Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8-44
1.1. Феномен провизорности в эволюционировании гисто-, органо- и системогенезов 9-23
1.2. Современное представление о репаративной регенерации с позиций принципа провизорности 23-35
1.3. Цитокиновая регуляция. Иммуногистохимические и молекулярно генетические исследования биологического субстрата .35-44
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 44-47
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований .47-98
3.1. Морфологическая характеристика репаративной регенерации кожи в условиях экспериментального дерматита и термического ожога 49-54
3.2. Морфологическая характеристика репаративной регенерации кожи на фоне лечения гелем «Эйковит» .54-66
3.3. Морфометрическая характеристика эпидермиса и дермы при заживлении дефектов кожи 67-98
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 99-107
Выводы 108
Библиографический список литературы .109-143
- Современное представление о репаративной регенерации с позиций принципа провизорности
- Цитокиновая регуляция. Иммуногистохимические и молекулярно генетические исследования биологического субстрата
- экспериментального дерматита и термического ожога
- Морфометрическая характеристика эпидермиса и дермы при заживлении дефектов кожи
Современное представление о репаративной регенерации с позиций принципа провизорности
Проблема провизорности и её место в становлении биологических субстратов тканевого и органного уровней иерархии была впервые обозначена с позиций соотношения дифференцировки провизорных и дефинитивных тканей П.П. Ивановым (1937). Вместе с тем П.П. Иванов не усмотрел в феномене «провизорность» особого механизма в развитии тканей и органов, не уделил должного внимания провизорности, как варианту морфофизиологического прогресса, который имеет универсальное филоонтогенетическое значение. Классическим примером реализации феномена провизорности явилась расшифровка поэтапного становления опорных тканей в эволюции и в процессе онтогенетических преобразований скелета организма, выполненная А.В. Румянцевым (1958). Изучение закономерностей становления осевого и конечностного скелета животных различного уровня эволюционирования позволило автору выделить в качестве одного из наиболее важных этапов развития органов скелета формирование хрящевых моделей, образованных гиалиновым эмбриональным хрящом. Благодаря исследованиям А.В. Румянцева и ряда других авторов сформировалось понятие о провизорном эмбриональном хряще (Соловьев Г.С., 1969; Павлова В.Н. и др., 1988; Зайдман А.М., 1989; Бахлыков Ю.Н., 2006; Martino C. et al., 1966).
Провизорной структурой органного уровня традиционно рассматривался мезонефрос – первичная почка (Кричинская Е.Б., 1965; Молчанова В.В., 1972, 1975; Koga A., 1972; Pelliiemi L.J. et al., 1983), Однако в отмеченных работах проблеме провизорности, как таковой, должного внимания не уделялось. Нельзя не сослаться на высказывание А.Г. Кнорре (1971) о необходимости разностороннего изучения тканей провизорных органов, что «обещает дать многое для понимания специфики их дифференцировки по сравнению с аналогичными дефинитивными тканями». Наиболее результативной оказалась серия исследований, проведенная учеными Тюменской морфологической школы, где не только была расшифрована роль феномена провизорности как адаптивного и морфогенетического механизма эволюционирования, но и впервые было сформулировано научное определение феномена: «Провизорность – это детерминированная способность эмбрионального зачатка и (или) его производных формировать на пути к дефинитивному состоянию временные структуры (ткани или органы), обеспечивающие выполнение жизненно важных функций в развивающемся организме и моделирующие механизмы развития и построения структурно-функциональных единиц на уровне дефинитивного субстрата (Соловьев Г.С. и др., 2004).
Следует отметить, что данное определение является не изначальным, где в качестве исходного субстрата была обозначена ткань, а не эмбриональный зачаток. Пионерные работы, в которых была представлена гамма вопросов относительно закономерностей морфогенеза на примере опорных тканей и органов мочеобразования (Бахлыков Ю.Н., 1973; Пантелеев С.М., 1994; Янин В.Л. и др., 2000), были затем продолжены и адресовались к изучению гисто- и органогенезов иных органов. Так А.В. Богдановым (2005) был изучен органогенез гипофиза человека. Автором продемонстрирована этапность в развитии аденогипофиза, выявлены стадии провизорного и дефинитивного развития.
На стадии провизорного органогенеза (12-14 стадии Карнеги - СК) моделируется инвагинат – карман Ратке. Дефинитивный органогенез реализуется в постсомитном периоде после «отшнуровки» кармана Ратке от полости стомодеума, повторяет механизм формирования инвагинатов в виде эпителиальных разрастаний трубчатой формы. Дифференцировка аденоцитов эпителиальной выстилки кармана Ратке характеризуется формированием 4 типов клеток, соответствующих по электронно-микроскопическим показателям (Стадников А.А, 1999) ацидофилам (соматотропы, мамматропы, маммасоматотропы), гонадотропам, тиреотропам, кортикотропам. Автору удалось также выявить, что в последующем осуществляется аналогичная дифференцировка аденоцитов в выстилке дочерних инвагинатов.
Известно, что эпителиоциты развивающегося аденогипофиза дифференцируются в нескольких направлениях, характеризующихся продукцией различных тропных гормонов и различной цитоморфологией. Молекулярные факторы, которые детерминируют дифференцировку аденоцитов, являются факторами транскрипции гена, кодирующего продукцию того или иного гормона. Эти факторы обусловливают три главных пути цитодифференцировки (Asa S.L. et al., 1999). В то же время большинство клеточных типов аденоцитов аденогипофиза способны к трансдифференцировке в другой тип (Taniguchi Y. et al., 2002). Соматотропоциты, лактотропоциты, соматомамматропоциты и тиреотропоциты имеют одного общего предшественника, который характеризуется экспрессией фактора транскрипции Pit-1. Линия кортикотропоцитов развивается независимо от других клеток аденогипофиза (Богданов А.В., 2005). Таким образом, к 20 СК в развивающемся эмбрионе человека формируется система контроля морфогенеза аденогепофиза на уровне генома, а в эпителиальной выстилке кармана Ратке предшественники всех типов эндокриноцитов.
В работе К.О. Шилина (Шилин К.О., 2010) был исследован феномен провизорности при развитии стомодеума человека. На 12 СК (25-27 суток от момента оплодотворения) в головном отделе зародыша определяется формирующийся головной мозг, нависающий над ротовой бухтой. Строятся очертания «крыши» и «дна» стомодеума. Крыша стомодеума на уровне гиоидной дуги и жаберные карманы выстилаются однослойным анизоморфным кубическим эпителием, жаберные щели - однослойным высоким призматическим. Было выявлено, что процесс изменения гистологической структуры жаберных дуг и эпителия стомодеума характеризуется проксимо-дистальным вектором. На 13 СК полость глоточной кишки на уровне фарингеальной жаберной дуги имеет форму равнобедренного треугольника с широким основанием, обращенным к глоссофарингеальной дуге, и вершину, ориентированную дорзально по направлению к хорде. На 14 СК (завершается сомитный период эмбриогенеза) цитоархитектоника клеток различных популяций в составе формирующегося выстилающего эпителия стомодеума свидетельствует о прохождении этапов провизорной дифференцировки, которые могут рассматриваться как феномен рекапитуляции тканевой организации филогенетических предков (ложно-многорядный, многорядный призматический, многорядный реснитчатый). Сохраняются остатки ротовой перепонки, карман Сесселя сглаживается, его эпителий постоянно обновляется за счет эпителия задней стенки кармана Ратке. При этом однослойный кубический эпителий преобразуется в двух- и многорядный, постепенно распространяясь в боковые стенки стомодеума. На 15 СК эпителий крыши стомодеума, прилежащий к карману Ратке, преобразуется в многорядный реснитчатый. На 16 СК эпителий крыши стомодеума в его центральной и каудальной частях сохраняет строение однослойного кубического, постепенно меняющего структуру тканевой организации в участках перехода на боковые стенки глоточной кишки. Дальнейшее наблюдение показало, что эпителий стомодеума вступает в новую фазу тканевой трансформации, в нем выявляются уплощенные клетки наружного слоя, не имеющие контактов с базальной пластинкой. Зоной формирования многослойного эпителия является граница кармана Ратке. Активным локусом в тканевой трансформации эпителия стомодеума является также зона контактов различных эмбриональных зачатков, участвующих в органогенезе языка.
Цитокиновая регуляция. Иммуногистохимические и молекулярно генетические исследования биологического субстрата
При приготовлении срезов для иммуногистохимического исследования выполняли ряд требований, необходимых для успешного проведения реакции: срезы были ровные, толщиной 4 мкм, расправлялись в теплой дистиллированной воде (+25оС) и не подвергались перегреванию, так как температура выше +56оС может разрушить антиген, что приведет к ложному результату реакции. Срезы после постановки гистохимической реакции докрашивались гематоксилином Майера, подвергали дегидратации, заключали в канадский бальзам.
Результаты иммуногистохимических реакций оценивали методом полуколичественного анализа: слабая очаговая реакция оценивалась (+) и обозначалась как слабая экспрессия; реакция средней интенсивности оценивалась (++) и обозначалась как средняя экспрессия; интенсивная реакция оценивалась (+++) и обозначалась как высокая экспрессия. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого антигена. При оценке экспрессии Ki-67 рассчитывали индекс пролиферации (Iki – 67) по формуле: I = (n+/N) x 100%, где n+ - количество меченых ядер, N – общее число ядер в базальном и шиповатом слоях в поле зрения микроскопа. Исследования проводили при Об.х100, Ок.х10 в 20-30 полях зрения среза (Ланичева А.Х.,Семченко В.В., Мурзабаев Х.Х., 2013).
Статистическая обработка результатов морфометрии проведена на персональном компьютере с использованием программы «Microsoft Excel» из пакета Microsoft Office XP с определением критерия достоверности по Стьюденту (для всех показателей p 0,05)
В литературе представлена обширная информация о морфофункциональной характеристике кожи и эволюции, онтогенезе, экспериментальных условиях и патологических состояниях. Уровень восстановительных процессов кожи и ее дериватов при действии различных факторов среды представляет собой результирующую сочетания биологических потенций морфологического субстрата, его способности к реализации эпигенетических проявлений и состояния дистантных и локальных механизмов регуляции кинетики клеточных, тканевых и органных структур. Одной из важных сторон расшифровки восстановительных процессов является сочетание производных всех дифферонов в оптимальном хроновекторе в соответствии с известными этапами репарации. Восстановление эпидермиса, его дериватов и производных мезенхимного генеза в конечном итоге выражается в преобладании дермального либо кожного типов регенерации или же обеспечивает реституцию пораженного субстрата (Ноздрин В.И., Барашкова С.А., Семченко В.В., 2005; Соловьев Г.С. и др., 2008).
Наблюдения за событиями, происходящими в коже после ожога, мы провели через призму реализации принципа провизорности в процессах репаративной регенерации в постнатальный период онтогенеза. Настоящее исследование было проведено с одной целью – обнаружить проявления провизорности не в период эпигенетических преобразований сложно устроенного органа во время пренатального периода, а отыскать свидетельства провизорности в период репарации поврежденного морфологического субстрата на тканевом и органном уровнях. Приступая к исследованию, мы отдавали себе отчет в том, что именно кожа с её сложным органным строением, «букетом» гисто- и органогенезов, могла бы послужить в качестве оптимального объекта для получения соответствующих результатов, наблюдений гистогенезов (становление эпидермиса и соединительной ткани) и органогенезов (кожа как орган с послойным построением эпителия, дермы, гиподермы; регенерация сальных желез и волоса). Отыскание основных преобразований кожи и ее дериватов после деструкции всех участников изучаемого явления, констатация гисто- и органогенезов в соответствии с принципом провизорности в очагах поражения было бы подтверждением сохранения провизорных потенций тканей и органов в постнатальном онтогенезе.
Анализ морфологических событий эксперимента проведен с учетом широко известного приема - наблюдение кожной раны на различных стадиях репаративной регенерации. Исследование препаратов «Эйковит» - это преднамеренное действие для подтверждения объективности существования провизорности – детерминированной способности производных эмбрионального зачатка. Анализ материала настоящего исследования проведен с позиции учения об органотипической детерминированности тканей, принципа провизорности и реализации морфогенетических корреляций в регенерирующем участке кожи. Воспалительные разрастания эпителиев в виде выстилающего и погружного типов были обнаружены в очаге пораженной кожи и характеризовались этапностью тканево- и органотипической дифференцировки. Инфильтративных разрастаний в материале не выявлено.
Первые – третьи сутки эксперимента характеризовались разрастаниями выстилающих пластов, инициация которых относится к участкам краевых дефектов поверхности кожи и сохранившихся фрагментов – «островков» в пограничных участках интактной и пораженной кожи. Воспалительная реакция дермальной основы трансформируется в продуктивную стадию, что сопровождается наряду с альтерантивными процессами регенераторными проявлениями. В участках с глубокими поражениями эпидермиса наблюдались феномены воспалительного генеза (вакуолизация, спонгиоз, акантоз). К концу первых суток эксперимента проявляется ответная реакция кожи на действие химического агента в виде защитных реакций эпидермиса, гиперемии сосудистого бассейна сосочкового слоя и отсутствием сосудистой реакции в глубоких слоях дермы.
К итогам первых суток эксперимента проявляется реакция кожи на действие химического и термического раздражителей, выявляется гиперемия, переполнение сосудистого бассейна сосочкового слоя, формирование кровоизлияний и вначале мелких разрозненных, а затем в виде общего струпа образований над участком ожогового поражения кожи. Сосудистая реакция глубоких отделов кожи была выражена при ожоге и отсутствовала при контактном дерматите. В эпидермисе при контактном дерматите отторгаются дифференцированные слои, оформляется нечеткая граница между ороговевшими и витальными слоями (рис. 1). При термическом ожоге воспалительные проявления выражены в большей степени. Экссудативные реакции в виде вакуолизации, спонгиоза, окантоза сопровождают термическое поражение клеток эпидермиса, начиная с ранних стадий эксперимента. При контактном дерматите реактивные изменения в пораженном эпидермисе определяются только к пятым сутках втирания химического раздражителя
экспериментального дерматита и термического ожога
Нам представляется, что данные сведения отражают детерминированность регенераторных процессов эпидермиса и подтверждают прохождения гистогенезом основных этапов становления морфологического субстрата. Незначительные подъемы показателей площадей цитоплазмы клеток шиповатого слоя на 3, 5, 7, 15, 20 сутки являются «зеркальным» отражением отмеченного показателя базальных кератоцитов, что свидетельствует о стабилизации процессов цитодифференцировки, формирования провизорной структуры кожного эпителия и повторения этапов эмбрионального гистогенеза. Графики отражают не только закономерности эпителизации раневой поверхности, но и состояния адаптивных реакций организма, которые реализуются через механизмы конвергенции клеток эпидермальных дифферонов, сохранения принципов цитоархитектоники, формирования провизорного этапа гистогенеза эпидермиса. В тех случаях, когда были нарушены процессы заживления дефекта кожи и не формировались эпителиальные выстилающие пласты, исследовать состояние цитоплазмы кератоцитов не представлялось возможным, а в композитах струпов сложного строения был отмечен феномен отклонения этапов гистогенеза эпидермиса и провизорных эпидермальных структур не обнаруживалось. Последнее позволило сделать вывод об обязательности провизорного этапа гистогенеза как гаранта реализации компетенции производного эмбрионального зачатка к дальнейшему формированию дефинитивного субстрата. Выявленные картины преобразования морфологического субстрата при репаративной регенерации соответствуют теоретическим положениям о существовании тканей как морфологической структуры только на этапе провизорного гистогенеза (С.М. Пантелеев, Г.С. Соловьев, В.Л. Янин, 2008; Г.С. Соловьев и др., 2011).
При рассмотрении вопросов состояния репаративной регенерации тканей невольно становится необходимым сослаться на известные положения «об автоматизированных биологических системах» по Б.П. Токину (1966), согласно которому организация живых систем укладывается только в две формы клеточную и организменную, а тканевые структуры следует рассматривать в контексте промежуточного этапа при построении дефинитивного субстрата. Категория «ткань» до сих пор не получила общепризнанного научного номенклатурного звучания, что подкрепляется отсутствием формулировки «ткань» в международной гистологической номенклатуре (Terminologia Histologica, 2009). Подобно тому как в раннем эмбриональном периоде когда еще не происходит выделения органных структур и формирования органов находится на предшествующих этапах, когда оформляются «презумптивные автоматизированные биологические системы», в экспериментах по моделированию органо- и гистогенезов кожи и ее дериватов выявляют тождественные системы, становление которых сопровождается построением структурной организации провизорного этапа гистогенеза, в том числе гистогенеза эпидермиса. Изначально сформировавшись как монодифферонная структура, представленная кератоцитами, эпидермис затем усложняет свое строение за счет миграции клеток иного генеза, конвергенция которых и обеспечивает дефинитивный уровень организации кожного эпителия. Вместе с тем основным признаком эпидермальных эпителиев является многослойность, поэтому обнаружение многослойности может быть взято за показатель реализации детерминированности формирующейся ткани и построения структуры провизорного уровня. Несмотря на то, что в задачах нашего исследования не озвучено наблюдение за клетками эпидермиса некератоцитарных дифферонов, в работе прослежены процессы органогенеза сальных желез и волос, начальные стадии которых связаны с построением недифференцированных органотипических структур – зачатков дериватов в виде почек и тяжей погружного роста. Неоднозначность морфометрических характеристик кератоцитов базального и шиповатого слоев, кластерный вариант локализации клеток формирующихся зачатков дериватов являются косвенными показателями трансформации провизорного этапа гистогенеза кожного эпителия в дефинитивный. Морфометрия площади ядер клеток базального и шиповатого слоев дополняет информацию о состоянии эпидермального регенерата и отражает феномен генеративности и дифференцировки формирующегося выстилающего пласта (рис. 47, 48).
Динамика количественных показателей и формы итоговой кривой линии на стадиях эксперимента повторяет закономерность наблюдаемых преобразований площади цитоплазмы этих же клеток. Акрофазы на 5, 7, 10, 15 суток, смещение заключительного пика на 5 суток ядер кератоцитов шиповатого слоя, повторение подъемов и спадов уровня площади ядер дифференцирующихся кератоцитов подтверждает этапность формирования регенерата и участия эпидермального пласта в процессах морфогенеза кожи как органа.
Морфометрическая характеристика эпидермиса и дермы при заживлении дефектов кожи
Динамика CD3 позитивных клеток в эпидермальном регенерате подтверждает значимость феномена конвергенции при трансформации провизорного субстрата в дефинитивный. CD3 клетки, являясь обыденным компонентом зрелого эпидермиса, начинают выявляться только в пласте, начиная со стадии 7 суток опыта (табл. 9), причем только в том случаи, если пораженный участок обрабатывался препаратами ненасыщенных жирных кислот. Не исключено, что препараты «Эйковита» способствуют миграционной активности Т-лимфоцитов. Выявление CD3 клеток в формирующейся дерме указывает на закономерный транспорт Т-лимфоцитов из ткани внутренней среды в эпидермальный регенерат. Поэтому на стадии 7 суток эксперимента CD3 позитивные клетки выявлялись в материале всех серий опытов. При этом наибольшее их содержание находилось в сериях с использованием «Эйковита» (табл. 10) – 41,22±0,73 при химическом ожоге и 42,31±0,23 при термическом ожоге.
В то же время в сосочковом слое регенерата без «Эйковита» их содержание было 24,5±0,61 (при химическом ожоге, р 0,01) и 28,46±0,32 (при термическом ожоге, р 0,001). Анализируя результаты иммуногистохимических исследований, мы пришли к убеждению, что при заживлении дефекта кожи важная роль принадлежит клеткам дифферонов различного генеза, конвергенция которых обеспечивает формирование провизорных структур (недифференцированный эпидермальный пласт и грануляционная ткань) и их последующую трансформацию в дефинитивное состояние. Сохранение более высокого уровня пролиферативной активности клеток эпидермального регенерата при использовании препаратов «Эйковит» оценивается нами как тропное влияние препаратов «Эйковит» на участников клеточных коопераций в дифференцирующемся эпидермисе и выполнение функций локального регуляторного фактора процессов гистогенеза в очаге репаративной регенерации. CD1-позитивные клетки обычно локализуются в базальном слое эпидермального регенерата, однако могут передислоцироваться в шиповатый слой, сохраняя при этом основные морфологические признаки внутриэпидермальных отростчатых макрофагов. Отростки клеток Лангерганса лежат в слое кератиноцитов, где они располагаются сами, то есть имеют горизонтальную направленность. Вместе с тем, часть отростков распространяется в вертикальной плоскости и проникает в шиповатый слой эпидермиса или в подлежащую формирующуюся дерму – сосочковый слой. Посттравматическая регенерация эпидермального пласта при конвергентном механизме непременно сопровождается закономерной динамикой содержания CD1-позитивных клеток, которые может быть объективным критерием оценки тканево- и органотипической дифференцировки эпидермального пласта.
Содержание Ki-67 позитивных клеток в формирующихся сальных железах также подтверждает значимость препаратов «Эйковит» в ускорении процессов реализации органотипической детерминированности регенерирующего эпидермиса, что проявляется в построении свободно открывающихся на поверхности кожи сальных желез на стадии эксперимента до формирования желез, связанных с волосяными фолликулами (табл. 3). Следует подчеркнуть, что в опытах с термическим ожогом пролиферативная активность себоцитов была всегда выше, чем в опытах с химическим ожогом. Для примера: к 20 суткам эксперимента при химическом ожоге показатели пролиферативной активности клеток сальных желез составили 20,32±0,61 без
«Эйковита» и 48,56±0,23 с «Эйковитом» (р 0,01); при термическом ожоге соответственно эти же показатели были 22,31±0,36 без «Эйковита» и 58,23±0,81 с «Эйковитом» (р 0,001) (табл. 3).
Уровень содержания CD1-клеток в эпидермисе, сальных железах, волосяных фолликулах, формирующейся дерме позволяет продемонстрировать взаимодействие клеток эпидермального и мезенхимного генезов в процессах репарации кожи (табл. 6, 7, 8, 9, 10). Неодинаковое содержание CD3-клеток в эпидермисе и сосочковом слое дермы демонстрирует участие Т-лимфоцитов в гистогенезах эпителиального и соединительно-тканного компонентов кожного регенерата (табл. 9, 10). Наиболее четко определяется участие CD3-клеток в становлении соединительно-тканной основы регенерата. На этапах репарации, начиная со стадии 7 суток, содержание CD3-позитивных клеток поддерживается на высоком уровне (табл. 10). При этом наиболее значимые различия выявляются на стадии 7 суток опыта – 24,53±0,61 без «Эйковита», 41,22±0,73 с «Эйковитом» (р 0,001) при химическом и 28,46±0,32 (без «Эйковита»), 42,31±0,23 (с «Эйковитом») (р 0,001) при термическом ожогах.
Таким образом, иммуногистохимические исследования намного расширили комплекс информации о закономерностях посттравматической регенерации кожи и позволил подтвердить активное участие клеток производных эктодермального дифферона и клеток дифферона мезенхимного генеза в процессах гисто- и органогенеза при репаративной регенерации кожи и её дериватов.
Содержание клеток Лангерганса было неодинаково на стадиях репарации в слоях эпидермиса и подлежащей дермы в разных сериях опыта. Закономерным оказалось реципропное соотношение клеток CD1 и пролиферативной активности кератиноцитов в регенерирующем эпителиальном пласте. Выявление клеток Лангерганса на 7 сутки эксперимента в нарастающих эпидермальных регенератах от неповрежденных участков кожи в зону заживления раны подтверждает существующее мнение о регуляторной функции клетки Лангерганса в процессах дефинитивной дифференцировки эпидермального эпителия (Маркелова П.П. с соавт., 2013; Маркелова П.П., 2014; Миллер Л.Г., 2004; Ланичева А.Х., 2010; Ноздрин В.И., Барашкова С.А., Семченко В.В., 2005; Ланичева А.Х., 2013; Графова Г.Я., 1982). При ожогах клетки Лангерганса могут служить показателем состояния тканево- и органотипических проявлений формирующегося эпидермального пласта и его метаморфоза на этапах эксперимента. Выявление при помощи иммуногистохимических реакций CD1 – клеток на ранних стадиях формирования кожного регенерата в выстилающем эпителиальном пласте и подлежащих грануляционных разрастаниях свидетельствуют о детерминации процесса конвергенции клеток производных дифферонов различной генетической природы при заживлении кожного дефекта по механизму реституции.