Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Костная ткань. Регенерация костной ткани 11
1.2. Скаффолды в инженерии костной ткани 14
1.3. Клеточный подход при получении костных имплантатов в тканевой инженерии 23
1.4. Современные оптические методы доклинического исследования имплантатов 28
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Объекты исследования 35
2.2. Методы и методики исследования 36
2.3. Схемы экспериментов 47
Глава 3. Результаты
3.1. Характеристика скаффолдов 51
3.2. Биологическое тестирование скаффолдов in vitro
3.2.1. Характеристика и трансфекция ММСК кроликов 53
3.2.2. Флуоресцентный имиджинг миграции и пролиферации ММСКurboFP635 на скаффолдах 54
3.2.3. Оценка количества клеток на поверхности скаффолдов по уровню флуоресценции TurboFP635 57
3.2.4. Оценка жизнеспособности клеток на поверхности скаффолдов 61
3.3. Исследование участия подсаженных ММСК в регенерации костной ткани и формировании сосудов в месте дефекта 62
3.3.1. Характеристика ММСК 63
3.3.2. 3D-культивирование клеток на скаффолдах перед имплантацией 64
3.3.3. Флуоресцентный имиджинг клеток на скаффолдах и оценка формирования костной ткани 66
3.3.4. Флуоресцентный имиджинг сосудов в формирующейся костной ткани после имплантации скаффолда с клетками .. 70
3.4. In vivo изучение скорости биодеградации скаффолдов по уровню флуоресцентного сигнала 72
3.4.1. 3D-культивирование клеток на скаффолдах перед имплантацией 72
3.4.2. In vivo оценка скорости биодеградации скаффолдов по их автофлуоресценции 74
3.4.3. Оценка минерализации и морфологический анализ костного регенерата 77
Глава 4. Обсуждение результатов 81
Заключение 88
Выводы 92
Список цитированной литературы .
- Скаффолды в инженерии костной ткани
- Методы и методики исследования
- Флуоресцентный имиджинг миграции и пролиферации ММСКurboFP635 на скаффолдах
- Флуоресцентный имиджинг сосудов в формирующейся костной ткани после имплантации скаффолда с клетками
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Дефекты костных тканей, полученные в результате хирургических вмешательств, механических травм или врожденных аномалий, представляют собой актуальную медицинскую и социальную проблему. Каждый год в мире проводится более 4 000 000 операций по пересадке костной ткани (Danikas et al. 2002). Основной стратегией устранения костных дефектов критического размера на данный момент является аутологичная трансплантация. Однако этот метод имеет ряд значительных недостатков: ограниченный объем доступной аутологичной кости, повреждение донорского участка, инфицирование трансплантата и т.д. (Bhumiratana et al. 2012). Данную проблему пытаются решить с помощью получения индивидуальных имплантатов на основе трехмерных матриц-скаффолдов (“scaffold” – подложка, носитель) из биорезорбируемых полимеров, которые заселяют аутологичными клетками пациента (Oryan et al. 2014). Разные клеточные культуры могут быть потенциально использованы для формирования тканеинженерных конструкций, но одними из наиболее подходящих клеток для восстановления костной ткани признаны мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки ММСК (Qin et al., 2014). Однако перед их широким использованием в клинике нужно получить ответ на несколько спорных вопросов. До сих пор остается неясно, какую роль выполняют подсаженные ММСК и как долго они присутствуют в месте дефекта, а так же влияют ли эти клетки на васкуляризацию имплантата (Villa et al., 2014). Другая проблема тканевой инженерии, возникающая при попытке устранения костных дефектов, представляет собой невозможность оценки биодеградации полимера имплантата в динамике после операции. Это связано с тем, что основные методы оценки основаны на изменении массы скаффолда в биологических средах или его гистологическом анализе (He et al., 2015). В настоящее время в различные биомедицинские исследования активно внедряются методы оптической визуализации (биоимиджинга). Данные методы
позволяют наблюдать миграцию, оценивать пролиферацию групп клеток как на субклеточном уровне, так и на уровне целого организма (Leferink et al, 2016). Предполагается, что технологии оптического биоимиджинга помогут ответить на спорные вопросы в тканевой инженерии.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было исследование особенностей формирования костной ткани в трехмерных условиях при имплантации тканеинженерных конструкций методами оптического биоимиджинга.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Трансфицировать ММСК геном красного флуоресцентного белка TurboFP635 и разработать методику оценки количества клеток на поверхности имплантатов по уровню его флуоресценции.
-
Провести in vitro биологическое тестирование скаффолдов и подобрать оптимальные образцы для экспериментов на лабораторных животных.
-
Исследовать участие подсаженных ММСК в регенерации костной ткани и формировании сосудистого русла в месте дефекта.
-
Разработать методику оценки скорости биодеградации скаффолдов по уровню их автофлуоресцентного сигнала.
Научная новизна работы
Впервые разработана методика оценки количества клеток по флуоресценции TurboFP635 на поверхности скаффолдов.
Впервые с помощью методов оптического биоимиджинга показано, что подсаженные ММСК находятся в имплантатах в течение 3 месяцев и формируют костную ткань и сосуды в месте дефекта.
Впервые разработана in vivo методика оценки скорости биодеградации имплантированных скаффолдов по уровню их автофлуоресцентного сигнала.
Научная новизна работы подтверждается заявкой на патент.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработанная методика оценки количества клеток по флуоресценции на поверхности скаффолдов может быть использована для оптимизации биологического тестирования скаффолдов in vitro и in vivo. Полученные результаты об участии подсаженных клеток в регенерации костной ткани имеют фундаментальное значение и позволяют глубже понять процессы формирования костной ткани в месте дефекта при внедрении имплантатов. Разработанная методика оценки скорости биодеградации имеет практическое значение для доклинического тестирования скаффолдов в тканевой инженерии. Основные результаты работы могут быть использованы для разработки медицинских имплантатов при замещении костных дефектов.
Личное участие автора
Личный вклад автора заключался в анализе данных литературы, планировании и выполнении экспериментов, интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций и представлении результатов на научных конференциях.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на российских и международных конференциях: 5я Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (Троицк, 2014 г. Работа удостоена призового места); 5й Международный конгресс «International Congress on Stem Cells and Tissue Formation» (Дрезден, Германия, 2014 г.); 20я Нижегородская сессия молодых ученых «Естественные науки» (Морозовский, 2015 г. Работа удостоена призового места); Международный симпозиум «Topical problems of biophotonics-2015» (Н. Новгород-Казань, 2015 г.); Всемирная конференция «World Conference on Regenerative Medicine» (Лейпциг, Германия, 2015 г.); 2й Национальный конгресс по регенеративной медицине (Москва, 2016 г.); 1я Международная конференция молодых ученых «1st B3 International Conference for Young Scientists» (Москва, 2016 г.); 1я Всероссийская научно-практическая
конференция «3D инновации в медицине и фармакологии» (Н. Новгород, 2016 г.); Международная конференция «CTERP 2016» (С. Петербург, 2016 г.); 21я Нижегородская сессия молодых ученых «Естественные и математические науки» (Морозовский, 2016 г. Работа удостоена призового места); Европейская конференция «European Chapter Meeting of the Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society – 2016» (Уппсала, Швеция, 2016 г.); Общероссийская конференция с международным участием "StemCellBio-2016" (Санкт-Петербург, 2016 г.); 22я Нижегородская сессия молодых ученых «Естественные и математические науки» (Морозовский, 2017 г.); Европейская конференция «European Chapter Meeting of the Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society – 2017» (Давос, Швейцария, 2017 г.); Международный симпозиум «Topical problems of biophotonics-2017» (Санкт Петербург - Н. Новгород, 2017 г.).
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах, включает 9 таблиц и 26 рисунков. Список литературы содержит 254 источника, из них 239 зарубежных.
Публикации
По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, включая 5 статей в рецензируемых научных журналах, соответствующих перечню ВАК, и 16 тезисов конференций.
Скаффолды в инженерии костной ткани
Условно в оптических методах можно выделить несколько основных групп: эпи- и трансиллюминационная микроскопия; флуоресцентный и биолюминесцентный имиджинг; мультифотонная микроскопия и генерация второй гармоники [117].
Эпи- и трансиллюминационная микроскопия В эпи- и трансиллюминационной микроскопии видимый свет проецируется на образце, цвет и контрастность которого в полученном изображении зависят от поглощения, отражения, рассеяния и преломления света. Данная группа включает стереомикроскопию, светлопольную микроскопию, фазово-контрастную микроскопию, интерференционно контрастную микроскопию.
Стереомикроскопия базируется на регистрации отраженного света с поверхности образца. Изображения предмета с разных окуляров образуют стереопару, что обеспечивает передачу объектов с их объемным восприятием. В отличие от других видов микроскопии, где рабочее увеличение может достигать 1500-2000х, в стереомикроскопии оно не превышает 100х. Поэтому стереомикроскопы обычно используют для изучения крупных объектов [117]. В тканевой инженерии стереомикроскопы представляют собой крайне удобный инструмент при проведении операций на лабораторных животных (в том числе, формирование дефекта и имплантация скаффолдов) в связи с подходящим увеличением и большим рабочим расстоянием (от объекта исследования до объектива).
Светлопольную, фазово-контрастную и интерференционно контрастную микроскопии используют для изучения тонких ( 300 мкм), практически прозрачных образцов [210]. Светлопольная микроскопия базируется на регистрации частично поглощенного и рассеянного образцом света, что обуславливает формирование изображения. Контраст изображения микроструктуры объекта тем больше, чем большим поглощением в видимой области спектра обладают различные участки образца. Фазово-контрастная микроскопия используется для изучения непоглощающих прозрачных объектов, которые отличаются от окружающей среды показателями преломления и толщиной. Вследствие таких различий электро-магнитное излучение, прошедшее через образец, претерпевает изменения по фазе и приобретает «фазовый рельеф», за счет чего сильно увеличивается контрастность изображения. В интерференционно-контрастной микроскопии каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Далее один из полученных лучей направляется сквозь объект, другой - мимо него по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой, формируя контрастное изображение объекта [7;9]. В целом, данные виды микроскопии могут подходить для скаффолдов из прозрачных материалов и/или с четко-упорядоченными порами для изучения клеточного поведения in vitro на ранних стадиях до имплантации. При формировании плотной ткани in vivo полное поглощение света не позволяет дальнейшее использование трансиллюминационных методов.
Флуоресцентный и биолюминесцентный имиджинг В настоящее время оптический имиджинг на основе флуоресценции и биолюминесценции является важнейшим инструментом в биомедицинских исследованиях. Технологии флуоресцентного имиджинга основаны на физическом процессе флуоресценции. Молекулы некоторых веществ способны поглощать свет с определенной длиной волны (возбуждающее излучение) и переходить в электронно-возбужденное состояние. Возвращение молекулы в основное состояние сопровождается электромагнитным излучением (эмиссией) с длинной волны, отличной от длины волны возбуждающего излучения. Поглощение и эмиссия обуславливаются строением энергетических уровней электронов молекулы вещества и являются специфическими для каждого типа вещества.
Методы флуоресцентного биоимиджинга позволяют неинвазивное наблюдение клеточных и тканевых объектов, благодаря широкому спектру эндогенных и экзогенных флуорофоров. В качестве эндогенных флуоресцирующих агентов выступает ряд биологических молекул, присутствующих в норме в клетках (НАДН, НАДФН, ФАД и др.) [180]. Экзогенные красители представлены большим разнообразием флуоресцентных меток белковой и небелковой природы, которые могут быть доставлены в клетки путем эндоцитоза и различных вариантов клеточной трансфекции [225]. В зависимости от регистрирующего сигнал прибора (флуоресцентные микроскопы, установки для in vivo флуоресцентного имиджинга и др.) и его параметров можно визуализировать как отдельные субмикронные объекты, так и целый организм [116].
В тканевой инженерии методы флуоресцентного имиджинга активно внедряются как в in vitro, так и в in vivo исследования. Было показано, что с помощью флуоресцентных квантовых точек можно осуществлять in vitro мониторинг живых клеток в полимерных скаффолдах, культивируемых в условиях биореактора [142]. С помощью специфических к костной ткани флуоресцентных зондов проводятся активные исследования формирования костной ткани и минерализации скаффолдов в месте дефекта in vivo [60]. Путем добавления в структуру скаффолда флуоресцентных меток разрабатываются методики оценки скорости биодеградации имплантированных скаффолдов in vivo [105]. Одним из недостатков флуоресцентного имиджинга является автофлуоресценция тканей, которая создает высокий фоновый сигнал, снижающий чувствительность метода [55]. Данная проблема решается использованием ещ одного оптического метода – биолюминесцентного имиджинга. Этот метод основан на реакции окисления ферментом люциферазой соответствующего субстрата, сопровождающейся испусканием кванта света. При этом ДНК люциферазы встраивают в геном необходимых клеток, а субстрат затем вводят системно. Т.к. собственная люминесценция биотканей крайне незначительна, данный подход помогает осуществить детектирование сигнала только от целевых клеток. На сегодняшний день биолюминесцентный имиджинг с использованием маркера luk2 (оптимизированная люцифераза светляка) представляет собой быстрый, крайне чувствительный и неинвазивный метод исследования [4]. В тканевой инженерии данный метод был использован для сравнительного подсчета меченных luk2 клеток на скаффолдах в экспериментах in vitro и in vivo, в связи с тем, что активность люциферазы прямо коррелирует с количеством luk2-клеток [28;118]. В других исследованиях с помощью биолюминесцентного имиджинга оценивали формирование костной ткани in vivo по экспрессии остеокальцина, чей промотор был связан с люциферазным репортером [53;117]. В связи с высокой чувствительностью данный метод был так же использован для анализа миграции меченых клеток как в скаффолдах, так и в целом организме [26]. Однако главный недостаток биолюминесцентного имиджинга - его малая разрешающая способность, по-прежнему представляет значительную проблему.
Мультифотонная микроскопия и генерация второй гармоники Мультифотонная микроскопия основана на физическом принципе, описанном Марией Гпперт-Майер в 1931 г. [135]. В данном методе переход молекулы в электронно-возбужденное состояние происходит за счет поглощения двух фотонов, обладающих низкой энергией, в течение одного квантового события. При одновременном поглощении двух фотонов флуорофор получает достаточное количество энергии и переходит в возбужденное состояние с последующим испусканием одного фотона, длина волны которого меньше, чем у возбуждающего излучения. Вероятность того, что оба фотона возбуждающего излучения будут поглощены одновременно одной молекулой, крайне мала. В связи с этим в качестве источника возбуждающего света используются фемтосекундные лазеры со сверхкороткими импульсным излучением. По сравнению с другими видами флуоресцентной микроскопии мультифотонная микроскопия имеет большую проникающую способность и более низкую степень фототоксичности и фотообесцвечивания флуорофоров [93].
Методы и методики исследования
Диаметр пор является одной из важнейших характеристик скаффолдов. Ранее было показано, что поведение клеток очень сильно зависит именно от данного параметра [243]. Так же было установлено, что оптимальные значения диаметров пор для клеток с остеогенным потенциалом лежат в пределах от 150 до 350 мкм [152;153]. Таким образом, полученные образцы находились в пределах, близких к данной области значений размера пор. Пористость ВСК-скаффолдов составляла около 40%, ПСЛС- и 2ФП-скаффолдов - 70%. Методом спектроскопии комбинационного рассеяния показано распределение ГАП на поверхности и внутри объема скаффолдов всех типов. На рисунке 9 приведен пример микрофотограммы поверхности ВСК-скаффолда с выделенной областью, внутри которой осуществлялась регистрация спектров комбинационного рассеяния ГАП.
Изучены механические характеристики скаффолдов методом определения значения модуля продольной упругости (модуль Юнга). Показано, что все полученные скаффолды имеют модуль Юнга, лежащий в пределах 4.5-8.5 ГПа. По литературным данным модуль Юнга нормальной костной ткани зависит от типа кости и может находиться в пределах от 5 до 22 ГПа [190]. В частности, кортикальная кость в поперечном сечении имеет значение модуля Юнга от 5 до 13 ГПа [91]. Таким образом, механические характеристики скаффолдов в данной работе находились в пределах физиологических значений костной ткани.
Характеристика и трансфекция ММСК кроликов Для in vitro биологического тестирования скаффолдов были выделены, охарактеризованы и трансфицированы ММСК КМ кролика (рисунок 10А). Показано, что выделенные ММСК имеют фенотип мезенхимных стволовых клеток (CD105+, CD29+, CD44+, CD45–).
Рисунок 10. Внешний вид культуры ММСКurboFP635 (А) и флуоресцентный имиджинг TurboFP635 в ММСК (Б). Световая (Leica DMIL, Германия) и конфокальная (LSM 510 Meta, Карл Цейс, Германия, фильтры возбуждения BP 500-550 IR и эмиссии ВР 650-710 IR для TurboFP635) микроскопия. Шкала 100 мкм.
Для трансфекции красным флуоресцентным белком TurboFP635 использовали ММСК на ранних пассажах культивирования. В результате лентивирусной трансфекции получена культура ММСКurboFP635 (рисунок 10Б). Эффективность трансфекции составила 70%. Отбор клеток с наибольшим уровнем флуоресценции производили методом FACS-сортинга.
В качестве основных критериев биологического тестирования рассматривали прикрепление ММСКurboFP635 к поверхности скаффолдов, клеточную пролиферацию, миграцию клеток внутрь образцов, а так же жизнеспособность ММСКurboFP635.
Показано, что клетки способны прикрепляться и пролиферировать на полученных образцах всех типов (рисунок 11). На 5-й день культивирования на ВСК-скаффолдах были обнаружены единичные клетки, практически не контактирующие друг с другом. ММСКurboFP635 имели округлую форму, характерную для неполной адгезии клеток к поверхности. На образцах, полученных с помощью метода ПСЛС, напротив, можно было заметить крупные клеточные скопления в области пор, клетки имели веретеновидную форму, характерную для полной адгезии к поверхности. ММСКurboFP635 в 2ФП-скаффолдах были сосредоточены в основном внутри цилиндров, на поверхности находились единичные прикрепленные клетки. Разница в адгезии клеток к скаффолдам, полученным из одинакового полимера, может быть обусловлена внутренней структурой образцов, их пористостью и шероховатостью поверхности. Не смотря на одинаковый материал у всех трех типов скаффолдов, остальные параметры имели различия.
На 10-й день культивирования количество ММСКurboFP635 на образцах всех типов значительно увеличивалось визуально. На ВСК-скаффолдах клетки приобретали более вытянутый вид, характерный для нормального прикрепления к поверхности. Становилась заметной миграция клеток в поры скаффолдов всех типов.
Флуоресцентный имиджинг миграции и пролиферации ММСКurboFP635 на скаффолдах
Флуоресцентный имиджинг сосудов в формирующейся костной ткани после имплантации скаффолда с клетками
Через 3 месяца после имплантации в скаффолдах с подсаженными ММСК-GFP(-) и ММСК-GFP(+) с помощью метода флуоресцентного имиджинга было обнаружено большое количество кровеносных сосудов. Иммуногистохимическое окрашивание имплантатов на CD31 (маркер эндотелия сосудов, прогностический маркер ангиогенеза) подтвердило наличие эндотелиальных клеток (рисунок 21). Сосудистую сеть можно было видеть как в центре скаффолдов, так и по краям на границе дефекта. Диаметр всех сосудов составлял от 200 до 400 мкм.
Показано, что на скаффолдах с аллогенными ММСК-GFP(+) в не трансгенной мыши сосуды имеют сильный флуоресцентный сигнал и, соответственно, состоят из ММСК-GFP(+) (рисунок 21Д). И, напротив, на скаффолдах с ММСК-GFP(-) в трансгенной мыши сосуды не флуоресцируют (рисунок 21К). Более того, в некоторых местах на границе дефекта можно было видеть анастомозы между сосудами имплантата и сосудами, прорастающими из здоровой окружающей ткани (рисунок 21З,И). Рисунок 21. Сосудистая сеть на скаффолдах с ММСК-GFP(+) (A-Д) и ММСК-GFP(-) (Е-К): (A,Е) световая микроскопия сосудов на скаффолдах (Axio Zoom.V16, Карл Цейс, Германия); (Б,Ж) иммуногистохимический анализ на CD31 (Leica DMIL, Германия); (В,З) визуализация GFP (фильтры возбуждения/эмиссии BP 450–490/ LP 515); (Г,И) визуализация ядер, окрашенных хехстом (фильтры возбуждения/эмиссии BP 360-40/ BP 470-40); (Д,К) комбинация каналов для GFP и для хехста. v – сосуды. Красной пунктирной линией показаны анастомозы между сосудами на скаффолде и сосудами, прорастающими из окружающих тканей. Шкала 300 мкм. Таким образом, можно сделать вывод о том, что именно подсаженные аллогенные клетки в данном случае являются источником новообразованной сосудистой сети на скаффолдах. Кроме того, показано, что сосуды на скаффолдах способны объединяться с сосудами из окружающих тканей и формировать единую сосудистую сеть.
Скорость биодеградации скаффолдов является одним из важнейших параметров, определяющих успех восстановления костной ткани в месте дефекта. Существует большое количество работ, где данный параметр оценивается в экспериментах in vitro [58;166;241;253]. Однако оценка скорости биодеградации in vivo представляет значительную проблему в связи с тем, что основные методы оценки основаны на изменении массы скаффолда в биологических средах или гистологическом анализе имплантатов [89;171]. Таким образом, разработка методов in vivo оценки скорости биодеградации скаффолдов представляет собой важную задачу.
Для in vivo оценки скорости биодеградации скаффолдов и площади минерализованной ткани были использованы 2ФП-скаффолды в связи с тем, что они имели сильный автофлуоресцентный сигнал во всей области спектра. In vivo исследования проводили по схеме эксперимента, описанной во второй главе «Материалы и методы» (стр. 46).
Для in vivo оценки скорости биодеградации скаффолдов, как и для исследования участия подсаженных клеток в регенерации костной ткани, ММСК выделяли из костного мозга С57/Вl6 мышей. Однако в данном случае были использованы только ММСК-GFP(-) в связи с сильным автофлуоресцентным сигналом от 2ФП-скаффолдов и невозможностью детектирования GFP. Было показано, что ММСК-GFP(-) по фенотипу так же принадлежат к группе мезенхимных стволовых клеток (CD105+, CD29+, CD44+, CD45–), содержат небольшую субпопуляцию клеток (3.5±0.4%) с эндотелиальными маркерами (CD34+, CD133+, VEGFR1+) и имеют потенциал к остеогенной дифференцировке.
Клетки высаживали на 2ФП-скаффолды с одной стороны, т.к. хорошая взаимосвязанность пор и небольшая высота 2ФП-скаффолдов (около 400 мкм) позволяли сразу же заполнять весь объем образцов. Перед имплантацией скаффолды с ММСК-GFP(-) культивировали в течение 2 суток. Перед имплантацией часть скаффолдов с клетками окрашивали кальцеином/пропидиумом йодида для подтверждения жизнеспособности клеток (рисунок 22).
Флуоресцентный имиджинг сосудов в формирующейся костной ткани после имплантации скаффолда с клетками
В данной работе выделены три культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток: ММСК КМ кролика; ММСК-GFP(-) КМ C57Bl6 мышей; ММСК-GFP(+) КМ GFP(+) трансгенных C57Bl6 мышей. ММСК КМ кролика стабильно трансфицированы геном красного флуоресцентного белка TurboFP635.
Впервые разработана методика оценки количества клеток, меченных флуоресцентным белком, на поверхности скаффолдов. С помощью данной методики показано, что наибольшее количество подсаженных ММСК наблюдается на 20й день культивирования на скаффолдах, полученных методом двухфотонной фотополимериазции, по сравнению с образцами, сформированными с помощью методов вспенивания в сверхкритическом диоксиде углерода и поверхностного селективного лазерного спекания. В связи с тем, что все типы скаффолдов имели схожий состав и размер пор, можно сделать предположение о том, что пролиферативная активность клеток на скаффолдах зависит от внутренней архитектоники и структуры поверхности скаффолдов. С помощью методов ВСК и ПСЛС можно получить образцы с порами заданного размера, однако структурой поверхности на наноразмерном уровне управлять практически невозможно. При формировании скаффолдов методом 2ФП в процессе синтеза фоточувствительного полимера в зависимости от длины его цепей варьировалась средняя шероховатость поверхности скаффолдов, позволяя таким образом выбрать оптимальный вариант. В целом, разработанная методика оценки количества меченных флуоресцентным белком клеток на поверхности скаффолдов может быть использована для оптимизации биологического тестирования скаффолдов in vitro и in vivo в связи с тем, что в данных экспериментах для визуализации клеток не нужно использовать дополнительное окрашивание и экзогенные маркеры, а так же снимать клетки со скаффолдов. Стабильно экспрессирующийся флуоресцентный белок позволяет визуализировать не только первичную культуру, но и дочерние клетки, что дает возможность оценивать изменение количества клеток в динамике.
Впервые с помощью методов оптического биоимиджинга на модели GFP(+) трансгенных мышей показано, что подсаженные клетки могут присутствовать в имплантатах в течение 3 месяцев. К 3 месяцу имплантаты с подсаженными клетками практически полностью состоят из новообразованной костной ткани, и, что более важно, не содержат собственных клеток. Образование костной ткани в месте дефекта из подсаженных ММСК и отсутствие собственных клеток могут быть обусловлены структурой самих скаффолдов. Топографические особенности поверхности исследуемых скаффолдов, их механические характеристики и присутствие градиентных структур являются важнейшими элементами, модулирующими клеточное поведение. Более того, присутствие в составе скаффолдов каких либо наноразмерных компонентов, например гидроксиапатита, может значительно влиять на миграцию, пролиферацию и жизнеспособность клеток. Полученные результаты прямо коррелируют с данными о том, что подсаженные клетки непосредственно участвуют в процессах восстановления костной ткани, дифференцируясь в остеогенном направлении на скаффолдах-носителях.
Так же в проведенной работе показана возможность формирования сосудистой сети на скаффолдах из подсаженных клеток и образование анастомозов между сосудами скаффолда и сосудами здоровой костной ткани. В целом, васкуляризация скаффолдов является огромной проблемой в регенеративной медицине, потому что недостаточная циркуляция питательных веществ, кислорода, а так же отток продуктов жизнедеятельности и деградации скаффолдов ведут к образованию больших некротических зон внутри имплантатов. Основные подходы к решению данной проблемы базируются на объединении двух подходов: внедрение в структуру скаффолда биоактивных веществ и ростовых факторов, которые привлекают собственные сосуды, и предварительное культивировании скаффолдов с подсаженными клетками в специальных средах, которые могут индуцировать направленную дифференцировку в эндотелиальном направлении. В результате реализации данной идеи сосуды, сформированные на скаффолдах, должны формировать анастомозы с сосудами, привлеченными из окружающих здоровых тканей и тем самым образовывать единую сеть. В нашей работе скаффолды не подвергались дополнительному культивированию в средах, индуцирующих дифференцировку клеток в эндотелиальном направлении, а так же не содержали каких-либо биоактивных веществ, способных привлекать собственные сосуды. Полученные результаты с одной стороны могут подтверждать данные о том, что культура мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенная из костного мозга, обладает гетерогенными свойствами. С другой стороны, можно сделать вывод о том, что имеющаяся в норме в костном мозге небольшая субпопуляция эндотелиальных прогениторных клеток способна выживать в in vitro условиях и дифференцироваться затем на имплантированных скаффолдах в эндотелиальном направлении.
Впервые разработана методика оценки скорости биодеградации имплантированных скаффолдов in vivo по уровню их флуоресцентного сигнала с помощью методов оптического биоимиджинга. В настоящее время определение скорости биодеградации скаффолдов после их имплантации в динамике представляет собой значительную проблему в связи с тем, что основные методы оценки основаны на регистрации изменения массы и механических характеристик скаффолдов в биологических средах, а так же ex vivo морфологическом анализе имплантатов. Все вышеуказанные методы невозможно осуществить без забора скаффолда после его имплантации. В связи с этим разработка методики оценки скорости биодеградации имплантированных скаффолдов in vivo в динамике представляет собой крайне актуальную задачу.