мукоцилиар-ный аппарат) воздухоносных путей (Umeke S., Vanabe T.,1992; , 2002; Кобылянский В. В., 2008; Захарова Г.П. с соавт., 2010).

В литературе имеются исследования, посвященные возрастным особенностям микроскопической структуры ,1983; et al.,1986; Carson J.L. et al.,1999) и транспортной функции et al.,1991; et al.,1992; Joki S., ,1997; Francis R.J. et al.,2009; Bailey K.L. et al.,2014) эпителиальной выстилки трахеи. Однако, большинство исследований захватывают лишь отдельные возрастные периоды с использованием не всегда сопоставимого набора методических подходов к исследованию мукоцили-арного транспорта, отсутствуют работы по комплексному изучению количественной динамики структурных и функциональных показателей эпителиального пласта на протяжении всего постнатального развития организма.

В обеспечении структурной и функциональной целостности эпителиального

пласта, наряду с пролиферацией и дифференцировкой клеток, существенную роль

играют процессы элиминации эпителиоцитов; сбалансированность этих процессов

обеспечивается сложным комплексом внутритканевых регуляторных механизмов

(Eisenhoffer G.T., Rosenblatt J.,2013). Показано, что физиологическая убыль эпите-3

лиоцитов реализуется не только через механизмы апоптоза (Rosenblatt J. et al.,2001), из пласта элиминируются и морфологически жизнеспособные (без инициации гибели) элементы (Eisenhoffer G.T. et al.,2012; Marinari E., Mechotic A., Curran S. et al.,2012). Применительно к эпителиальной выстилке воздухоносных путей показана важная роль апоптоза, как механизма элиминации поврежденных клеток в норме и при развитии патологических процессов (Tesfaigzi Y.,2006); однако сведения о возможности элиминации из пласта жизнеспособных эпителиоци-тов в литературе отсутствуют.

Большинство предложенных различными авторами методик по изучению мукоцилиарного транспорта разработаны для целей клинической диагностики (Jorissen M. et al.,2000; Шабалин В.В.,2002; Trindade S.H. et al.,2007; Ostrowski L.E. et al.,2011). Вопросы адаптации данных методик к экспериментальным исследованиям на лабораторных животных в литературе освещены менее подробно (Марков Г.И., 1976, 1996; , 1998; et al., 2009). Поэтому выбор эффективного и информативного алгоритма исследования структурных и функциональных параметров эпителиальной выстилки воздухоносных путей у экспериментальных животных с использованием современной цифровой техники и программного обеспечения остаётся актуальной задачей, требующей своего решения (Алексеев Д.С., Попечителев Е.П., 2012).

Цель исследования - определение возрастных закономерностей развития мукоцилиарной транспортной системы трахеи крыс на основании проведения комплексного морфологического и функционального анализа основных ее структурных компонентов.

Задачи исследования:

1. Разработка оптимального алгоритма функционального и морфологического

изучения мукоцилиарного аппарата трахеи (регистрация скорости движения слизи in vivo и двигательной активности цилиарного аппарата in vitro в сочетании с гистологическим исследованием структуры органа).

1. Морфологический и морфометрический анализ структуры эпителиальной выстилки и желез трахеи на протяжении постнатального развития животных.

2. Количественный анализ возрастной динамики показателей мукоцилиарной транспортной системы.

3. Прижизненный анализ феномена экструзии клеток респираторного эпителия трахеи с целью выделения фаз процесса и последующей регистрации их морфологических эквивалентов на гистологических препаратах.

4. Установление корреляционных связей между структурой двигательного и секреторного компонентов мукоцилиарного аппарата и параметрами цилиарного транспорта в постнатальном онтогенезе.

5. Объективная периодизация процессов постнатального развития мукоцили-арного аппарата трахеи.

Научная новизна Впервые в рамках целостного исследования получены

оригинальные количественные данные о структурной организации и функциональной активности мукоцилиарной транспортной системы трахеи в динамике постнатального развития крыс.

В результате прижизненных наблюдений впервые продемонстрирован феномен экструзии эпителиоцитов из пласта in vivo, на основании чего определены критерии регистрации элиминируемых клеток на гистологических срезах. Показано, что экструзии подвергаются не только гибнущие клетки, но и морфологически жизнеспособные элементы.

На основе математического анализа комплекса количественных параметров впервые объективно установлены границы основных этапов постнатального развития мукоцилиарного аппарата и построена модель онтогенетического роста эпителиальной выстилки трахеи.

Теоретическая и практическая значимость работы В результате проведенного исследования сформулирован ряд положений, расширяющих и конкретизирующих современные представления об онтогенетических закономерностях структурной и функциональной дифференцировки компонентов мукоцилиарного

аппарата трахеи и механизмах поддержания внутритканевого гомеостаза.

Предложенный алгоритм функционального и морфологического изучения мукоцилиарного аппарата трахеи может быть использован как тест-система для выявления влияния на организм факторов разной природы (техногенные загрязнения, оценка эффекта лекарственных препаратов и пр.). Результаты прижизненного исследования респираторного эпителия (включая оригинальные видеофайлы) могут быть использованы в учебном процессе при изложении соответствующих разделов общей и частной гистологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Формирование мукоцилиарного аппарата трахеи на ранних этапах постна-тального развития происходит асинхронно: дифференцировка системы мерцательных эпителиоцитов опережает по времени развитие системы секреторных элементов (бокаловидных клеток и подслизистых желез).

2. Возрастные перестройки реснитчатых клеток и секреторных структур трахеи в сформировавшемся эпителиальном пласте направлены на обеспечение стабильного уровня мукоцилиарного транспорта на протяжении жизни организма.

3. Экструзия из пласта гибнущих и жизнеспособных клеток является постоянным феноменом в дифференцированной эпителиальной выстилке трахеи.

4. При старении поддержание высокого уровня структурной и функциональной организации мукоцилиарного аппарата трахеи происходит за счет снижения компенсаторных резервов эпителиального пласта.

Степень достоверности и апробация результатов Достоверность и обоснованность результатов и выводов диссертации работы подтверждается их репрезентативностью за счет изучения гистологических препаратов и видеофайлов прижизненной съемки от достаточного количества экспериментальных животных разных возрастных групп (125), а также проведением морфометрических и количественных видеомикроскопических исследований с использованием адекватных методов статистического анализа.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на различных

научных конференциях: Съезде анатомов, гистологов и эмбриологов России (г.

Саратов, 2009 г.); X конгрессе международной ассоциации морфологов (г. Яро-6

славль, 2010 г.); Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвящённой 65-летию СНО ЯГМА (г. Ярославль, 2011г.); Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященной 70-летию профессора А.А.Чумакова (г. Ярославль, 2012г.); XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (г. Самара, 2012 г.); Объединенном XII конгресс Международной ассоциации морфологов и VII съезд Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов (г. Тюмень, 2014 г.). Апробация диссертации проведена на расширенном заседании кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Ярославский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации 24.03.2016 г.

Личный вклад автора Эксперименты по разработке и реализации алго-

ритма структурно-функционального анализа мукоцилиарной транспортной системы, гистологическое исследование с последующим морфометрическим анализом, а также статистическая обработка и обобщение полученных результатов на основании проведенного анализа литературы по теме диссертационного исследования выполнены лично автором.

Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий по темам "Эпителиальные ткани" и «Система органов дыхания» на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии Смоленского, Воронежского и Тверского государственных медицинских университетов.

Разработанный комплексный алгоритм морфофункционального анализа му-коцилиарного аппарата трахеи крыс поддержан Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса (УМНИК)» (грант №4041, 2011 г.) и успешно апробирован в Институте биологии Коми НЦ Уральского отделения РАН при проведении исследования влияния эффектов хронического низкоинтенсивного гамма-излучения на мерцательную активность эпителиальной вы-7

стилки трахеи (Ермакова О.В. с соавт., 2014; работа поддержана проектом конкурсных программ научных исследований УрО РАН №12-У-4-1015).

Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 7 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ (3 статьи и 4 тезиса).

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 110 страни-

Клеточный состав зрелого эпителиального пласта

На основе математического анализа комплекса количественных параметров объективно установлены границы основных этапов постнатального развития мукоцилиарного аппарата и построена модель онтогенетического роста эпителиальной выстилки трахеи. Научно-практическое значение В результате проведенного исследования сформулирован ряд положений, расширяющих современные представления об онтогенетических закономерностях структурной и функциональной дифференцировки респираторного эпителия трахеи и механизмах поддержания внутритканевого гомеостаза. Впервые разработан и апробирован прямой метод изучения скорости движения слизи у мелких лабораторных животных в опытах in vivo. Предложенный комплексный алгоритм функционального и морфологического изучения мукоцилиарного аппарата трахеи может быть использован как тест-система для выявления влияния на организм факторов разной природы (техногенные загрязнения, оценка эффекта лекарственных препаратов и пр.). В рамках проведения подобных исследований полученные средние значения мукоцилиарного клиренса (двигательная активность цилиарного аппарата и скорость движения слизи) могут быть использованы в качестве возрастной нормы.

Результаты исследования респираторного эпителия на разных стадиях постнатального развития (включая оригинальные видеофайлы) могут быть использованы в учебном процессе при изложении соответствующих разделов общей и частной гистологии. Положения, выносимые на защиту 1. Формирование мукоцилиарного аппарата трахеи на ранних этапах постнатального развития происходит асинхронно: дифференцировка системы мерцательных эпителиоцитов опережает по времени развитие системы секреторных элементов (бокаловидных клеток и подслизистых желез). 2. Возрастные перестройки реснитчатых эпителиоцитов и секреторных структур трахеи в сформировавшемся эпителиальном пласте направлены на обеспечение стабильного уровня мукоцилиарного транспорта на протяжении всей жизни организма. 3. Экструзия из пласта гибнущих и жизнеспособных клеток является постоянным феноменом, наблюдаемым в дифференцированной эпителиальной выстилке трахеи. 4. Поддержание высокого уровня структурной и функциональной организации мукоцилиарного аппарата трахеи при старении происходит за счет снижения компенсаторных резервов эпителиального пласта. Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность и обоснованность результатов и выводов диссертации работы подтверждается их репрезентативностью за счет изучения гистологических препаратов и видеофайлов прижизненной съемки от достаточного количества экспериментальных животных разных возрастных групп (125), а также проведением морфометрических и количественных видеомикроскопических исследований с использованием адекватных методов статистического анализа.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VI Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов, 2009 г.), X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010 г.), Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященной 70-летию профессора А.А.Чумакова (Ярославль, 2012 г.), Объединенном XII Конгрессе Международной ассоциации морфологов и VII Съезде Российского научного медицинского общества анатомов, гистологов и эмбриологов (Тюмень, 2014 г.).

Личный вклад автора Эксперименты по разработке и реализации алгоритма структурно-функционального анализа мукоцилиарной транспортной системы, гистологическое исследование с последующим морфометрическим анализом, а также статистическая обработка и обобщение полученных результатов на основании проведенного анализа литературы по теме диссертационного исследования выполнены лично автором. Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий по темам "Эпителиальные ткани" и «Система органов дыхания» на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии Смоленского, Воронежского и Тверского государственных медицинских университетов.

Разработанный комплексный алгоритм морфофункционального анализа мукоцилиарного аппарата трахеи крыс поддержан Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса (УМНИК)» (грант №4041, 2011 г.) и успешно апробирован в Институте биологии Коми НЦ Уральского отделения РАН при проведении исследования влияния эффектов хронического низкоинтенсивного гамма-излучения на мерцательную активность эпителиальной выстилки трахеи (Ермакова О.В. с соавт., 2014; работа поддержана проектом конкурсных программ научных исследований УрО РАН №12-У-4-1015). Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, включающего 136 источников, в том числе 89 работ зарубежных авторов. Диссертация содержит 4 таблицы, 22 диаграммы и схемы, 44 микрофотографии, 4 макрофотографии и 16 фотографий фреймов видеофайлов.

Механизмы поддержания тканевого гомеостаза в зрелом эпителиальном пласте

У крупных лабораторных животных (собаки) используются используемые в клинических исследованиях прижизненные методики изучения перемещения инертных маркеров, регистрируемые через бронхоскоп (King M., 1998). Для исследования транспортной функции мерцательного эпителия слизистой оболочки полости носа in vivo Г.И. Марковым с соавт. (1996) предложена методика, основанная на определении времени перемещения со слизью частиц древесного угля от полости носа до глотки у ненаркотизированных кроликов.

При использовании мелких животных мукоцилиарный клиренс определяется в опытах in vitro. Наиболее апробированной моделью изучения влияния различных факторов на МЦТ является исследование скорости перемещения частиц поверхностного слоя на изолированном участке неба лягушки, культивируемого при температуре 4-6о С (Марков Г.И., 1976; Festa E. et al., 1997). У теплокровных животных движение слизи возможно зарегистрировать при микроскопии культивируемых вне организма фрагментов трахеи быков и лошадей (Wills P.J. et al., 1995; Gerber V. et al., 1997). Для определения скорости движения слизи в изолированных участках трахеи мышей R.J. Fransis et al., (2009) использован видеомикроскопческий анализ динамики перемещения флюоресцентных микросфер диаметром 0, 2 мкм, помещенных на поверхность слизистой. Наряду с вышеописанными подходами, для визуализации перемещения слизи в последние годы апробируются методы конфокальной и оптической когерентной микроскопии (Huang B.K., Choma M.A., 2015). в). Изучение двигательной активности цилиарного аппарата

Производится в опытах in vitro и по технике в минимальной степени отличается от подходов, разработанных для клинической практики. В эксперименте открывается возможность брать не только соскобы эпителия (как у человека), но и целые фрагменты воздухоносных путей на разных уровнях, что существенно повышает репрезентативность результатов. Биоптаты помещаются в физиологический раствор или питательную среду и кратковременно культивируются в контролируемых условиях (температура, влажность, рН), в этот период производится регистрация физиологических параметров мерцательной активности эпителиоцитов (Kawakami M. et al., 2004; Раков А.Л. и соавт., 2000; Захарова Г.П. с соавт., 2010). Для расчета величин ДАЦА используются методы фотоосциллоскопии и видеомикроскопии. Фотоосциллоскопические методы основаны на том, что синусоидальные колебания поверхности слоя слизи, возникающие в результате биения ресничек и проявляющиеся изменениями интенсивности отражения света, направленного на поверхность слизистой оболочки, регистрируются фотодетектором (или телекамерой), полученные сигналы преобразуются в изображение на экране, осциллограммы калькулируются методом спектрального анализа. Впервые данная методика, предложенная T. Dalhamn & R. Rylander (1962), впоследствии модифицирована J. Yager et al., (1980) и S. Joki, V. Saano (1995). Существенным недостатком данного подхода является недостаточно высокая чувствительность, не позволяющая верифицировать тонкие изменения параметров в норме и патологии (Кобылянский В.И., 2008).

Последующее развитие техники визуализации и компьютерного анализа изображений позволило разработать прямые методы изучения ДАЦА на основе метода ускоренной видеосъемки (Riechelmann H. et al., 1995). В качестве примера использования такого подхода можно привести исследование В.В. Шабалина и Г.П. Захаровой (1997). Запись изображения движущихся ресничек осуществлялась на компьютере с частотой кадров 25 кадров/сек. при общем увеличении установки 4500. Во время обработки видеоизображения из первого полного видеокадра выделяли «область интереса» с работающими ресничками, и последующая обработка по всем кадрам выполнялась только в рамках этой области. Весь видеофайл разрезали на отдельные кадры, включающие только эту «область интересов»; обработка видеозаписей проводилась в режиме ручных измерений, в результате чего в разные моменты времени фиксировались положения отдельных ресничек. При достаточной информативности и точности данный метод оказался достаточно трудоемким. Усовершенствованный подход на основе метода ускоренной видеосъемки с применением высокоскоростной цифровой камеры (до 200 кадров в секунду) использован при изучении изолированной трахеи неонатальных мышей (Fransis R.J. et al., 2009) и новорожденных свиней (Hoegger M.J. et al., 2013). Расчет ЧБР производился на основании оценки числа фреймов, захватывающих полный цикл биения реснички и продолжительности одного фрейма.

В последнее десятилетие для измерений ДАЦА в ринологической практике разработаны программно-аппаратные комплексы на основе использования высокоскоростных (до 100 кадров в секунду) аналоговых или цифровых видеокамер, сопряженных с микроскопом и соответствующего программного обеспечения (Алексеев Д.С. с соавт., 2005) . Качественно новые результаты дало внедрение методов компьютерного спектрального анализа цифровых видеофайлов на основе одномерного временного преобразования Фурье (Алексеев Д.С., Попечителев Е.П., 2012). Полученные подходы успешно апробированы в ринологических исследованиях (Козлов В.С. с соавт., 2005; Крамной А.И., 2008) и являются весьма перспективными при проведении экспериментальных исследований.

Возрастные и региональные особенности

У новорожденных животных подслизистые железы на всем протяжении трахеи отсутствуют, однако встречаются участки скопления мелких уплощенных эпителиоцитов в базальной части пласта – по всей вероятности, это места формирования почек врастания эпителия в слизистую оболочку (рис.10, а). На 4-5 день можно обнаружить тяжи эпителиоцитов, врастающие в подлежащую соединительную ткань (рис.10, б). Через 7-10 день после рождения в подслизистой основе появляются простые трубчатые разветвленные эпителиальные структуры, к 14 дню формируется система четко выраженных выводных протоков и секреторных отделов (рис.11, в, д), число последних существенно возрастает к концу 1 месяца постнатального развития (рис.13, а). В составе развивающихся железистых структур регулярно встречаются митотически делящиеся клетки (рис.11, в); ШИК-позитивная реакция обнаруживается как в виде диффузной мелкой зернистости в цитоплазме части секреторных клеток, так и в их надъядерной зоне (рис.11, г).

Вышеописанные процессы наиболее выражены в участках между хрящевыми кольцами в краниальных отделах трахеи (особенно в области верхних колец, прилежащих к гортани) и в меньшей степени – в каудальных отделах органа. Скопления желез локализованы, как правило, в вентральных участках (рис.12, а, б), гораздо реже железистые структуры в небольшом объеме можно обнаружить в дорсальных участках органа (рис.12, б, в).

Начиная с 1 месяца формируется дефинитивная структура желез, их концевые отделы представлены более сложными ветвящимися трубчатыми и альвеолярными структурами, состоящими из преимущественно из серозных и в гораздо меньшей степени – из слизистых секреторных клеток (рис.13, а, б). У животных в возрасте 2-3 месяца цитоплазма железистых клеток и содержимое просвета секреторных отделов и выводных протоков интенсивно окрашиваются реактивом Шиффа (Шик-реакция) и альциановым синим, что свидетельствует об их активной секреторной активности (рис.13, в, г). У крыс репродуктивного возраста (6-18 мес.) количество, размеры и сложность ветвления концевых отделов возрастает; в последних сохраняется высокая интенсивность ШИК-реакции в цитоплазме экзокриноцитов (рис.14, а, б, в, г). У старых животных одновременно с сохранением гистохимически активных элементов появляются участки гибели железистых клеток (кариопикноз, зернистый распад цитоплазмы), а также слущенные экзокриноциты в просвете секреторных отделов и выводных протоков (рис.14, д, е).

Прямоугольник и стрелки – участки гибнущих и слущивающихся желензистых клеток. ШИК-реакция (а, б). Об.40, ок.7. 4.2. Количественные характеристики респираторного эпителия

Возрастная динамика количественных структурных и функциональных параметров эпителиальной выстилки трахеи представлена в таблице 3.

На протяжении первого месяца после рождения доля реснитчатых клеток в пласте увеличивается в 2,3 раза по сравнению с новорожденными и достигает 42% (р 0,05); внутри этого периода наиболее интенсивный (2-кратный) рост данного показателя отмечен в течение первых двух недель постнатального развития (рис.15). Начиная с 3 месяца во все последующие сроки содержание мерцательных клеток сохраняется в диапазоне 45-50%, достигая максимума у 12-месячных животных (р 0,05 по сравнению с 1-3 и 18-24 мес). При этом в возрастном интервале 3-12 мес. содержание клеток данного типа в каудальном отделе трахеи в среднем в 1, 1 раза выше, чем в краниальном (р 0,05), в более ранние и поздние периоды различия между отделами статистически недостоверны (p 0,05).

Процентное содержание реснитчатых эпителиоцитов в составе пласта в постнатальном развитии. Данные по отделам трахеи приведены только для сроков, когда между ними имеются статистически значимые различия. По оси абсцисс - возраст животных (мес), Н - новорожденные; по оси ординат - доля клеток (%). 69

С возрастом закономерно именяются и морфометрические характеристики эпителиоцитов (рис.16). По сравнению с новорожденными наиболее выраженный рост высоты реснитчатых клеток (ВРК) и длины ресничек (ДР) отмечен в течение первого месяца – на 64-73% (p 0,05), причем в первые 2 недели рост ДР существенно (1, 28) опережает рост ВК (1,08). Средние значения ВК сохраняется на уровне 1,7 до 3 мес., после чего возрастают до 2,0-2, 1 к 12 и 18 мес., достигая максимальных значений (2, 16) у двухлетних животных (p 0,05 по сравнению с 3 мес.). Пропорционально увеличению высоты клеток, отмечается и рост длины их ресничек (r=+0,96; р 0,05). Данный показатель возрастает с 2,5 мкм у новорожденных до 4,3 мкм к 3 мес. (+72%, р 0,05), после чего стабилизируется на уровне 4,3-4,5 мкм во все последующие возрастные периоды, достигая максимальных значений (1,76-1,8) у стареющих и старых животных. Значимых различий изученных показателей между краниальным и каудальным отделами трахеи не выявлено (p 0,05).

Количественные характеристики респираторного эпителия

По мнению ряда авторов, (Voter K.Z. et al., 1992; Francis R.J. et al., 2009), появление устойчивого мукоцилиарного клиренса возможно только после достижения порогового (не менее 25-30%) уровня содержания реснитчатых клеток в пласте. Наши данные подтверждают такую точку зрения: к моменту появления начала движения слизи по трахее (14 сут.) доля РК достигает 30%. Однако, наряду с количественным ростом популяции РК, не менее важным фактором созревания системы МЦТ в этот период является отчетливо выраженная дифференцировка реснитчатого аппарата: на 30% увеличивается длина ресничек, впервые визуально регистрируется появление классического цикла их движения с выделением возвратной и эффективной фаз. Одновременно происходит закладка и дифференцировка трахеальных желез (Smolich J.J. et al., 1978; данные настоящего исследования), секрета которых (наряду с секреторной активностью недифференцированных промежуточных клеток в составе пласта) становится достаточно для начала стабильного МЦТ транспорта. Однако, несмотря на опережающее по времени структурное и функциональное созревание популяции реснитчатых клеток, эффективность мукоцилиарной транспортной системы к концу первого месяца жизни относительно невысока: для этого срока характерны минимальные значения СДС и максимальное (12, 1 мин,) время обновления слизи в трахее (см. рис.23).

На протяжении 2 месяца после рождения окончательно созревает секреторный компонент мукоцилиарного аппарата: начиная с 30 сут. формируется популяция дифференцированных бокаловидных клеток и стабилизируется их количество в пласте (рис.28, а), формируются и гистохимически дифференцируются подслизистые железы трахеи (Lim M. et al., 1995; Leigh M.W. et al., 1986; данные настоящего исследования). Как следствие этого, эффективность МЦТ резко возрастает: скачкообразно (в 2,5 раза) увеличивается скорость движения слизи, мукоцилиарный клиренс (оцениваемый по времени обновления слизи) возрастает в 3,4 раза.

Расчет коэффициентов корреляции (Пирсона) количественных параметров реснитчатых и бокаловидных клеток в возрастном интервале 0-3 мес. после рождения показало (рис.28, б), что наиболее значимыми факторами для МЦТ в данный временной период являются морфометрические параметры популяции РК (высота клетки – ВРК, длина ресничек – ДР, процентное содержание в пласте - % РК), между ними и величиной СДС выявляется устойчивая прямая зависимость на уровне значений r = +0,7 – 0,8 (p 0,05). В то же время корреляция между частотой бокаловидных клеток (% БК) и СДС не выявляется, что может свидетельствовать об относительно небольшой их степени участия в движении слизи в этот период.

В возрасте 6-12 мес. мукоцилиарный аппарат трахеи достигает структурной и функциональной зрелости. Наиболее активны каудальные участки трахеи: в них содержание реснитчатых клеток и ЧБР оказались в среднем в 1, 1 раза выше по сравнению с краниальными. Исходя из наших данных, существующие в литературе точки зрения о преобладании мерцательной активности в краниальных отделах трахеи или отсутствии региональных различий, основанные на измерении ЧБР непрямыми методами (Kawamata S, Fujita H..1983; Joki S, Saano V., 1994), нуждаются в корректировке.

К концу репродуктивного периода (18 мес.) и у старых (24 мес.) животных количественные параметры реснитчатых клеток превышают соответствующие значения у 12-месячных крыс, возрастает содержание бокаловидных экзокриноцитов, скорость движения слизи достигает максимальных значений. Все это свидетельствует о сохранении при старении высокого уровня структурной и функциональной зрелости эпителиального пласта. В то же время, есть основания говорить о снижении компенсаторных резервов эпителиальной выстилки в данный возрастной период: содержание базальных (камбиальных) элементов уменьшается до минимальных значений, возрастает количество гипертрофированных мерцательных клеток и элементов с морфологическими признаками гибели, нивелируются выявляемые у животных репродуктивного возраста региональные различия между краниальными и каудальными отделами; в подслизистых железах отмечается появление участков деструкции. В пользу такой точки зрения свидетельствуют наблюдения J.C.Ho et al. (2001) о накоплении при старении частоты ультраструктурных дефектов микротрубочек мерцательных ресничек, а также данные А.К.Козловой (1997) о развитии инволютивных изменений в эпителии бронхов пожилых людей (накопление PAS-позитивных гранул в реснитчатых клетках, усиление десквамации эпителиоцитов, увеличение числа бокаловидных клеток, ослабление связи пласта с базальной мембраной). Полученные результаты не совпадают с наблюдениями ряда авторов о снижении при старении скорости МЦТ в трахее мышей, морских свинок и носовой полости человека (Joki S, Saano V., 1997; Ho J.C.et al., 2001; Bailey K.L. et al., 2014). В основе подобных различий, кроме видовых особенностей, могут лежать особенности методических подходов к изучению мерцательной активности, у человека нельзя исключить и влияние на изученные функциональные показатели дополнительной возрастной патологии.

Однако, сохранение высокого уровня структурной и функциональной организации мукоцилиарного аппарата при старении не обеспечивает поддержания мукоцилиарного клиренса на уровне животных репродуктивного возраста: время обновления слизи у старых крыс по сравнению с 12-18-месячными животными увеличивается в среднем на 15% (с 6,3-6,6 до 7,7 мин.). Подобный феномен можно объяснить тем, что у крыс рост массы, линейных размеров тела и органов (BPKJ