Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8-41
1.1. Современное представление о значении феномена конвергенции в морфогенезах 8-16
1.2. Система регуляторных механизмов миграционных клеточных потоков и конвергенции клеток производных эпителиальных и мезенхимальных дифферонов .16-32
1.3. Феномен конвергенции при репаративной регенерации и в условиях культур “in vitro”, “in vivo”.. 32-40
Глава 2. Материалы и методы исследования 41-45
Глава 3. Результаты собственных исследований 45-104
3.1. Динамика миграционных потоков и конвергенции первичных половых клеток при формировании мезонефрально-гонадного комплекса эмбриона человека .45-70
3.2. Динамика конвергенции производных эпидермального и мезенхимального дифферонов при заживлении дефектов кожи после термического и химического ожогов и кожной раны (эксперимент) 71-82
3.3. Феномен конвергенции на фоне продуктивного воспаления желчных протоков при экспериментальном суперинвазионном описторхозе 83-100
Заключение 100-102
Выводы 103 список литературы 104-131
- Система регуляторных механизмов миграционных клеточных потоков и конвергенции клеток производных эпителиальных и мезенхимальных дифферонов
- Динамика миграционных потоков и конвергенции первичных половых клеток при формировании мезонефрально-гонадного комплекса эмбриона человека
- Динамика конвергенции производных эпидермального и мезенхимального дифферонов при заживлении дефектов кожи после термического и химического ожогов и кожной раны (эксперимент)
- Феномен конвергенции на фоне продуктивного воспаления желчных протоков при экспериментальном суперинвазионном описторхозе
Система регуляторных механизмов миграционных клеточных потоков и конвергенции клеток производных эпителиальных и мезенхимальных дифферонов
Изучение молекулярных особенностей регуляторных систем эндогенного контроля динамики субъектов дифферонов и последующего формирования клеточных коопераций эмбриональных зачатков тканей и органов позволяет проанализировать хроновектор дифференцировки и итоговое состояние клеток – участников морфогенеза (Хлебникова А.Н., 2016). К настоящему времени сложились школы-лаборатории, представители которых наиболее активно внедряют иммуногистохимические исследования и устанавливают наиболее эффективные формы в рамках системы «наука-прагматизм». К подобным центрам можно смело отнести коллективы гистологов Уральского Государственного Медицинского Университета (заведующий кафедрой гистологии – профессор С.В. Сазонов) (Сазонов С.В., 2012; Сазонов С.В. и др., 2011) и Пермского Государственного Медицинского Университета (руководитель группы исследователей – профессор Лебединская О.В.) (Лебединская О.В., 2011).
В частности, группа Лебединской внесла большой вклад в изучение морфофизиологии иммунокомпетентных клеток кроветворных органов и внутриэпидермальных дендритных клеток – макрофагов, их развития и локализации в слоях эпидермиса (Лебединская О.В., 2010а,б; 2011).
Установление межклеточных контактов формирования «соклетий», в конечном итоге, обеспечивает разнообразные преобразования морфологического субстрата с построением тканей и органов, начиная с эмбриогенезов, постнатальных процессов морфомеханики и регенерации (Белоусов Л.В., 2017).
Результаты, полученные при изучении гидрополипов, показали целый спектр морфогенетических потенций клеточных коопераций и выставили «на повестку дня» некоторые сомнения: а не существует ли аналогичная роль взаимодействия и в других группах животных? Авторы приходят к выводу, что и эмбриомеханика также «пронизана» подобными преобразованиями. Несмотря на то, что одним из постулатов исследования коллектива лаборатории биофизики развития МГУ следует считать расшифровку физических факторов эмбрионального развития, с повестки не снят феномен способности «лепить» изящные формы десятками клеток, расположенных на «верхушках» зачатков (Евстифеева А.Ю., 2016). Фактически, отмеченный механизм распространяется на морфомеханику нефроногенеза, формирование зоны роста конечного мозга, «шапочки Балинского» при изучении преобразований производных жаберного аппарата человека в эмбриональном периоде пренатального онтогенеза. В частности, при анализе превращения жаберного аппарата было выявлено формирование подобной структуры на проксимальной поверхности мандибулярной дуги (Идрисов Р.А., 2012; Соловьев Г.С., 2015). На этой же стадии дорзальная поверхность мандибулярной дуги характеризовалась однослойным столбчатым эпителием и кубическим на нижней стенке, свисающей над перикардом. На 13 стадии Карнеги эпителий жаберных дуг заселяется элементами дифферонов мезенхимного генеза и приобретает полидифферонную организацию (Идрисов Р.А., 2014).
Довольно демонстративно проявления межклеточных морфологических и функциональных контактов реализуется на этапах тканевой дифференцировки эпидермиса (Белова О.В., 2008; Алексеев А.Г., 2009; Кузнецов С.Л., 2012; Black A.P.B., 2008; Chen N., 2010). Сведения о соотношении клеточных форм эпидермиса отражают не только процессы развития кожного покрова, но и становление защитных механизмов органа и всего организма в целом. Например, внедрение Т-лимфоцитов в развивающийся или регенерирующий эпидермис связывают с вступлением формирующейся ткани в период полидифферонного строения, установления регуляторных связей между внешней средой и организмом (Караулов А.В., 2011; Buchan A.S., 2008; Feingold K.R., 2008). Суть популяции Т-лимфоцитов – хелперы, клетки памяти, цитотоксические и регуляторные, внутриэпидермальные лимфоциты – способны распознавать микробные антигены, вещества белковой и углеводной природы, которые продуцируются кератиноцитами при тепловом шоке, участвуют в регуляции иммуногенеза кожи (Мяделец О.Д., 2006). Особенно важным отмечаются факты участия внутриэпидермальных лимфоцитов в регуляции пролиферативной активности клеток иных дифферонов, участвующих в формировании эпителиального пласта, а также элеминации опухолевых или пораженных вирусом клеток (Ярилин А.А., 2003; Hachem J.P., 2006; Schauber J., 2008; Ovaere P., 2009). Около 95% клеточной массы эпидермиса составляют кератиноциты. Клетки имеют интердигитации, десмосомы (до 2000 в каждой клетке), устанавливают прочные связи. Хорошо также развиты контакты за счет адгезивных белков – подплазменных типа плакоглобина и десмокалина, участвующих в фиксации тонофиламентов в зоне десмосом, а также десмокальмина, функция которого заключается в фиксации промежуточных филаментов к плазмалемме кератиноцитов (Akiyama M., 2005). Стволовые клетки эпидермиса содержатся в базальном (в толстой коже) или базальном и шиповатом (в тонкой коже) и на протяжении 80 недель не переходят в пролиферативный пул. Подобный хроновектор характерен для стволовых клеток волосяных фолликул (Morizane S., 2010). Иммуногистохимические тесты кератин-19, интегрин-1, белок р63, позволяют идентифицировать стволовые клетки, выявить их переход в состояние иных клеточных форм (Pellegrini G., 2001). Кератиноциты участвуют в синтезе фактора ангиогенеза, фактора роста фибробластов, инсулиноподобного и эпидермального факторов роста, обеспечивают контроль за миграционными перемещениями практически всех клеточных форм кожного эпителия (Kalinin A., 2001; Pivarcsi A., 2004). Признанное мнение о происхождении тактильных эпителиоцитов из нервного гребня отчасти противоречит сторонникам эпидермального генеза клеток Меркеля. Последнее базируется на выявлении кератиновых филаментов, образованных цитокератином-20. Вторым тезисом в пользу эпидермального генеза тактильных клеток служит мнение о роли стволовых клеток эпидермиса (Sidhu G.S., 2005; Van Keymeulen A., 2009). Внутриэпидермальные макрофаги – клетки Лангерганса (CD1) – составляют около 3% клеточного массива эпидермиса, однако, ввиду их активной функциональной деятельности, влияют не только на механические свойства пласта, но и участвуют в регуляторной системе физиологической и репаративной регенерации кожного покрова, в формировании оригинальных механизмов тканевой дифференцировки. Выполняя роль хелперов, CD1 – клетки вовлекают в ответную реакцию лимфоциты и инициируют иммунные реакции. Имея гемопоэтический генез, эти клетки мигрируют в эпидермис, приобретают специфические маркеры и подтверждают значение феномена конвергенции в морфогенезах. Витальный цикл CD1 клеток продолжается около 3 недель, в течение которых они успевают реализовать весь спектр потенций, в том числе выполнить роль организаторов эпидермальных пролиферативных единиц (Satter K., 2008; Hurtley S.M., 2010). Считается, что эпидермальные пролиферативные единицы эпидермиса кожи человека представляют столбик из 10 базалиоцитов, 20 клеток шиповатого слоя, 3-4 зернистого слоя, 5-7 рогового слоя. В одном мм эпидермиса тонкой кожи находится от 200 до 700 CD1 клеток, в толстой коже около 50 (Кузнецов С.Л., 2012). Одной из весьма важных функций CD1 клеток является продукция лангерин – субстрата, блокирующего генерализацию вирусной инфекции (Valladean J., 2003; De Witte L., 2007). Показано также, что CD1 активируют Т-хелперы и переводят их в состояние CD4+ (хелперы) и CD8+ (киллеры), а зрелые Т-хелперные клетки в плазмоциты (Ярилин А.А., 2003; Black A.P.B., 2008). Таким образом, процессы становления важного элемента системы иммунозащиты, коим является кожный эпителий, обеспечивается проникновением в формирующийся эпидермис клеток дифферонов мезенхимного генеза наряду с исходным кератиноцитарным диффероном. Все без исключения миграционные перемещения клеток в эпидермальном пласте и подлежащей соединительной ткани (или в мезенхиме в эмбриональном периоде) подчеркивают важность феномена конвергенции и его роль в гисто- и органогенезах.
Сигнальный путь Wnt (СП Wnt) – филогенетически наиболее древний механизм, регулирующий процессы развития гомеостаза и обеспечивающий контроль процессов клеточной пролиферации, дифференцировки, апоптоза и миграционных перемещений (Гребенникова, 2016). Состояние канонического сигнального пути является зеркальным отражением процессов гисто- и органогенеза в эмбриональном и постнатальном онтогенезе, каждый из этапов которого сопровождается контролирующими сигналами. Нарушения подобных сигналов приводит к сбою в реализации морфогенезов, в том числе и в сфере механизмов конвергенции. Специфичность клеток, их миграция и формирование полярности также являются показателями этапности сигнального канонического пути (Гурская, 2015).
Динамика миграционных потоков и конвергенции первичных половых клеток при формировании мезонефрально-гонадного комплекса эмбриона человека
Феномен конвергенции возможных участников морфогенезов на этапах индивидуального развития или на фоне процессов репарации заслуживает внимания научного сообщества хотя бы потому, что он является объективным показателям трансформации клеточного состава формирующейся структуры. Итогом формирования клеточных коопераций на этапах органогенезов или при образовании регенератов является качественная перестройка провизорного субстрата в дефинитивный, формирование структурно-функциональных единиц при развитии органа или состояния реституции после репаративной регенерации.
Несмотря на хорошую информативную основу закономерности репарации и морфогенезов, характеристика феномена конвергенции требует более пристального анализа, конкретизации значения хроновектора и направления миграционных потоков в локусы организма, реализующие детерминированные морфогенетические потенции биологического субстрата (Пантелеев СМ., 2014; Идрисов Р.А., 2016; Шидин В.А., 2017).
Набор материала для изучения феномена конвергенции при развитии яичника женщины мы в силу объективных причин смогли начать со стадии 12 СК. В первую очередь это обусловлено информацией от беременной женщины, а затем ошибки диагностики в сроках беременности. В конечном итоге, вместо 8 недельного зародыша, у нас появилась возможность исследовать эмбриона человека, биологический возраст которого составлял 25-27 суток. В данном разделе главы представлены материалы, соответствующие паспорту специальности 14.03.01 – анатомия человека (медицинские науки). Материал соответствует областям исследования № 3, № 4, № 7.
Согласно сведениям научной литературы на отмеченной стадии у зародыша активно протекают процессы органогенезов в головном и туловищном отделах (Шилин К.О., 2010; Шидин В.А., 2017). На 12 СК эмбрион человека имеет длину 4-4,5 мм и состоит из трех отделов: головного, туловищного и хвостового приблизительно одинаковых размеров. При внешнем осмотре четко выделяется голова, жаберный аппарат, пупочно-сердечный выступ, мезонефральные тяжи на вентральной стороне хвостовой части. В жаберном аппарате оформлены мандибулярная, гиоидная и глоссофарингеальные дуги. Фарингеальная дуга значительно меньших размеров, но выделяется в виде парного бугорка, отделенного жаберными щелями от туловища и глоссофарингеальных дуг.
Дорзальный контур тела зародыша овальной формы. Имеет «шейные» углубления – участок «шейной» петли, которая располагается в зоне перехода головного отдела в жаберный аппарат (рис. 1).
На 12 СК завершаются процессы нейруляции, нивелируется задний нейропор, хордальный тяж диссоциируется, пузырчатые клетки хондроидной ткани расселяются в подлежащую мезенхиму, ствол мозга ростральным отделом приближается к телу зародыша (рис. 2).
Промежуточный мозговой пузырь становится одним из определяющих факторов морфогенезов в головном отделе. Стомодеума представлен ямкой, дорзальная стенка которой вступает в контакт с нейроэктодермой промежуточного мозгового пузыря, продолжаются процессы формирования кармана Ратке. Стомодеально-фарингеальная мембрана в центральной части к отмеченной стадии эмбриогенеза разрушена, сохраняются её остаточные участки в пристеночном отделе. Карман Сесселя не сглажен, имеет вид углубления в зоне перехода устья кармана Ратке на дорзальную сторону глоточной кишки.
Промежуточная мезенхима на 12 СК является субстратом организма зародыша, в котором стремительно осуществляются миграционные клеточные перемещения, гисто- и органогенезы. На сомитных стадиях (12-14 СК) формируется мезонефрально-гонадный комплекс – основной локус развития женской гонады. Сегментированная мезенхима становится источником построения первичной почки, её структурно-функциональных единиц мезонефронов и гонадного компонента аортально-мезонефрально-гонадного комплекса (рис. 3).
На горизонтальном срезе в теле зародыша определяется дорзальный комплекс осевых органов: нервная трубка, хорда, аорта, туловищная кишка, дорзальная брыжейка и первичные почки. Вентральная брыжейка атрофирована, сохраняются её небольшие участки, выступающие во вторичную полость тела. Мезонефрально-гонадные комплексы имеют вид валиков, обращенных в целом
На отмеченной стадии мезенхима периферического и центрального отделов МГК характеризуется принципиально идентичным строением. Содержит равномерно распределенные в ткани клетки и переходит без резких границ в мезенхиму туловищного отдела в зоне расположения дорзальной аорты и хорды. Формирование мезонефронов протекает по кранио-каудальному инградиенту и сальтаторно, то есть по принципу “de novo” (рис. 6).
Процессы морфогенеза в периферической и центральной зонах МГК протекают параллельно. При этом гонадный компонент характеризуется трансформацией эпителиального покрова и наличием в его составе ППК. Клетки мезотелия в это время из плоских преобразуются в столбчатые, а в подлежащую мезенхиму мигрируют клетки полового дифферона с последующей фиксацией либо продвижением через эпителиальный покров в целомическую полость. Процесс проникновения ППК в целом мы обозначили как «провизорная овуляция», так как половые клетки не прошли полного цикла развития, и только их миграционная способность может обеспечить проникновение в целом. Возможность перемещения ППК во вторичную полость на отмеченной стадии эмбриогенеза не удивительна, так как одновременно в целоме обнаруживаются клетки гемопоэтических дифферонов. Весьма важным является также способность ППК к амебоидным движениям (Кожухарь В.Г., 2011). Изучая процессы перемещения ППК в теле зародыша, мы убедились в том, что предложенная А.Г. Кнорре и его учениками концепция миграции ППК из основания аллантоиса в заднюю кишку по кровеносным сосудам и мезенхиме дорзальной брыжейки является, пожалуй, самым реальным механизмом «оккупации» тела зародыша. Таких же взглядов придерживаются Волкова О.В. с соавторами (Семенова-Тян-Шанская А.Г., Кнорре А.Г., 1972; Волкова О.В., Боровая Т.Г., 1999).
Тинкториальные показатели ППК позволяют проследить их локализацию по мере миграционных перемещений. Уже на 12 СК в мезенхиме и эпителии дорзальной брыжейки выявляются клетки полового дифферона дискретной локализации. Их проникающая способность настолько значительна, что они могут обнаруживаться в составе серозных оболочек формирующихся органов (перикарде). На 13 СК содержание ППК становится значительным, и они оккупируют не только зоны «полового валика» (гонадный компонент МГК), но близлежащую стенку целома на значительном протяжении (рис. 7).
Динамика конвергенции производных эпидермального и мезенхимального дифферонов при заживлении дефектов кожи после термического и химического ожогов и кожной раны (эксперимент)
Проведя изучение конвергенции в эмбриогенезе на примере развития яичника человека, мы поставили задачу: проследить значимость конвергенции в осуществлении процессов репарации. Одним из удобных вариантов решения данной задачи является исследование восстановление кожи и её дериватов после ожогов и ран. Дефекты кожи, которые сопровождают человека на протяжении всей жизни и особенно часто бывают у детей в связи с поведенческими особенностями возраста, остаются важной проблемой в клинике дерматологии, педиатрии, комбустиологии, хирургии. Процессы заживления дефектов кожи сочетают ряд механизмов цитокинетики, дифференцировки, участие производных дифферонов различного генеза в сложном течении репаративной регенерации, закрытие кожной раны или ожоговой поверхности, восстановление пораженного участка в полном объеме – реституция, или же ограниченном – субституция с позиции органной характеристики кожи и её дериватов (Данилов Р.К., 2008; Кирик О.В., 2009;Ланичева А.Х., 2010).
Конвергенция клеточных типов при формировании кожи как органа протекает в пренатальном и постнатальном периодах жизни человека. При чем следует отметить, что при развитии кожи становление эпидермиса, соединительно-тканных слоев и дериватов осуществляется на фоне построения клеточных коопераций, в состав которых входят производные эктодермального и мезенхимального генезов, установление особенностей паракринных регуляций и тех функциональных нагрузок, без которых не может состояться гито- и органогенез. Важно отметить, что только соблюдение хроновектора конвергенции каждого типа клеток может обеспечить реализацию полноценного морфогенеза (Мяделец О.Д., 2006; Ноздрин В.И., 2008). Например, известно, что клетки Лангерганса (CD1), которые лежат в основе формирования колончатой структуры эпидермиса – эпидермально-пролиферативной единицы – обеспечивает поддержание популяций дифферонов на оптимальном уровне, тем самым фукнционирующего состояния кожи как органа. Обнаружение CD1 в эпидермисе человека на 6-7 неделе эмбриогенеза является объективным свидетельством участия этих клеток в гистогенезе кожного эпителия. К завершению сроков первого триместра беременности (12 недель фетогенеза) плазмалемма CD1 клеток достигает полноценного уровня антигенного набора (Hashimoto, 2000). Исходя из создавшейся ситуации, мы не стали исследовать феномен конвергенции на этапах органогенеза кожи у эмбриона человека, хотя имели фактический материал, а провели наблюдение над заживлением кожи в эксперименте.
Классическим примером исследования репаративной регенерации является наблюдение за процессом заживления раневых дефектов и, в частности, заживления ожогов кожи и теми вариантами репарации, которые определяются механизмами формирования клеточных кластеров, коопераций стартового состава и их последующей органотипической трансформацией.
Данный прием расширил набор объектов для изучения феномена конвергенции. Заведомо ориентируясь на известные труды авторов, изучавших регенерацию кожи, мы обошли вниманием известные факты, в том числе периодичность и варианты кожной регенерации (кожный и дермальный типы). Основное внимание в нашем исследовании было уделено особенностям конвергенции клеток при заживлении дефекта кожи после трех неравнозначных форм травматизации: термического ожога, химического ожога и кожной раны.
Заживление кожных ран и ожогов осуществляется в соответствии с закономерностями репаративной регенерации и протекает по одному из трех вариантов: первичное заживление, вторичное заживление, заживление «под струпом». При анализе гистологических картин становления кожного регенерата был выявлен весьма важный показатель – очередность вовлечения клеток производных эктодермальных и мезенхимальных дифферонов в состав эпителиальных и соединительно-тканных органотипических структур.
В частности, была классифицирована система хроновектора конвергенции клеток различных дифферонов и сопутствующая этим процессам трансформация регенерата. Проявлениями позитивной динамики структурной организации кожного регенерата оказались стадии репарации, на которых в составе эпителиального компонента методами иммуногистохимического исследования выявлялись CD1 и CD3 (клетки лимфоцитарного дифферона). Отмеченное состояние трактовалось как период завершения провизорной стадии регенерации и продвижение регенераторного процесса в стадию формирования дефинитивного состояния регенерата. При ожогах II степени, когда поражаются эпидермальный пласт, дериваты, сосочковый и сетчатый слои дермы, но не поражаются более глубокие структуры (гиподерма и скелетные образования), удается более четко проследить стадийность репарации и состояние конвергенции на конкретных сроках заживления дефекта.
Первые трое суток после ожогов и кожной раны развивается воспаление с обязательными компонентами – альтерации, отека, адаптации сохранившихся структур органа к новым условиям трофики, слущиванием дифференцированных слоев кератиноцитов, диапедезом форменных элементов крови, формированием мелких кровоизлияний, оформлением струпа. В составе струпа выявляли корни волос, компоненты оболочек волосяного фолликула, содержимое разрушенных секреторных отделов сальных желез. В краевых участках раневого дефекта отмечали многочисленные эпителиальные регенераты, нарастающие на сгустки фибрина. К концу 3 суток воспаление переходит в фибробластическую (продуктивную) стадию, начинается становление соединительно-тканного компонента регенерата.
Одним из удобных приемов для констатации феномена конвергенции является исследование иммунокомпетентных клеток, выявление которых позволяет определять их топику на различных стадиях репаративного процесса.
Раневой процесс – это целая система защитных реакций, начиная от повреждения и завершая восстановлением, между которыми находится основная фаза раневого процесса – воспаление. С морфологических позиций замещение дефекта кожи протекает эстафетно через этапы воспаления, пролиферации, формирование рубца. Заживление обеспечивается первичным натяжением, вторичным натяжением или «под струпом». Регенерация эпидермиса сопровождается миграцией клеток, пролиферацией и дифференцировкой. Восстановление эпителия кожи характеризуется одновременно регенерацией подлежащей соединительной ткани. Итогом репарации может быть не только тканевая, но и органотипическая – с восстановлением дериватов.
Анализ фактического материала показал, что процессы регенерации кожи сопровождаются конвергенцией клеток, выполняющих роль организаторов или посредников в системах клеточных коопераций в эпителиальных и соединительно-тканных компонентах регенерата.
Феномен конвергенции на фоне продуктивного воспаления желчных протоков при экспериментальном суперинвазионном описторхозе
Данный раздел работы выполнен с целью выявления механизма конвергенции при заражении организма хозяина гельминтозом – распространенной формой паразитарной инвазии населения в регионе Обь-Иртышского бассейна – описторхозом. Согласно паспорту и формуле специальности 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология – область науки, занимающаяся исследованием происхождения, строения, развития, функционирования клеток и тканей, их взаимодействия в процессе жизнедеятельности организма, как в норме, так и при различных патологических нарушениях. Области исследования № 1, № 3, № 5 специальности нашли отражение в настоящем разделе диссертации. Они соответствуют отрасли «медицинские науки».
Возбудитель описторхоза был открыт в 1891 году томским профессором Виноградовым К.М., который при вскрытии одного умершего выявил в печени гельминта трематоду, которую он назвал Сибирской двуусткой (Distomum Sibiricum). Как впоследствии оказалось, Сибирская двуустка была идентична трематоде кошки – Opisthorchis Felineus. Начиная с 1930 года, в СССР были организованы экспедиции по выявлению очагов описторхоза в различных территориях страны. Один из крупнейших очагов описторхоза оказался в Среднем Приобье, особенно выраженном в гиперэндемичных районах – в окрестностях Тобольска, Ханты-Мансийска, Сургута (Соловьева О.Г., 2011).
Заражение описторхозом происходит при поедании сырой (не проваренной, слабосоленной) рыбы породы карповых. В мускулатуре рыбы содержатся личинки – метацеркарии, которые сохраняют витальность и способность к дальнейшему развитию при попадании в организм «окончательного хозяина». Для заражения гельминтозом экспериментальных животных – сирийских хомяков-самцов (Mesocricetus Auratus) мы брали свежевыловленную рыбу (язя), обрабатывали её в соответствии с принятой в нашей лаборатории методикой, получали живых метацеркариев, наблюдали их в проходящем свете под микроскопом. Микроскопия является необходимым условием при оценке инвазивного материала. После обработки рыбы смесью желудочного сока, соляной кислоты и пепсина в течение 8 часов при температуре 36-38,0оС (готовили раствор следующего состава: 11 мл концентрированной соляной кислоты, 7 г пепсина, 9 г поваренной соли в 1 л дистиллированной воды). Кусочки измельченной рыбы (можно пропустив через мясорубку) отмывали физ. раствором и получали живые личинки (рис. 42, рис. 43).
Возбудитель описторхоза – плоский червь, длиной 4-13 мм, ланцетовидной формы, шириной 1-3,5 мм, паразитирует в желчных протоках и протоках поджелудочной железы. Гельминт имеет две присоски – ротовую на переднем конце тела и брюшную, которая находится каудальнее (рис. 44).
В зоне дна ротовой присоски открывается ротовое отверстие, переходящее в глотку, а затем в пищевод (рис. 45).
Между семенниками располагается экскреторный канал. Часть тела гельминта, ограниченная с одной стороны брюшной присоской, с другой – семенниками, заполняется петлями матки (рис. 47).
Окраска: гематоксилин Майера и эозин. 20х10. В половозрелой особи петли матки «нафаршированы» яйцами гельминта. Половые отверстия (женское и мужское) открываются кпереди от брюшной присоски. Гельминт является гермафродитом. Нутрицевтика гельминта обеспечивается выделениями слизистой оболочки протоков поджелудочной железы и желчеотводящих путей, а также холангиоцитами и клетками крови (Соловьева А.В., 2007).
Имеются немногочисленные сведения о возможности использования зрелым паразитом в качестве питательного материала содержимого очагов гранулематозного воспаления – инфильтратов и гранулем слизистой оболочки желчных протоков (Соловьев Г.С., 2017).
Метацеркарии в физиологическом растворе при температуре +4оС способны сохранять витальность довольно длительное время. По результатам наших наблюдений – до 4 месяцев. Надо отметить, что часть личинок погибает, другие же после помещения в каплю физ. раствора на предметное стекло, но при комнатной температуре обретают подвижность буквально через 1-2 минуты. Это выявляется при микроскопировании под малым увеличением. Загрузив в мае в склянку с физ. раствором (30 мл) 500 метацеркариев и добавив 5 капель свиной желчи, в сентябре мы насчитали в растворе только 250 живых личинок. Микроскопирование выявило их витальное состояние и наличие пигментированного содержимого в кишечнике. Отмерших личинок оказалось 97. При смене физ. раствора мы не удаляли метацеркариев, поэтому снижение числа личинок можно объяснить феноменом каннибализма. Был случай, когда после помещения личинок в холодильник, мы обнаружили снижение температуры (по техническим причинам) до -3оС, личинки оказалось замороженными в ледяной массе. В таком состоянии личинки хранились 2 дня. После размораживания при комнатной температуре личинки сохранили свою подвижность.
Отдельные метацеркарии после длительного хранения почти полностью лишаются пигментированного содержимого в кишечнике, и, если в зоне ротовой присоски еще определятся темного цвета материал, то брюшная становится обесцвеченной, и сохраняются только контуры самой присоски (рис. 48).
Через 29 дней после заражения метацеркарий достигает половозрелого состояния. Через 14 дней после повторного заражения их число в органах мишенях (печени, поджелудочной железе) возрастает, начинается адаптация гельминтов к условиям обитания в организме хозяина. В это время проявляются действия регуляторных факторов локального и дистантного характера, среди которых преобладают сенсибилизирующий, механический, иммунодепрессирующий и аллергический эффекты. Структурно функциональные проявления гельминтоза касаются альтерации, экссудации и пролиферации, то есть классических механизмов воспаления. В результате в организме экспериментального животного развивается острый гепатит в сочетании с грануломатозным холангитом. В междольковой соединительной ткани формируются инфильтраты, состоящие из клеток лимфоидного, гранулоцитарного (эозинофилы и нейтрофилы) и моноцитарного дифферонов, нарушается структура стенки кровеносных сосудов.
Обозначается плазморея, локальный диапедез форменных элементов. Механическое раздражение эпителиального покрова, производимое тегументом мариты, приводит к эрозии холангиоцитов, адгезии к нарушенной стенке яиц гельминта, начинается процесс их последующего поступления в слизистую оболочку протока. Очаг эрозии трансформируется в изъязвление и перемещение яиц гельминта в подлежащую собственную пластинку слизистой. Тела зрелых паразитов заполняют желчные протоки, располагаясь одиночно или даже группами (рис. 49, рис. 50).