Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1. Общее строение глаза и сетчатки позвоночных 13
1.1. Общее строение глаза позвоночных 13
1.2. Расположение, строение и функции сетчатки позвоночных 14
2. Ретинальный пигментный эпителий 15
2.1. Строение клеток ретинального пигментного эпителия 16
2.2. Гетерогенность ретинального пигментного эпителия 18
2.3. Функции ретинального пигментного эпителия 19
2.4. Развитие ретинального пигментного эпителия 2.4.1. Общие данные по нормальному развитию глаза позвоночных 21
2.4.2. Первичная индукция и специализация ретинального пигментного эпителия 23
3. Фенотипические изменения клеток ретинального пигментного эпителия позвоночных животных и человека 25
3.1. Фенотипическая пластичность клеток ретинального пигментного эпителия позвоночных животных in vivo 25
3.3.1. Регенерация ретинального пигментного эпителия млекопитающих 25
3.3.2. Трансдифференцировка клеток ретинального пигментного эпителия у позвоночных
3.2. Фенотипическая пластичность клеток ретинального пигментного эпителия in vitro 29
3.3. Фенотипическая пластичность клеток ретинального пигментного эпителия человека
3.3.1. Изменение фенотипа клеток ретинального пигментного эпителия человека in vivo 31
3.3.2. Изменение фенотипа клеток ретинального пигментного эпителия человека in vitro 32
3.4. Трансдифференцировка клеток ретинального пигментного эпителия взрослого человека
в нейральном направлении 35
3.4.1. Ростовые и нейротрофические факторы, стимулирующие нейроногенез 36
Нейротрофические и ростовые факторы периферической и центральной нервной системы 37
3.4.2. Использование морфогенов для стимулирования в нейральном направлении клеток
ретинального пигментного эпителия человека 40
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 42
1. Материал исследования 42
2. Методы исследования 43
2.1. Динамика поведения и фенотипические изменения клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека in vitro 43
2.1.1. Характеристика интактного ретинального пигментного эпителия и сетчатки глаза человека на ранних сроках развития при помощи гистологических и иммуногистохимических методов исследования 44
Гистологическое исследование 44
Иммуногистохимический анализ 44
2.1.2. Выделение клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека 45
2.1.3. Культивирование клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека в средах с высоким содержанием сыворотки 46
2.1.4. Культивирование клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития в среде с ростовыми факторами 46
2.1.5. Анализ фенотипической пластичности клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека ранних стадий развития, культивируемых in vitro 47
Прижизненное наблюдение (фазово - контрастная микроскопия) 47
Иммуноцитохимический анализ 47
2.2. Изменение фенотипа клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro 47
2.2.1. Характеристика интактного ретинального пигментного эпителия и сетчатки глаза взрослого человека при помощи гистологических, иммуногистохимических, методов исследования и метода полимеразной цепной реакции 48
Гистологическое исследование 48
Иммуногистохимический анализ 48
Метод полимеразной цепной реакции 49
2.2.2. Выделение клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека 49
2.2.3. Культивирование клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека в средах с высоким содержанием сыворотки 51
2.2.4. Культивирование клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека в
средах с добавление нейротрофических и ростовых факторов: основного фактора роста фибробластов (bFGF) и эпидермального фактора роста (EGF), нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и нейротропного фактора мозга (BDNF) 53
Влияние ростовых факторов основного фактора роста фибробластов (bFGF) и эпидермального фактора роста (EGF) 53
Влияние нейротрофических факторов: нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и нейротропного фактора мозга (BDNF) 53
2.2.5. Характеристика ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro 54
Прижизненное наблюдение (фазово - контрастная микроскопия) 54
Иммуноцитохимический анализ 55
Метод полимеразной цепной реакции 55
МТТ тестирование - колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток
ГЛАВА 3. Результаты исследования 57
1. Исследование изменений поведения и фенотипа клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека in vitro 57
1.1. Характеристика интактного ретинального пигментного эпителия и сетчатки глаза человека на ранних сроках развития 57
1.1.1. Гистологическое исследование 57
Ретинальный пигментный эпителий 57
Сетчатка 57
1.1.2. Иммуногистохимический анализ 58
1.2. Анализ фенотипической пластичности клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития, культивируемых в средах с высоким содержанием сыворотки 59
1.2.1. Прижизненное наблюдение (фазово - контрастная микроскопия) 59
1.2.2. Иммуноцитохимический анализ 60
1.3. Анализ фенотипической пластичности клеток ретинального пигментного эпителия глаза
человека на ранних стадиях развития, культивируемых в средах с добавлением ростовых
факторов (bFGF, EGF) и кондиционированной среды 61
1.3.1. Прижизненное наблюдение (фазовая контрастная микроскопия) 61
1.3.2. Иммуноцитохимический анализ 62
2. Исследование пластических способностей клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro 65
2.1. Характеристика интактного ретинального пигментного эпителия и сетчатки глаза
взрослого человека 65
2.1.1. Гистологическое исследование 65
2.1.2. Иммуногистохимический анализ 65
2.1.3 Анализ методом полимеразной цепной реакцией 66
2.2. Характеристика фенотипической пластичности клеток РПЭ глаза взрослого человека, культивируемых в средах с высоким содержанием сыворотки 66
2.2.1. Прижизненное наблюдение (фазово - контрастная микроскопия) 66
2.2.2. Иммуноцитохимический анализ 68
2.2.3. Анализ методом полимеразной цепной реакцией клеточных культур ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека 70
2.3. Характеристика фенотипической пластичности клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека, культивируемых в средах, содержащих нейротфические и ростовые факторы (bFGF, EGF, BDNF, CNTF, GNTF) с низким содержанием сыворотки 71
2.3.1. Прижизненное наблюдение (фазово - контрастная микроскопия) 71
Влияние ростовых факторов: основного фактора роста фибробластов (bFGF) и эпидермального фактора роста (EGF) 71
Влияние нейротрофических факторов: нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и нейротропного фактора мозга (BDNF) на поведение клеток ретинального пигментного эпителия в селективных культурах 72
2.3.2. Иммуноцитохимический анализ 73
Влияние ростовых факторов основного фактора роста фибробластов (bFGF) и эпидермального фактора роста (EGF) 73
Влияние нейротрофических факторов нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и нейротропного фактора мозга (BDNF) 74
2.3.3. Колориметрический МТТ тест для оценки метаболической активности клеток 76
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 77
Клетки ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития in vitro 77
Клетки ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro 78 Иммуноцитохимический анализ и анализ полимеразной цепной реакции клеток ретинального
пигментного глаза человека 79
Влияние факторов на поведение клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека in vitro 85
Влияние факторов на поведение клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro 86
Клетки ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека I и II субпопуляций 89
Суспензионные культуры клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека 90
Сравнение поведение клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития и глаза взрослого человека in vitro 91
Заключение 94
Выводы 96
Обозначения и сокращения 97
Список литературы 98
- Строение клеток ретинального пигментного эпителия
- Трансдифференцировка клеток ретинального пигментного эпителия у позвоночных
- Культивирование клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека в средах с высоким содержанием сыворотки
- Анализ фенотипической пластичности клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития, культивируемых в средах с высоким содержанием сыворотки
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Исследования дифференцировки и пластичности стволовых клеток, а также создание индуцированных плюрипотентных клеток из соматических (Takahashi and Yamanaka, 2006), повлекли за собой новую волну интереса к проблемам де- и трансдифференцировки. Среди разных клеточных популяций особый интерес вызывают клетки ретинального пигментного эпителия (РПЭ) глаза, которые обладают биологической предрасположенностью к трансдифференцировке. Классическую модель представляют клетки РПЭ глаза низших позвоночных, которые при травме дедифференцируются, а их потомки развиваются в нервные и глиальные клетки, полностью реконструируя сетчатку (Chiba and Mitashov, 2008). У птиц и млекопитающих трансдифференцировка РПЭ наблюдается только в ранние периоды эмбрионального развития, однако, ее можно стимулировать введением специфических факторов роста, морфогенов и инсерцией генов (Yan et al., 2007; Azuma et al., 2005).
В глазу человека клетки РПЭ под влиянием различных патологических индукторов драматически меняют поведение, активируя процесс смены клеточного фенотипа, подобный трансдифференцировке, что приводит к нарушению зрения и слепоте. Раскрытие механизмов трансдифференцировки клеток РПЭ человека представляет важную фундаментальную и клиническую проблему.
Степень разработанности темы. Клетки РПЭ глаза взрослого человека при патологии активируют клеточный цикл и пролиферируют, мигрируют, депигментируются и экспрессируют нехарактерные белки-маркеры (Toyran et al., 2005). Аналогичные процессы модулируются in vitro, поэтому для понимания механизмов трансдифференцировки РПЭ перспективно изучение клеток в культуре. Известно, что при длительном культивировании клетки РПЭ плодов человека способны трансдифференцироваться в клетки хрусталика. Недавно показано, что клетки РПЭ in vitro могут экспрессировать белки-маркеры не только нейральных, но и мезенхимных клеток (Salero et al., 2012). Это указывает на то, что клетки РПЭ человека в определенных условиях in vivo и in vitro могут проявлять мультипотентность и трансдифференцироваться в другие типы клеток (Stern, Temple, 2015) Однако процессы трансдифференцировки РПЭ глаза человека изучены мало, поскольку основными объектами исследований являются клетки амфибий, птиц и грызунов.
Цель и задачи исследования. Цель исследования - изучение способности клеток РПЭ глаза плодов и взрослого человека к трансдифференцировке в нейральном направлении in vitro.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить поведение и фенотипические изменения клеток РПЭ глаза плодов человека при культивировании:
- отработать условия выделения клеток РПЭ плодов человека, которые
обеспечат наиболее продуктивный клеточный выход, и условия
культивирования клеток РПЭ, которые позволят нарастить необходимое
количество клеток для дальнейшего исследования;
-
Проанализировать поведение и дифференцировку клеток РПЭ плодов человека в средах, содержащих ростовые факторы, которые используют для культивирования нейральных стволовых клеток (НСК);
-
Исследовать способность клеток РПЭ глаза взрослого человека к дифференцировке в другие типы клеток при культивировании:
- подобрать условия выделения клеток РПЭ глаза взрослого человека, которые
обеспечат наиболее продуктивный клеточный выход и условия
культивирования клеток РПЭ, которые позволят нарастить необходимое
количество клеток для дальнейшего исследования.
-
Провести культивирование клеток РПЭ глаза взрослого человека, в средах с добавлением нейротрофических и ростовых факторов (bFGF, EGF, BDNF, CNTF, GNTF).
-
Дать характеристику фенотипической пластичности клеток РПЭ глаза взрослого человека при помощи гистологических, ИЦХ, ПЦР, МТТ -методов исследования.
Научная новизна. Впервые исследовано поведение и фенотипические изменения клеток РПЭ глаза плодов и взрослого человека при разных условиях культивирования. Показана способность клеток к нейральной дифференцировке in vitro и влияние ростовых и нейротрофических факторов. Впервые показано, что гетерогенность клеток РПЭ плодов и взрослого человека проявляется в характере роста клеток и формировании колоний, в особенностях пролиферации и дифференцировки в ответ на различные индукторы в ростовой среде. Показано, что в направленных условиях культивирования клетки РПЭ плода и взрослого человека формируют 3Д-сферы, состоящие из малодифференцированных клеток экспрессирующих белки-маркеры плюри - и мультипотентных клеток. Впервые в клетках РПЭ глаза человека in vivo и in vitro обнаружена экспрессия генов, кодирующих транскрипционные факторы плюрипотентных клеток: Oct4 и Nanog. Показано, что дедифференцированные клетки РПЭ глаза человека проявляют тенденцию к нейральной дифференцировке независимо от возраста донора и использованной среды культивирования. Впервые в клетках РПЭ in vitro выявлены специфические маркеры зрелых клеток сетчатки и мозга: рековерин, тирозингидроксилаза, О4, CNPase.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты
работы важны для понимания процессов клеточной дифференцировки и
решения биомедицинских проблем, связанных с изменениями клеток РПЭ при
врожденной патологии и заболеваниях глаза. Разработанные модели in vitro
открывают перспективы для исследования патологических процессов глаза
человека, связанных с нарушением РПЭ, и поисков факторов для их
компенсации. Результаты представляют интерес с позиции трансформации
клеток РПЭ в нейральном направлении и открывают возможность получения
клеток предшественников для изучения замещения поврежденных нейронов сетчатки. Результаты работы используются в чтении курсов и в практических занятиях на кафедрах эмбриологии и клеточной биологии и гистологии МГУ им. М.В. Ломоносова и в медицинских учебных заведениях.
Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на 31 всероссийских и международных конференциях: «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2005); конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2004, 2006, 2007, 2008, 2009, 2011); XIV, XV школах молодых ученых «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Звенигород, 2005, 2008); «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008); «Аутологичные стволовые клетки экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008-2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008, 2009); «Ломоносов-2009», «Ломоносов-2010» (Москва); «Клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2009); «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); научно-практической конференции по офтальмохирургии с международным участием (Уфа, 2011); V, VI, VII, VIII международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Украина, 2009, 2010, 2011, 2012, 2014); V Всероссийская научно-практическая конференция "Стволовые клетки и регенеративная медицина" Медицинский научно-образовательный центр МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва, 2013 г.; Международная научная конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» Москва, 16-17 апреля 2014 г.
Личное участие автора. Все эксперименты были спланированы и выполнены при непосредственном участии соискателя, ряд опытов по оценке экспрессии генов был проведен совместно с сотрудниками ИБР РАН. Анализ работы проведен, и выводы сформулированы лично автором на основе собственных оригинальных данных и совокупности данных литературы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка обозначений и сокращений, списка литературы, включающего 218 источников, и четырех приложений. Работа изложена на 182 страницах, содержит 31 рисунок и 15 таблиц.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 42 печатных работы, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК, – 10, в т.ч. 7 статей индексированы в базе данных WoS, патент на изобретение – 1, тезисов докладов и материалов конференций – 31.
Строение клеток ретинального пигментного эпителия
Роговица (лат. cornea) — передняя наиболее выпуклая прозрачная часть глазного яблока, одна из светопреломляющих сред глаза [Walls, 1942; Вит, 2003]. Хрусталик (лат. lens) образован радиально расположенными хрусталиковыми волокнами (лат. fibra lentis) и заключен в капсулу (лат. capsula lentis), представляющую собой утолщенную базальную мембрану. От экваториальной зоны капсулы отходят тонкие волокна зонулы, образующие ресничный поясок (лат. zonula ciliaris) и прикрепляющиеся в периферической части глаза к цилиарному телу (лат. corpus ciliare) (ЦТ) [Walls, 1942; Вит, 2003]. Радужка (лат. iris) состоит из наружного и внутреннего листков. В центре радужки имеется круглое отверстие — зрачок, через которое лучи света проникают внутрь глазного яблока и достигают сетчатки [Walls, 1942; Вит, 2003]. Желеобразное стекловидное тело (лат. сorpus vitreum) заполняет пространство между волокнами зонулы, хрусталиком и сетчаткой (лат. retna). На уровне наружных сегментов фоторецепторов сетчатка находится в тесном контакте с однорядным слоем интенсивно пигментированных эпителиальных клеток, названных пигментным эпителием сетчатки (pars pigmentosa) [Walls, 1942; Вит, 2003]. Ретинальный пигментный эпителий контактирует через мембрану Бруха с сосудистой оболочкой глазного яблока (tunica vasculosa bulbi), которая играет важную роль в обменных процессах, обеспечивая питание глаза и выведение продуктов обмена. Она богата кровеносными сосудами и пигментом (который препятствует проникновению света через склеру, устраняя светорассеяние) [Walls, 1942; Вит, 2003]. Наружная — очень плотная фиброзная оболочка глазного яблока (tunica fibrosa bulbi), выполняет защитную функцию и благодаря тургору обусловливает форму глаза. Она состоит из передней прозрачной части — роговицы, и задней непрозрачной части белесоватого цвета — склеры [Walls, 1942; Вит, 2003].
Сетчатка (лат. retna) – это тонкая (около 300 мкм) оболочка, выстилающая заднюю стенку глаза человека, представляющая собой структуру, состоящую из 10 слоев. В составе сетчатки различают следующие слои в направлении от внутренней ограничивающей мембраны к наружной ограничивающей мембране: слой нервных волокон, ганглиозный слой, внутренний сетчатый слой, внутренний ядерный слой, наружный сетчатый слой, наружный ядерный слой, слой палочек и колбочек (Рисунок 1.2.).
В сетчатке миллионы нейронов действуют согласованно, обеспечивая восприятие и преобразование электромагнитного излучения видимой части спектра в нервные импульсы, и их первичную обработку. Слой, в котором расположены первые нейроны зрительного анализатора, граничит с РПЭ. В этом слое начальные светочувствительные нейроны фоторецепторов (палочки и колбочки) захватывают фотоны и создают электрофизиологические сигналы. Эти сигналы затем передаются и модулируются вторичными, внутренними интернейронами и, наконец, передаются в головной мозг ганглиозными клетками сетчатки с помощью аксонов. Эти аксоны составляют зрительный нерв [Walls, 1942; Mann, 1949; Вит, 2003]. Нейроны сетчатки - терминально дифференцированные клетки, которые не восполняются при повреждении и гибель основной популяции приводит к необратимой потере зрения. Это определяет повышенный интерес к разработке терапевтических подходов, включая замену
Схематическое изображение строения сетчатки глаза позвоночных. погибших клеток сетчатки эндогенными клетками, полученными благодаря клеточной регенерации, либо с помощью экзогенных клеток – путем клеточной трансплантации [da Cruz et al., 2007].
Пигментный эпителий сетчатки (pars pigmentosa), или по принятой международной терминологии ретинальный пигментный эпителий (РПЭ) [Панова, 1993], является важной частью зрительной системы позвоночных, необходимой для поддержания структурной и функциональной целостности сетчатки глаза. 2.1. Строение клеток ретинального пигментного эпителия
У позвоночных животных и человека в норме РПЭ представляет собой монослой сильнопигментированных, гексагональных, поляризованных, непролиферирующих, высокодифференцированных клеток. Они выстилают заднюю стенку глаза и располагаются между фоторецепторными клетками нейральной сетчатки и сосудистой оболочкой глаза (Рисунок 1.3. а). РПЭ занимает площадь, соответствующую площади склерального отдела глаза, простираясь от головки глазного нерва до зубчатого края сетчатки ora serrata, где переходит в пигментированный эпителий ЦТ, который в свою очередь переходит в пигментированный эпителий радужки [Панова, 1993].
В клетках РПЭ различают три основные поверхности: базальная (обращенная к склере), центральная (боковые поверхности) и апикальная (обращенная к наружным сегментам фоторецепторов (НСФ)) [Bok, 1982, Панова, 1993; Korte et al., 1994]. Базальная поверхность клеток РПЭ представлена многочисленными складками, глубина которых коррелирует с интенсивностью транспорта метаболитов из сосудистой оболочки в сетчатку. Она соединена с мембранной Бруха.
Мембрана Бруха (лат. lamina vitrea) –это внеклеточный слой, к которому прилегают клетки РПЭ и формируют базальную мембрану. Мембрана Бруха формируется клетками РПЭ и клетками сосудистой оболочки глаза. Это многослойная структура, которая состоит из базальной пластинки РПЭ (базальная мембрана РПЭ), внутреннего коллагенового слоя, среднего эластичного слоя, наружного коллагенового слоя и базальной фенестрированной пластинки хориокапилярного эндотелия [Korte et al., 1994; Панова, 1993; Zarbin, 2003].
Клетки РПЭ соединены между собой при помощи латеральных межклеточных контактов, представленных: zonula occludens, zonula adherens и gap junction, благодаря которым образуется непроницаемый гематоретинальный барьер [Панова, 1993; Korte et al., 1994; Strauss, 2005].
На апикальной стороне клетки РПЭ формируют апикальные отростки. Длинные тонкие апикальные отростки находятся между наружных сегментов фоторецепторов (НСФ) и содержат меланиновые гранулы. Короткие не имеют пигментных гранул, они окружают дистальные кончики НСФ и принимают участие в фагоцитозе отработанных дисков НСФ [Панова, 1993; Korte et al., 1994].
Ядро клеток РПЭ овальное или круглое, с равномерно диспергированным хроматином с одним или несколькими ядрышками. Кроме одноядерных в слое РПЭ встречаются двух -, трех, четырехъядерные полиплоидные клетки. Ультраструктурные исследования показали изобилие шероховатого и гладкого эндоплазматического ретикулума в клетках РПЭ, простирающегося от базальной к апикальной поверхности клеток и митохондрий, концентрирующегося у базальной поверхности клеток [Панова, 1993].
Трансдифференцировка клеток ретинального пигментного эпителия у позвоночных
У некоторых млекопитающих клетки РПЭ способны к регенерации в ответ на повреждение или изменение окружающей среды [Korte et al., 1994]. Во многих исследованиях была отмечена способность клеток РПЭ млекопитающих восстанавливаться после лазерного повреждения. Например, у обезьян регенерация РПЭ происходит за счет замещения некротических клеток в области повреждения мигрирующими и пролиферирующими, прилегающими к ране клетками РПЭ. После удаления некротических клеток РПЭ макрофагами, клетки РПЭ мигрируют по базальной мембране в область повреждения. Если рана не слишком большая, то имеет место полное восстановление слоя РПЭ. Если рана большая, то происходит ограниченная периферией раны регенерация РПЭ, в результате образование в центральной части раны рубца [Tso and Albert, 1972; Miller et al., 1990; Korte et al., 1994].
При повреждении сетчатки избыточной иллюминацией у крыс в области ожога происходит ремоделирование сетчатки. Оно представлено несколькими этапами: атрофией фоторецепторов, гибелью нейронов, миграцией биполяров и амакриновых клеток к наружной и внутренней пограничным мембранам по Мюллеровским клеткам (приводит к полному нарушению послойного строения сетчатки), гипертрофией Мюллеровских клеток, которые образуют в субретинальном пространстве плотный фибриллярный листок, лишая сетчатку доступа к хороиду. В ходе этих перестроений капиллярная сеть сетчатки начинает примыкать к слою РПЭ, в котором происходит точечная гиперплазия. Клетки РПЭ на этих стадиях начинают вытягиваться вдоль капилляров и использовать их как пути миграции в сетчатку. Некоторые из этих мигрирующих клеток, которые вероятно возникают из пролиферирующих клеток РПЭ, являются незрелыми, в них отсутствует структурная и функциональная полярность, характерная для нормального РПЭ [Korte et al., 1994, Mark et al., 2003; Максимова, 2008]. В области точечной гиперплазии клетки РПЭ пролиферируют и формируют бугорок между базальной мембраной РПЭ и сетчаткой. Клетки РПЭ в бугорке незрелые. Эти изменения могут быть обратимы, если клетки РПЭ образуют непосредственный контакт с клетками сетчатки [Korte et al., 1994].
При отслоении сетчатки от РПЭ, наблюдается дедифференцировка эпителия. Например, у кошек, апикальные отростки клеток РПЭ сокращаются, и пролиферация приводит к образованию кластеров или слоев недифференцированных клеток. Но эти клетки способны к редифференцировке с постепенным возвращением морфологических и функциональных характеристик нормального РПЭ [Anderson et al., 1981; Anderson et al., 1986; Korte et al., 1994]. Выше описанным изменениям так же подвергаются клетки РПЭ у кроликов при механическом повреждении [Heriot and Machermer, 1992]. Все это является свидетельством пластичности фенотипа клеток РПЭ в условиях in vivo. Сходные события, вероятно, имеют место при заживлении разрывов и разрезов в сетчатке человека. Однако в клинических условиях, пролиферативный ответ РПЭ является нежелательным побочным эффектом операции, меняющим физические свойства слоя, вызывая отслоение сетчатки и приводя к нарушению зрения.
При проникающих ранениях глаза, провоцирующих нарушение гематоретинального барьера, миграции клеток РПЭ и макрофагов в полость стекловидного тела способствует фибронектин, фактор роста из тромбоцитов и другие компоненты ВКМ и сыворотки крови. В ряде случаев мигрирующие клетки РПЭ оседают в полости стекловидного тела и образуют там пигментированные группы. При проникающих ранениях склерального сектора глаза клетки РПЭ осуществляют первичное заживление, продуцируя коллаген и мукополисахариды. Этот процесс нередко сопровождается клеточным размножением. При этом в ряде патологических состояний размножающиеся клетки РПЭ претерпевают метапластические превращения с образованием хрящевой и костной ткани [Frayer, 1966; Tso, 1979; Панова, 1993; Salero et al., 2012].
Ответ клеток РПЭ на изменения в их микроокружении и частичная способность к восстановлению функций после повреждения свидетельствует о сохранении некоторых регенеративных потенций в РПЭ. Реакция РПЭ на уровне ультраструктуры клеток включает изменения в плазматической мембране (потеря полярности, потеря апикальных отростков и базальных впячиваний), цитоскелете (изменение формы клеток и появление способности к миграции) и во внеклеточном матриксе (синтез фибронектина и коллагена).
Изменение микроокружения РПЭ у многих видов позвоночных может стимулировать его к трансдифференцировке в другие типы клеток глаза, например, в нейроны и глию сетчатки или клетки хрусталика [Stone и Steinitz, 1957; Stroeva and Mitashov, 1983; Park and Ho11enberg, 1993]. Однако эта способность по-разному проявляется у разных видов позвоночных [Zhao et al., 1997]. Клетки РПЭ тритонов и лягушек (например, X. Laewis) способны трансдифференцироваться в нейроны сетчатки и в хрусталик в течение всей жизни [Stone, 1967]. РПЭ других амфибий может трансдифференцироваться в сетчатку только в течение личиночной стадии развития [Coulombre and Coulombre, 1965; Lopashov and Sologub, 1972; Reh and Nagy, 1987]. Регенерация хрусталика за счет трансдифференцировки РПЭ - это эксклюзивная особенность амфибий, у других классов животных она не наблюдается [Stone, 1967].
Способность к регенерации сетчатки наблюдается и у других классов животных, таких как рыбы, птицы и, возможно, млекопитающие. Однако пути и способы регенерации различны и сложны, так могут включать в себя и трансдифференцировку РПЭ и дифференцировку стволовых клеток (стволовых клеток цилиарно – маргинальной зоны, серповидного отростка), а также клетки Мюллеровской глии [DelRiosonis and Tsonis, 2003]. У рыб и птиц РПЭ может трансдифференцироваться только на ранних стадиях эмбрионального развития. РПЭ у осетровых рыб неспособен изменяться после появления в клетках пигментации [Строева, 1960]. В то время как, уже пигментированный РПЭ костистых рыб может трансформироваться в сетчатку [Sologub, 1975]. У взрослых рыб способность клеток к трансдифференцировке в клетки сетчатки специально исследована и показано ее отсутствие [Knight and Raymond, 1995]. РПЭ цыпленка может восстанавливать сетчатку, по крайней мере, на стадии E4 (или стадия 22-25 по Hamburger and Hamilton, 1951), к тому времени РПЭ становиться пигментированным [Coulombre and Coulombre, 1965].
Клетки РПЭ взрослого тритона обладают уникальной способностью к репрограммированию в клетки сетчатки in vivo. Процесс трансдифференцировки или конверсии клеточного типа клеток РПЭ в сетчатку у взрослого тритона активно исследуется в основном двумя школами – российской и японской. Были детально исследованы морфогенетические процессы при регенерации сетчатки, клеточная пролиферация, проанализированы синтез специфических и общих белков, изменения ВКМ и состава цитоскелета, экспрессия и взаимодействие регуляторных генов [обзор Григорян и др., 2013]. В экспериментах все исследователи, наблюдали что, после полного удаления сетчатки, клетки РПЭ вступают в митоз. Предполагается, что дочерние клетки, мигрирующие далеко от мембраны Бруха и формируют пул клеток, из которых образуется новая нейральная сетчатка. Другие дочерние клетки останутся в контакте с мембраной Бруха и восстановят функциональный РПЭ. В случаях, когда удаляется небольшая часть сетчатки, РПЭ так же генерирует клетки, которые восстанавливают потерянную ткань (Рисунок А.2.) [Stone, 1950; Chiba et al., 2006; Григорян и др., 2013].
Самые ранние исследования показали, что клетки РПЭ способны трансдифференцироваться в хрусталик, так же как в сетчатку. Исследования на взрослом тритоне показали, что частота формирования хрусталика намного ниже, чем сетчатки у клеток РПЭ [Stone, Stenitz, 1957]. Авторы предположили наличие ингибирующего влияния клеток, лежащих под РПЭ в сосудистой оболочке на формирование хрусталика, которое было снижено на краях глазного бокала.
Клетки РПЭ некоторых амфибий, проходя этапы пролиферации, депигментации и дифференцировки, способны продуцировать нервные и глиальные клетки in vivo в поврежденной сетчатке de novo после ее удаления. Одними из ключевых факторов, влияющих на трансдифференцировку клеток РПЭ, являются: компонент внеклеточного матрикса – ламинин, гепаринсульфатпротеогликан, а также bFGF [DelRiosonis and Tsonis, 2003]. Было показано, что регенерация сетчатки за счет РПЭ у эмбриона цыпленка in vivo требует присутствия части сетчатки или другой нейральной ткани [Coulombre and Coulombre, 1965]. Эксперименты показали, что наличие нейральной ткани можно заменить внедрением бусинки, медленно выпускающей bFGF. Значит, эти нейральные ткани синтезируют факторы роста, например, bFGF, который способствует трансдифференцировке клеток РПЭ [Park and Hollenberg, 1989]. Индукция bFGF клеток РПЭ к трансдифференцировке была так же подтверждена в экспериментах in vitro [Pittack et al., 1991; Guillemot and Cepko, 1992]. Регенерация сетчатки у цыпленка происходит в той же последовательности, как и нормальное развитие сетчатки, но только в перевернутой полярности [DelRiosonis and Tsonis, 2003]. У взрослых птиц процессы трансдифференцировки РПЭ не выявлялись.
В отличие от обширных данных относительно трансдифференцировки клеток РПЭ у амфибий, рыб и птиц на РПЭ млекопитающих были выполнены немногочисленные исследования. Впервые Строева О.Г. [Строева, 1960] пересаживала глазной пузырь крысы на стадиях Е11.5-Е14.5 в переднюю камеру глаз взрослых крыс. Исследования показали, что презумптивный РПЭ на очень ранних стадиях трансформируется в ткань подобную сетчатке, если он оказался в неприкрепленном состоянии, но, чтобы РПЭ стал пигментированным, необходим контакт с окружающей мезенхимой или с радужкой. Дальнейшие исследования трансдифференцировочного потенциала клеток РПЭ млекопитающих и молекулярных факторов, которые влияют на этот процесс, проводились in vitro [Zhao et al., 1995].
Культивирование клеток ретинального пигментного эпителия глаза плодов человека в средах с высоким содержанием сыворотки
Далее, для определения влияния состава среды на поведение клеток, мы культивировали клетки РПЭ 11.5 н.р. в среде DMEM/F12 с 1% FBS с добавлением факторов роста bFGF и EGF. То есть, мы использовали среду, которая необходима для накопления стволовых и прогениторных клеток мозга (Reynolds, Weiss, 1992; Poltavtseva et al., 2001; Александрова и др., 2005). В этой среде, часть клеток РПЭ прикреплялась ко дну культурального флакона и образовывала адгезивные культуры (Рисунок В.5 а, б), в то время как, другая не адгезировала, но, напротив, формировала свободноплавающие сферические агрегаты, подобные нейросферам мозга (Рисунок В.5 а, в). Сферические агрегаты состояли из пигментированных и частично депигментированных клеток (Рисунок В.5 в). Клетки в адгезивных культурах вели себя так, как описано выше (смотри пункт 1.2.1 данной главы). Через 14 суток в культурах находились мало -и депигментированные клетки эпителио - и фибробластоподобной морфологии, которые активно пролиферировали (Рисунок В.5 б). Пролиферация клеток РПЭ в данных условиях была выше, чем в культурах, растущих в средах без добавления ростовых факторов
При культивировании в среде с пониженным содержанием сыворотки и в присутствии ростовых факторов bFGF и EGF часть клеток РПЭ глаза плодов человека адгезировали к дну культурального флакона, другая часть оставалась в свободно плавающем состоянии и формировала сферические агрегаты (Рисунок В.5 б, в).
В адгезивных культурах выявлялись эпителио – и фибробластоподобные клетки. Оба типа клеток пролиферировали, и их число было в три раза выше, чем в средах без факторов, что было показано окрашиванием антителами против Ki67 и подсчетом Ki67 – позитивных клеток (Рисунок В.6 ж). Эпителиоподобные клетки и часть фибробластоподобных клеток продуцировали Cx43 (Рисунок В.6 а). Однако наиболее существенным отличием от адгезивных культур, растущих в среде с 10% FBS, было то, что в данных условиях присутствовала многочисленная популяция клеток (30,86%) иммуноцитохимически окрашенных на Pax6 (Рисунок В.6 е). Pax6 – позитивными были выявлялись клетки как эпителио - , так и фибробластоподобной морфологии. Одновременно в культуре была обнаружена многочисленная популяция IIIтубулин - позитивных клеток (Рисунок В.6 в, г, д). Морфология фибробластоподобных IIIтубулин - позитивных клеток была различной, среди них наблюдались клетки распластанной (Рисунок В.6 г) и сильно вытянутой биполярной формы (Рисунок В.6 в). Единичные IIIтубулин окрашенные клетки имели небольшие округлые тела с длинными тонкими немногочисленными отростками (Рисунок В.6 д). Двойное окрашивание показало, что часть клеток, окрашенных на IIIтубулин, были позитивны по рековерину, который распределялся в цитоплазме в виде отдельных гранул (Рисунок В.6 в, г). Одновременно выделялись IIIтубулин - отрицательные клетки, вся цитоплазма которых была равномерно окрашена антителами против белка рековерина (Рисунок В.6 г). Относительное число IIIтубулин - и рековерин - позитивных клеток составляло 28,5% и 11,5% соответственно (Рисунок В.6 ж). Иммуноцитохимическая окраска клеток на Oct4 в данной культуре не наблюдалась.
Результаты показали, что в среде с низким содержанием сыворотки и в присутствии ростовых факторов наблюдались отличия в поведении клеток РПЭ. Использованные нами ростовые факторы усиливали пролиферацию клеток в культуре, что отмечали, и другие авторы [Schwegler et al., 1997; Yan et al., 2007]. В этой культуре была выявлена иммуноцитохимическая окраска против Pax6. Поскольку транскрипционный фактор Pax6 экспрессируется в нейроэпителиальных стволовых клетках [Osumi et al., 2008] и в нейральной сетчатке, но не в РПЭ [Kojima et al., 2008; Marquardt et al., 2001; Martnez-Morales et al., 2004], то наши результаты свидетельствовали о процессе дедифференцировки клеток РПЭ. Можно полагать, что Pax6 - экспрессирующие клетки были способны дифференцироваться в нейрональном направлении, поскольку в этой культуре одновременно была обнаружена многочисленная популяция IIIтубулин и рековерин-позитивных клеток.
При сопоставлении результатов исследования адгезивных культур, растущих в различных средах, мы пришли к заключению, что клетки РПЭ проявляют тенденцию к дифференцировке в нейрональном направлении независимо от состава использованной культуральной среды. В тоже время факторы bFGF и EGF повышают пролиферативную активность и стимулируют экспрессию Pax6, что значительно усиливает пластическую способность клеток. Появление Pax6 - позитивных клеток и резкое увеличение числа рековерин позитивных клеток в культуре указывает на то, что клетки РПЭ изменяются в нейрональном направлении.
Сферические клеточные агрегаты, полученные при культивировании клеток РПЭ 11.5 н.р. в среде с факторами bFGF, EGF и 1% FBS, состояли из пигментированных и частично депигментированных клеток (Рисунок В.5 в). ИЦХ анализ показал, что в цельных сферах клетки отличались от исходных отсутствием белка-маркера щелевых контактов Cx43 и, следовательно, утрачивали эпителиальные свойства (Рисунок В.7 а). Кроме того, сферы содержали большое число клеток окрашенных антителами против Oct4, однако транскрипционный фактор Pax6 в них не выявлялся (Рисунок В.7 в).
Дифференцировку клеток сфер проводили в нескольких экспериментах. В первом сферы переводили в так называемую дифференцировочную среду (без факторов и с 10% FBS), аналогично тому, как поступают с нейросферами из СПК мозга для стимуляции нейральной дифференцировки [Александрова и др., 2005]. Во втором эксперименте, сферы помещали в среду с факторами bFGF и EGF и с 10% FBS с дальнейшим добавлением кондиционированной среды (КС), полученной от нейросфер из стволовых и прогениторных клеток эмбрионального головного мозга человека.
В обоих экспериментах, под действием сыворотки, сферы оседали и прикреплялись ко дну культурального флакона, и клетки начинали активно с них мигрировать и пролиферировать (Рисунок В.5 г-е, В.7 а). На 9 сутки наблюдалось резкое снижение пролиферации (Рисунок В.7 б, ж) и активная дифференцировка, которая сопровождалось снижением Oct4 - позитивных клеток и окрашиванием части мигрирующих клеток антителами к транскрипционному фактору Pax6 (Рисунок В.7 г, ж). Клетки РПЭ из сфер и на 2 и 9 сутки демонстрировали способность дифференцироваться в нейрональном, а на 9е проявлялась дифференцировка в эпителиальном направлениях. Во всех культурах часть клеток окрашивалась на IIIтубулин и/или рековерин (Рисунок В.7 д, е), а другие (с эпителиальными свойствами) красились антителами против белка щелевых контактов Сх43 по всей полигональной поверхности клеток (Рисунок В.7 б). Важно отметить, что численное соотношение дифференцировки пронейральных и эпителиальных типов клеток существенно менялось под влиянием состава среды. В первом эксперименте, где сферы помещали в среду без факторов с 10% FBS, преобладала нейрональная дифференцировка клеток (63,5% рековерин - позитивных клеток и 17,95% Сх43-позитивных клеток) (Рисунок В.7 ж). Во втором эксперименте, где использовалась среда с факторами с дальнейшим добавлением кондиционированной среды, преобладала эпителиальная дифференцировка (процент Сх43 окрашенных клеток составил 52,34%, а рековерин – позитивных 8,95%) (Рисунок В.7 ж). Кроме того, в этой культуре сохранялась малочисленная популяция Oct4 позитивных клеток.
Результаты исследования сфер, возникающих при культивировании клеток РПЭ в среде с факторами bFGF и EGF, показали, что они состояли из разной степени пигментированных клеток, утративших эпителиальные свойства, среди которых было большое число Oct4 позитивных клеток. Экспрессия Oct4 может свидетельствовать о возращении на раннюю (плюрипотентную) стадию развития РПЭ клеток под влиянием факторов среды в условиях 3D культивирования. Стимуляция их дифференцировки обнаружила в клетках экспрессию Pax6, который, как известно, необходим для поддержания пролиферации и дифференцировки пронейральных клеток [Xu et al., 2007; Osumi et al., 2008]. Дифференцировка клеток РПЭ сфер в IIIтубулин, рековерин и Рах6 клетки предполагает их способность к развитию по нейрональному пути. Одновременно, в других условиях дифференцировки клетки сфер демострировали возвращение к исходному эпителиальному фенотипу, что свидетельствовало о сохранении способности редифференцировки в РПЭ.
Таким образом, результаты нашего исследования доказывают, что на ранних стадиях развития глаза человека (9-11.5 н.р.), РПЭ представляет собой гетерогенную популяцию клеток, в которой присутствует несколько подтипов клеток РПЭ, отличающихся по адгезивным свойствам, миграции, способностям к трансдифференцировке и по ответам на факторы микроокружения. В культуре одни клетки РПЭ устойчиво сохраняют эпителиальные свойства, другие демонстрируют фенотипическую пластичность, что выражается в изменении морфотипа и экспрессии белков нейробластов и фоторецепторных клеток. Другой подтип клеток РПЭ на среде с факторами формирует свободноплавающие 3D сферы, клетки которых проявляют мультипотентную дифференцировку.
Анализ фенотипической пластичности клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития, культивируемых в средах с высоким содержанием сыворотки
Разделенные нами адгезирующие клетки РПЭ в I и II субпопуляциях отличаются друг от друга по морфологическим признакам. В культуре I субпопуляции доминировали клетки фибробластоподобной морфологии, а во II - эпителиоподобной. Эти клетки отличаются по способности к миграции и адгезии. В веретеновидных клетках РПЭ культур I субпопуляции N -кадгерин в основном локализовался в цитоплазме, что может указывать на способность клеток к миграции. В то время как в клетках РПЭ II субпопуляции N - кадгерин концентрировался в местах межклеточных контактов. Клетки I субпопуляции обладают пониженной адгезией, что позволило их отделить от клеток II субпопуляции, во время пассирования. Однако, ИЦХ анализ показал, что клетки РПЭ как в I, так и во II субпопуляциях сохраняют потенции к нейральной дифференцировке. Так были обнаружены Рахб - и іПтубулин -, рековерин -, GFAP -, ТН -позитивные клетки. В культуре клеток I субпопуляции наблюдали нестин - позитивные клетки. Это было подтверждено ПЦР - анализом (Рисунок Г.1). Отличий в экспрессии генов Oct4 (POU5F1), Musashi 1, Рахб, Proxl и III /? Tubulin не было обнаружено в клетках РПЭ I и II субпопуляций, можно предположить, что клетки РПЭ разных субпопуляций обладают сходным патерном экспрессии генов, сходными потенциями. Но эти культуры показали отличие по экспрессии гена Nanog. Была показана его up-регуляция в культурах, где преобладали клетки эпителиальной морфологии. Можно предположить, что характер экспрессии Nanog является отражением потенций культивируемых клеток РПЭ к изменениям дифференцировки.
Однако, эти клетки по-разному реагируют на воздействие нейротрофических факторов. Например, CNTF увеличил число клеток РПЭ I субпопуляции, экспрессирующих ТН -специфичную для амакриновых нейронов, дофаминергических нейронов. BDNF значительно увеличивает экспрессию IIIтубулина в клетках РПЭ I субпопуляции, в которой преобладают клетки фибробластоподобной морфологии в среде без сыворотки, а в среде с 1% FBS – в клетках II популяции, эпителиальной морфологии.
При культивировании в направленных условиях можно вызвать процесс понижения уровня дифференцировки у всех клеток РПЭ глаза взрослого человека, независимо от их исходного фенотипа. В результате образуются свободноплавающие сферы, клетки которых Pax6-позитивные. При индукции дифференцировки клетки РПЭ из сфер демонстрируют потенции экспрессировать белки - маркеры нейрональной, глиальной и фоторецепторной дифференцировки. Часть клеток претерпевает редифференцировку, они приобретают эпителиоподобной морфотип и начинают экспрессировать Сх43. Выше описанное поведение клеток позволяет предположить, что клетки РПЭ отдельных субпопуляций - это одни и те же клетки РПЭ, находящиеся на разных уровнях дифференцировки, развития, они способны переходить с одного уровня на другой и обратно. Либо это все-таки отдельные субпопуляции, которые после стимуляции дифференцировки возвращаются к своему морфотипу.
Суспензионные культуры клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека О том, что клетки РПЭ глаза человека в культуре способны образовывать сферические агрегаты (сферы) в литературе известно мало. Есть несколько работ, одна из которых принадлежит Энгельгардт c коллегами [Engelhardt et al., 2005]. Авторы показали возможность образования свободноплавающей культуры из клеток сетчатки, цилиарной области и РПЭ глаза взрослой крысы. Авторы использовали среду с факторами bFGF и EGF с низким содержанием сыворотки, под воздействием которой часть клеток образовала адгезивную культуру, а другая – свободноплавающую.
Нам удалось впервые получить суспензионные культуры клеток РПЭ плодов и взрослого человека в среде с низким содержанием сыворотки в присутствии ростовых факторов bFGF и EGF [Милюшина и др, 2009, 2011]. Исследование сформировавшихся in vitro сфер РПЭ показало, что они состояли из слабо пигментированных клеток, утративших эпителиальные свойства. Впервые было показано, что в сферах находились недифференцированные клетки: Oct4–позитивные в сферах РПЭ плодов и Pax6-позитивные клеток в сферах РПЭ взрослого человека. Результаты свидетельствовали о том, что в условиях культивирования, пермиссивных для образования трехмерных сферических агрегатов происходит дестабилизация дифференцировки всех клеток РПЭ, вне зависимости от их исходных свойств. Однако сферы, полученные из РПЭ глаза плодов человека и сферы, полученные из РПЭ глаза взрослого человека, отличались способом получения и дальнейшим поведением клеток, после стимуляции дифференцировки. Сферические структуры РПЭ плодов человека были получены из самостоятельно отделившейся субполуляции на фоне адгезивно растущей культуры. В то время как сферические агрегаты РПЭ взрослого человека были получены в результате тотального перехода адгезивной культуры в свободноплавающую. После стимуляции дифференцировки, путем добавления в культуральную среду 10% сыворотки сферы адгзировали ко дну культурального флакона. Сферы РПЭ глаза плодов человека распластывались, клетки начинали активно пролиферировать и к 9 суткам представляли собой небольшие компактные эпителиоподобные колонии. После прикрепления ко дну из сфер РПЭ глаза взрослого человека начиналась активная миграция фибробластоподобных клеток (Рисунок Г.2) и только после достижения плотного монослоя часть клеток РПЭ возвращалось к исходному эпителиальному морфотипу. Рост клеток РПЭ глаза плодов человека напоминает рост эмбриональных СК, которые образуют плотные колонии с резко очерченными границами. При этом эти колонии представлены недиффференцированными клетками, а рыхлые – дифференцированными клетками [Klimanskaya, 2004]. Кроме того, полученные из РПЭ сферы схожи со сферами из клеток цилиарной области, но отличаются от нейросфер из клеток мозга по структуре и возможности быть пассированными [Poltavtseva et al., 2001; Engelhardt et al., 2005; Yan et al., 2007]. Важно, что при индукции дифференцировки клетки РПЭ из сфер демонстрировали потенции экспрессировать белки - маркеры нейрональной, глиальной и фоторецепторной дифференцировки.
Сравнение поведение клеток ретинального пигментного эпителия глаза человека на ранних стадиях развития и глаза взрослого человека in vitro
Клетки РПЭ плодов человека и РПЭ глаза взрослого образуют гетерогенную культуру. Часть клеток сохраняют эпителиальные свойства, другие же демонстрируют фенотипическую пластичность, и обладают фибробластоподобной морфологией. Однако стоит отметить, что до 10 н. р. человека в культуре клеток РПЭ преобладают клетки эпителиальной морфологии, после - в культуре резко возрастает число фибробластоподобных клеток. В культурах клеток РПЭ глаза человека 10,5, 11,5 н. р. и глаза взрослого человека наблюдается большое количество клеток фибробластоподобной морфологии. Можно предположить, что в популяции клеток РПЭ глаза человека с возрастом после 10.5 н. р. увеличивается доля клеток, которые способны к морфологическим изменениям и приобретению фибробластоподобной морфологии in vitro. Клетки РПЭ человека на всех исследуемых стадиях развития проявляют тенденцию к нейрональной дифференцировке независимо от возраста донора и использованной среды, что подтверждает экспрессия комплекса нейрональных белков - маркеров. Однако, способность клетками РПЭ экспрессировать IIIтубулин, рековерин в условиях культивирования зависит от возраста, так до 10.5 н. р. в клетках РПЭ in vitro эти белки не выявляются. Тем не менее, в культурах РПЭ 9 н. р. обнаруживали нестин, который является маркером НСК [ Lavado and Oliver, 2011]. Способность клеток РПЭ к морфологическим изменениям и экспрессии I IIIтубулина, рековерина связана скорее всего со степенью дифференцировки самих клеток. Развитие РПЭ напрямую связано с развитием сетчатки, и одним из ключевых моментов является контакт клеток РПЭ с фоторецепторами, после которого происходит их окончательная специализация. В сетчатке фоторецепторы появляются на 10 н.р. [Mann I, 1949; Milam A. H. et al, 2000]. Наши результаты показали, что после 10.5 н. р. в культуре поведение клеток РПЭ резко меняется.