Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Морфофункциональная организация белой крови в норме и при лимфо и миелопролиферативных процессах 11
1.1. Развитие лейкоцитов. Регуляция лейкопоэза 11
1.1.1. Развитие нейтрофилов и лимфоцитов из гемопоэтической стволовой клетки 11
1.1.2. Нейрогуморальная регуляция лейкопоэза 13
1.2. Морфофункциональная организация лейкоцитов здоровых людей 16
1.3. Общая характеристика лейкозов 23
1.3.1. Механизмы возникновения лейкозов 23
1.3.2. Классификация лейкозов 25
1.3.3. Реологические свойства крови больных лейкозом 27
1.4. Морфофункциональная организация лейкоцитов больных лейкозом 28
1.5. Митогены, механизмы действия 33
Собственные исследования
Глава 2. Материал и методыация эксперимента 38
2.2. Общий клинический анализ крови и цитохимическая диагностика лейкозов 39
2.3. Морфофункциональные методы исследования лимфоцитов
2.3.1. Культивирование лимфоцитов 41
2.3.2. Методы исследования клеток крови на АСМ 42
2.3.3. Изучение функциональной активности лимфоцитов 47
2.3.4. Морфологические методы анализа цитологических фиксированных препаратов лимфоцитов 49
2.4. Методы статистической обработки 51
Глава 3. Цитоархитектоника и функциональные свойства лимфоцитов крови здоровых людей и больных лейкозом 52
3.1. Гематологические показатели крови больных лейкозом 52
3.2. Структурно-функциональные свойства лимфоцитов крови больных лейкозом и здоровых людей
Глава 4. Цитоархитектоника и функциональные свойства митоген-стимулированных лимфоцитов 66
4.1. Структурно-функциональные свойства
Кон А-стимулированных лимфоцитов 66
4.2. Структурно-функциональные свойства ФГА-стимулированных лимфоцитов 89
4.3. Сравнительный анализ структурно-функциональных
свойств лимфоцитов в условиях митогенной стимуляции 112
Глава 5. Обсуждение результатов исследования 131
Выводы 144
Практические рекомендации 145
Список сокращений 145
Список литературы 1
- Развитие нейтрофилов и лимфоцитов из гемопоэтической стволовой клетки
- Морфофункциональные методы исследования лимфоцитов
- Структурно-функциональные свойства лимфоцитов крови больных лейкозом и здоровых людей
- Структурно-функциональные свойства ФГА-стимулированных лимфоцитов
Введение к работе
Актуальность темы. Действие целого спектра стимулов (вирусов, канцерогенов и т.п.) наряду с трансформацией функционального состояния клетки сопровождается изменением структуры ее поверхности, что в итоге приводит к появлению у нее новых биологических свойств (Wroblewski J.M. et al., 2002; McLead I.X. et al., 2011). В зависимости от природы и интенсивности возмущающего воздействия, адаптивные реакции клеток проявляются неодинаково, однако общими их свойствами являются изменения цитоархитектоники, формы и поверхности (Wolf К. et al., 2003). В связи с этим одной из актуальных проблем клеточной биологии является изучение функциональных свойств и структуры поверхности лимфоцитов в норме и при патологии (например, развитии опухолей в системе крови). Решение данной проблемы позволит установить ранние изменения структурно-функциональных свойств лимфоцитов, характерных для неопластической клетки, а также разработать терапевтические подходы, направленные на уничтожение аномальных клеток.
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время в литературе представлены данные многочисленных научных исследований, касающихся вопросов опухолевого перерождения клеток (Зуева Е.Е., 2008; Тамкович С.Н. и др., 2008; Чеботкевич В.Н. и др., 2010), метастазирова-ния и образования лейкостазов (Сорокин Ю.Н. и др., 2013). Нарушение пролиферации и дифференцировки лимфоцитов при развитии лимфопро-лиферативных заболеваний обусловлены изменением их генетической и метаболической систем (Lopez J.I. et al., 2008), что отражается на особенностях их метастатического потенциала, механизмах формирования и функционирования поверхностного аппарата клетки (Шутова М.С., 2010; Dong С. et al., 2005; Kraning-Rush СМ. et al., 2012). Доказано, что процесс развития неопластических лимфоидных клеток сопровождается изменением заряда (ТарасоваИ.М., 1985) и свойств плазмалеммы (Горло Е.И., 2000). Несмотря на многочисленные экспериментальные данные, представленные в источниках литературы, открытым остаётся вопрос об особенностях цитоархитектоники, механических и электрических свойств клеточной поверхности, изменяющихся в процессе опухолевого перерождения.
Решение данной проблемы стало возможным благодаря внедрению в экспериментальные исследования технологий сканирующей зондовой микроскопии, использующей различные модификации атомно-силовых микроскопов. Преимуществами атомно-силовой микроскопии, по сравнению с традиционными способами исследования, являются: трехмерная визуализация топографии (Kamruzzaham A.S.M. et al., 2004); интеграция морфологических изображений клеточной поверхности с ее механическими свойствами (Simone A., Durrieu М.С., 2006); получение информации об упруго-эластических (Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю., 2013) и электрических свойствах клеток (Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю., 2014).
Внедрение атомно-силовой микроскопии создает новые направления в изучении морфологических и функциональных особенностей клеточной поверхности.
С учетом вышесказанного сформулированы цель и поставлены задачи исследования.
Цель работы: охарактеризовать цитоархитектонику и свойства поверхности лимфоцитов в норме (у здоровых людей) и при развитии лимфопролиферативных процессов на основе метода атомно-силовой микроскопии.
Задачи исследования:
-
Измерить поверхностный потенциал лимфоцитов в норме и при развитии лимфопролиферативных процессов.
-
Изучить цитоархитектонику поверхности и упруго-эластические свойства лимфоцитов в норме и в условиях пролиферации.
-
Охарактеризовать миграционную активность и организацию элементов цитоскелета лимфоцитов в норме и в условиях пролиферации.
-
Проанализировать цитоархитектонику и функциональные свойства лимфоцитов здоровых людей и больных лейкозом на моделях митоген-стимулированной пролиферации.
Научная новизна. На основе комплексного подхода с использованием современных методов атомно-силовой микроскопии получены новые данные о структуре и функциональных свойствах нормальных и трансформированных лимфоцитов. Впервые показано, что развитие миелопро-лиферативного процесса сопровождается изменением морфологии, упруго-эластических свойств и миграционной активности лимфоцитов. Установлены различия архитектоники, жесткости и организации цитоскелета лимфоцитов в условиях острого и хронического типов лимфобласт-ной пролиферации. Показано, что в период ремиссии лимфобластного лейкоза лимфоциты сохраняют свойство, характерное для клеток в стадии обострения болезни - способность распластываться на подложке. Установлено повышение потенциала поверхности лимфоцитов при развитии лимфопролиферативных процессов как миело-, так и лимфобластного ростков кроветворения.
Научная новизна работы заключается так же в том, что на модели митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов удалось доказать и подтвердить ранние изменения свойств и структуры поверхности различных субпопуляций лимфоцитов в норме и при развитии лимфопролиферативных заболеваний. Так, установлено, что реакция лимфоцитов на митогенную стимуляцию проявляется в образовании клеток с повышенным потенциалом поверхности и сниженной двигательной активностью.
Теоретическая и практическая значимость. В выполненном исследовании представлены новые сведения о структурной организации и функциональных свойствах лимфоцитов в норме и при развитии пролифе-ративных процессов. Полученные данные имеют важное теоретическое и
практическое значение в области клеточной биологии в качестве критерия, позволяющего объективно дифференцировать нормальные лимфоциты от клеток, обладающих злокачественными свойствами.
Комплексное исследование цитоархитектоники и функциональных свойств лимфоцитов в условиях пролиферации позволило установить объективные маркеры, которые можно использовать для прогноза степени и тяжести течения острых и хронических типов лимфопролиферативных заболеваний. На основе полученных данных, а также с учетом ранее разработанных способов («Способа исследования нативных клеток крови»; патент РФ № 2398234; «Способа определения упругости клеток крови»; патент РФ № 2466401), создан «Способ прогнозирования течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза» (патент РФ № 2541189). Разработаны рекомендации по оценке локомоторной активности опухолевых лимфоцитов при выполнении исследований в рамках Федеральной целевой программы 1.3.2. «Проведение научных исследований целевыми аспирантами», соглашение № 14.132.21.1320 от 01.10.2013.
На модели митогенстимулированной пролиферации клеток показано, что образовавшиеся лимфобласты больных острым лимфобластным лейкозом в ремиссии и хроническим лимфолейкозом после лечения обладают функциональными свойствами, сходными с агрессивными лимфобластами больных острым лимфолейкозом. Подобная реакция клеток на мито ген, в отсутствие противоопухолевой терапии, указывает на способность лимфоцитов сохранять злокачественные свойства у больных как острым лимфолейкозом в ремиссии, так и хроническим лимфолейкозом после лечения.
Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедре экологии, физиологии и биологической эволюции НИУ «БелГУ» при разработке учебно-методических пособий по дисциплинам «Физиология крови» для магистров по направлению 020400.68 - Физиология человека и животных, «Иммунология» для студентов направления подготовки 020200.62 - Биология; «Цитология и гистология» для студентов направления подготовки 020400.62 - Биология.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Развитие острых и хронических лимфопролиферативных процессов в системе крови сопровождается повышением поверхностного потенциала лимфоцитов.
-
Упруго-эластические свойства и тонкая организация цитоархитектоники поверхности лимфоцитов специфична для каждого типа пролиферации.
-
Пролиферативные процессы сопровождаются изменением миграционной активности лимфоцитов: снижение ее у больных хроническим лимфолейкозом после лечения и острым лимфолейкозом в фазу ремиссии, и увеличение - у больных острым миелобластным и острым лимфобластным лейкозом в фазу обострения.
-
Адаптивный ответ лимфоцитов на моделях мито генной стимуля-
ции, как в группе здоровых людей, так и больных лейкозом проявляется в образовании трех морфологически разнородных субпопуляций клеток с характерными особенностями цитоархитектоники, повышенным потенциалом поверхности и сниженной миграционной активностью, однако в изменении упруго-эластических свойств клеток однозначной зависимости не установлено.
Степень достоверности полученных результатов и выводов диссертации обусловлена теоретическим анализом, личным участием автора во всех сериях экспериментального исследования, использованием современных высокоточных методов атомно-силовой микроскопии, соответствующих компьютерных программ обработки и анализа изображений, большим объемом фактического материала, который обработан с использованием традиционных методов статистики, получением патентов на изобретения, публикацией данных диссертации в статьях, докладах на международных конференциях и научных семинарах.
Апробация работы. Основные результаты диссертационных исследований представлены на III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика- 2010» (Москва, 2010); 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наукаXXI века» (Пущино, 2010); VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012); XVII Российском симпозиуме по растровой и электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ -2012) (Черноголовка, 2012); 16-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2012); X Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии Коми «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2012); 17-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2013); IX Международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 2013); XXII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва-Волгоград, 2013); IV Международной научно-практической конференции «Научные перспективы XXI века. Достижения и перспективы нового столетия» (Новосибирск, 2014), расширенном заседании кафедры экологии, физиологии и биологической эволюции НИУ «БелГУ» (Белгород, 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов исследования, 3 патента на изобретения.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка сокращений, списка литературы (287 источников, в том числе 192 - иностранных). Работа включает 24 таблицы, иллюстрирована 109 рисунками.
Развитие нейтрофилов и лимфоцитов из гемопоэтической стволовой клетки
Образование клеток крови находится под контролем нервной и гуморальной систем, механизмы действия, которых, подразделяются на локальные и длинно дистантные. (Elencov I.J.et al, 2000; Metcalf D., 2008) Действие локальных механизмов в основном распространяется на ранние предшественники клеток крови за счет тканевого, микрососудистого и нервного компонентов (Шиффман Дж., 2001).
Гуморальная регуляция развития клеток крови осуществляется по средствам эндо- и экзогенных компонентов. К эндогенной группе факторов регуляции лейкопоэза относят: лейкопоэтины, интерлейкины, ингибиторы клеточного деления, гормоны.
Лейкопоэтины. Продуцируют ФСК костномозговые стромальные элементы, фибробласты, эндотелий и клетки Сертоли (Гривенников И.А., 2008). Основные клетки-мишени ФСК - гемопоэтическая стволовая клетка, ранние коммитированные предшественники миелоидного, лимфоидного и эритроидного кроветворных рядов. ФСК активируют специализацию муль-типотентных клеток предшественников совместно с ИЛ-3, ГМ-КСФ и ИЛ-7 (Burdon Т., 2002). Они участвуют в обеспечении пролиферации наиболее юных предшественников Т-лимфоцитов в тимусе (Wei Н., 2005). К ФСК относят интерлейкины 3, 4 и 5 (Крылова Т.А. и др., 2003).
ГМ-КСМ - полипептид, продуцируемый Т-лимфоцитами, моноцитами, фибробластами и клетками эндотелия. ГМ-КСМ тормозит апоптоз эозинофи-лов и моноцитов, увеличивает адгезию нейтрофилов, оказывая влияние на молекулы CDllb и LAM-1 (Lieder J.G. et al, 2004; Alenzi F.Q., 2008). ГМ-КСФ широко применяется в клинической практике для стимулирования антимикробной активности лейкоцитов у онкогематологических больных (Си-зякина Л.П. и др., 2000; Ashitani J. et. al, 2000).
Г-КСФ выделяют из нейтрофилов, моноцитов, макрофагов, фибробла-стов, стромальных и эндотелиальных клеток (Козлов В.А., 2004; Пучков И.А. и др., 2012). Этот фактор продуцируют клетки эпителиальной карциномы (Воробьев А.И. и др., 2006) и острой миелоидной лейкемии (Blume K.G., Thomas E.D., 2000). Синтез Г-КСФ индуцируют провоспалительные цитоки-ны (TNFa и IL-1), ГМ-КСФ. Г-КСФ активирует киназы JAK-семейства, которые способствуют фосфорилированию тирозина, фактора транскрипции STAT3, который непосредственно стимулирует пролиферацию и индуцирует дифференцировку гранулоцитарных предшественников. Г-КСФ применяется при мобилизации периферических стволовых клеток (Gutierrez-Delgado F. et al., 2001).
Интерлейкины. Группа цитокинов, которые регулируют пролиферацию иммунокомпетентных клеток во время иммунного ответа, а также контролируют процессы миелопоэза и эритропоэза (Симбирцев А.С, 2004). Интерлейкины вырабатываются макрофагами, дендритными клетками, эндоте-лиоцитами, фибробластами, NK и кератиноцитами (Шаглинова В.А. и др., 2004), Т-лимфоцитами и В-лимфоцитами (Бойчук СВ., Дунаев П.В., 2008; Мордвинов В.А., Фурман Д.П., 2009; Копылова Д.А., 2012), стволовыми клетками костного мозга (Симбирцев А.С., 2002; Белова О.В. и др., 2008). Регулирующее влияние интерлейкинов на гемопоэз заключается в ускорении созревания Т- и В-лимфоцитов, дифференцировке субпопуляций Т-хэлперов (Кетлинский С.А., 2005; Diakovska D. et al, 2006) и Т-киллеров (Прохоренко Т.С. и др., 2011), стимуляции роста предшественников стволовых клеток (Симбирцев А.С., 2004; Oh J.W. et al., 2002), пролиферации и дифференцировке стимулированных В-лимфоцитов (Белова О.В. и др., 2008; Вострикова Н.В. и др., 2009; Долгих Т.И. и др., 2011; Barnes P.J., 2003; Amiro О. et al, 2010).
Ингибиторы клеточного деления. Важную роль в регуляции процессов пролиферации кроветворных клеток играют кейлоны - термолабильные гликопротеины с молекулярной массой 4000 Д. Механизм их действия состоит в инактивации ферментов, участвующих в репликации ДНК, и подавлении процесса пролиферации (Симбирцев А.С., 2002). Существуют специфические кейлоны - нейтрофильные и лимфоцитарные - выделенные из зрелых клеток крови, работающие по принципу обратной связи с лейкопоэтинами. Источником кейлонов могут служить селезенка и тимус (Симбирцев А.С, 2004). К факторам ингибиторам нейтропоэза относят так же лактоферрин и кислый изоферрин, содержащиеся в мембране макрофагов.
Гормоны. Показано, что на кинетику лейкоцитов значительное влияние оказывают гормоны адаптации (Pedersen В.К., Hoffman-Goetz L., 2000). Усиление продукции АКТГ, глюкокортикоидов и катехоламинов ведет к развитию гранулоцитоза. Изменение количества лейкоцитов в периферической крови связано с перераспределением гранулоцитов под влиянием катехоламинов и обусловлено выходом лейкоцитов в кровоток из мест депонирования крови (Cosentino М. et al., 2007).
Реализация эффектов гормонов, в том числе глюкокортикоидов, на лимфоциты обеспечивается за счет аденилатциклазной системы, обнаруженной в этих клетках. Избыточные концентрации глюкокортикоидов оказывают лим-фопенический эффект, обусловленный инволюцией лимфоидной ткани, уменьшением поступления лимфоцитов из депо, уменьшением количества незрелых предшественников. Глюкокортикоиды угнетают деление малых и средних лимфоцитов, ускоряют созревание больших лимфоцитов (Brewer J.A., 2002; Galon G. et al, 2002).
Простагландины оказывают разнонаправленное действие на различные популяции лимфоцитов. Так, простагландин Еі усиливает активность Т-лимфоцитов, а на В-клетки оказывает подавляющий эффект. Простагландин Е2 ингибирует митоз Т-клеток, но не влияет на деятельность В-лимфоцитов (Pelus L.M., Hoggatt J., 2011).
Гормоны щитовидной железы стимулируют лейкоцитоз (Whitfield J., 2005; Song Y. et al., 2011). Андрогены являются стимуляторами лейкопоэза, действующими непосредственно на стволовые клетки (Kim S.W. et al., 2005).
К экзогенной группе гуморальных факторов регуляции лейкопоэза относят витамины группы В, витамин С, фолиевую кислоту, железо и микроэлементы, такие как кобальт, медь, марганец. Эти факторы, влияя на ферментативные процессы в кроветворных органах, способствуют дифференцировке форменных элементов и синтезу их компонентов.
Нервная регуляция лейкопоэза осуществляется посредством отделов ЦНС и ВНС, нервные волокна которых расположены в паренхиме костного мозга. Прямые контакты между нервными отростками и кроветворными клеткам отсутствуют (Mignini F. et al., 2003). Механизмы регуляции основаны на работе нейромедиаторов, воздействующих на адрено- и холинэргиче-ские рецепторы, обнаруженные на мембране клеток костного мозга и периферической крови, причем чем более дифференцирована клетка тем меньше на ней рецепторов (Steidl U. et al., 2004).
Морфофункциональные методы исследования лимфоцитов
По данным электронной микроскопии клетки при ОЛЛ имеют умеренно ворсинчатую или пузырьковую поверхность с небольшими периферийными складками. В работе Tosh S.R. (1981) исследована структура плазмалеммы лимфобластов на разных этапах клеточного цикла. Показано, что в начале G1 периода интерфазы клеточная поверхность покрыта пузырьками, которые в середине G1 сменяются микроворсинками. К концу пресинтетического и в начале синтетического этапов лимфобласты имеют гладкую поверхность. В завершении S-фазы клеточная поверхность приобретает волнистую структуру с рафлами по краю цитоплазмы. Для лимфоцитов, находящихся в G2 периоде интерфазы, характерна густо покрытая филоподиями и микроворсинками клеточная поверхность, за счет которой осуществляется механический контакт между бластами. На этапе митоза лимфобласты имеют большое количество длинных филоподий, мелких и крупных пузырей. К концу телофазы клетки приобретают вытянутую форму с гладкой поверхностью.
Миелобласты при развитии лейкозов характеризуются правильной округлой или овальной формой. Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) среднее или высокое, причем у бластных клеток мелких размеров ЯЦО наибольшее. Цитоплазма клеток серо-голубого цвета, в некоторых клетках присутствует азурофильная зернистость. Ядра чаще всего имеют округлую форму, неправильная форма ядер характерна для крупных бластов. Структура ядерного хроматина нежная, в ядрах обнаруживаются 1 -4 ядрышка различной величины (Краснова Л.С., 2009).
Иммунофенотипическая характеристика и биохимические особенности клеток. Ключевую роль в типировании лимфопролиферативных заболеваний играет иммунологическая характеристика клеток крови. Показано, что лей-кимические бласты больных ОЛЛ характеризуются многочисленными имму-нофенотипическими аберрациями (Байдун Л.В., 1997). В отличие от нормальных лимфоцитов опухолевые клетки интенсивно экспрессируют CD 10, 19, 20, 34, 38, 45 и 58 (Шиффман Дж, 2001).
Цитохимические исследования показывают, что в лимфоцитах больных ОЛЛ, преобладают процессы деградации глицерофосфолипидов, значительно понижена активность АТФазы и нуклеаз, до 90% бластных клеток содержат полисахариды в виде гранул различных размеров (Казарян П.А. и др., 2011).
В лимфобластах не синтезируется пероксидаза, неспецифическая эстераза и хлорацетат по сравнению со здоровыми клетками. Т-клеточные бласты характеризуются повышенной активностью кислой фосфатазы, присутствием фермента терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы (Шиффман Дж., 2001).
Для лимфоцитов больных ХЛЛ характерны иммунофенотипы CD5, CD19, CD20, CD23, CD24, CD31 и CD38, иногда CD10, основу бластов составляют CD5 В-лимфоциты. Показано, что CD38 и CD31, взаимодействуя между собой, приводят к избыточной экспрессии CD100, который способствует бесконтрольной пролиферации клеток и повышает агрессивность лейкоза (Chiorazzi N., Ferrarini М., 2003).
Лимфобласты характеризуются сниженным количеством антигенных сайтов L-цепи Ig по сравнению с нормальными лимфоцитами, высоким уровнем CCRV-рецептров, опосредующих хемокиновые эффекты, что способствует метастазированию в лимфоузлы (Harris N.L. et al., 2001).
Для лимфоцитов больных ХЛЛ показана повышенная активность АТФазы и преобладание процессов деградации глицерофосфолипидов, что приводит к значительному нарушению метаболизма фосфоинозитидов и подавлению функциональной активности мембран, оказывая негативное влияние на защитные механизмы иммунной системы (Казарян П.А. и др., 2011). Установлены нарушения биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот лим-фобластов, что ведет к изменению продолжительности фаз клеточного цикла и дестабилизации структуры ДНК (Когарко И.Н., 1991).
У больных ОМЛ лейкемические клетки характеризуются сложным им-мунофенотипом. В крови больных ОМЛ определены незрелые клетки с высокой экспрессией антигенов CD34 и CD117, клоны клеток с признаками дифференцировки в направлении гранулоцитопоэза с антигенами CD13, CD15, CD33, CD65 (Глузман Д.Ф. и др., 2010). Миелобласты содержат большое количество миелопероксидазы (Вильчевская Е.В., Тютюнник В.В., 2008), катионов Са2+ и Mg2+ (Jaffe E.S. et al, 2001).
Властные клетки больных ХМЛ имеют иммунологический фенотип примитивной стволовой клетки (CD10, CDllb, CD13, CD14, CD15, CD19, CD33, CD34, CD38, CD45RA и HLA-DR), тогда как цитохимические маркеры свидетельствуют о миелоидной направленности дифференцировки, что расценивается как показатель их принадлежности к ранним предшественникам клеток миелоидного ряда. Миелобласты больных ХМЛ содержат большое количество фосфолипидов, пероксидазы и хлорацетат эстеразы, характеризуются моноклональным типом экспрессии изоэнзима глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и сверхэкспрессией протеолитических ферментов (ММР-2 и ММР-9), что способствует проникновению миелобластов в ткани. Обнаруженная, в большом количестве в бластах больных ХМЛ, Src-киназа, вызывает остановку апаптоза опухолевых клеток (Parsons S.J., Parsons J.T., 2004).
Организация элементов цитоскелета в клетках больных лейкозом. Клетки больных лейкозом характеризуются рядом физиологических отклонений, обусловленных дефектами структур цитоскелета (Mullins R.D., Machesky L.M., 2000). Общим для разных типов бластов у больных лейкозом являются реорганизация и динамические изменения актина (Friedl P., Gunzer М., 2001), спектрина (Pfeffer L.M., Landsberger F.R., 1990).
На актиновые компоненты цитоскелета опухолевых клеток оказывает воздействие ТРА. В неиндуцированных ТРА бластах больных лейкозом F-актин преимущественно связан с точкообразными структурами, представляющими собой неоднородные контакты, разбросанные по поверхности мембраны. После индукции ТРА эти структуры локализуются в центре клетки около ядра (Mullins R.D., Machesky L.M., 2000). В некоторых клетках появляются удлиненные актин-содержащие выступы, которые никогда не встречаются в нормальных лимфоцитах (Barton G.M., Medzhitov R., 2003).
Большое влияние на распределение спектрина в цитоскелете клетки оказывает IFN-a. Это вещество белковой природы регулирует рост, дифферен-цировку и миграцию здоровых, а также патологических лимфоцитов. IFN-a увеличивает общее содержание спектрина в клетках больных лейкозом примерно в 2-4 раза. Кроме того, IFN-a изменяет клеточное распределение некоторых других белков цитоскелета, таких как актин и тубулин (Ghia Р., 2008).
Структурно-функциональные свойства лимфоцитов крови больных лейкозом и здоровых людей
Бласты больных ОЛЛ были правильной округлой формы, среди преобладающих широкоцитоплазматических клеток встречались лимфобласты с узким ободком цитоплазмы. По данным атомно-силовой спектроскопии установлено увеличение модуля Юнга лимфобластов больных ОЛЛ на 20% (р 0,05) в зоне ядра и уменьшение его на 21% (р 0,05) по периферии цитоплазмы по сравнению с клетками доноров.
Площадь поверхности бластов увеличилась на 25% (р 0,05), а их высота снизилась на 50% (р 0,05) по сравнению с донорами. Глобулярные выступы плазмалеммы бластов больных ОЛЛ после инкубации с Кон А варьировали по высоте и имели четко выраженные контуры по сравнению с бластами доноров (рис. 34).
Рельеф поверхности бластов больных ОЛЛ (стрелками показаны складчатые структуры поверхности). Высота глобул лимфобластов больных ОЛЛ возросла на 235% (р 0,05) по сравнению с донорами. В то же время их ширина у лимфобластов больных ОЛЛ уменьшилась на 28% (р 0,05) по сравнению с бластами в контроле (см. табл. 12). Количество глобулярных выступов под влиянием Кон А в бла-стах больных ОЛЛ увеличилось на 252% (р 0,05) по сравнению с лимфобла-стами доноров. Глубина инвагинаций плазмалеммы бластов больных ОЛЛ возросла на 830% (р 0,05), а ширина углублений увеличилась на 121% (р 0,05) по сравнению с клетками доноров. Количество инвагинаций на клеточной поверхности лимфобластов больных ОЛЛ уменьшилось на 81% (р 0,05) по сравнению с клетками доноров.
Для бластов больных ОЛЛ были характерны более крупные пучки фи-ламентов, отходящие от ядра к периферии клетки, по сравнению с группой доноров (рис. 35).
В группе больных ОЛЛ ГШ возрастал на 51% (р 0,05) по сравнению с клетками доноров. Число мигрировавших клеток больных ОЛЛ уменьшился на 56% (р 0,05) по сравнению с лимфоцитами доноров (см. табл. 15). Достоверные увеличения ИТМЛ наблюдали в группах больных ОЛЛ на 48% (р 0,05) по сравнению с донорами.
Общее число ядрышек в пролиферирующих лимфоцитах больных ОЛЛ под влиянием Кон А возросло соответственно на 35% (р 0,05) по сравнению с донорами. Число ядрышек на одно ядро в лимфоцитах больных ОЛЛ увеличилось соответственно на 112% (р 0,05) по сравнению с группой доноров.
Микроциты больных ОЛЛ в ремиссии округлой формы, их жесткость уменьшилась на 70% (р 0,05) по сравнению с микроцитами доноров (см. табл. 9). Для микроцитов больных ОЛЛ в ремиссии наибольшая жесткость характерна в области околоядерного пространства, однако в сравнении с клетками доноров в целом жесткость снижена на 59% (р 0,05). Модуль упругости микроцитов больных ОЛЛ в ремиссии по периферии уменьшился на 73% (р 0,05) по сравнению с микроцитами доноров.
Площадь поверхности и объем микроцитов больных ОЛЛ в ремиссии снизились соответственно на 15% и 60% (р 0,05) по сравнению с клетками доноров. На поверхности плазмалеммы клеток установлено наличие шероховатостей, сформированных многочисленными выступами небольшого размера (рис. 37).
Рельеф поверхности микроцитов больных ОЛЛ в ремиссии (стрелкой показана шероховатость на поверхности). Высота и ширина глобулярных выступов микроцитов больных ОЛЛ в ремиссии снизились соответственно на 86% и 89% (р 0,05) по сравнению с аналогичными параметрами в контроле. Общее количество глобулярных структур лимфоцитов больных ОЛЛ в ремиссии увеличилось на 227% (р 0,05) по сравнению с микроцитами доноров.
Нормоциты из суспензии больных ОЛЛ в ремиссии были округлой формы с выраженным ядром. Для них характерно снижение модуля Юнга на 78% (р 0,05) в сравнении с клетками доноров. Под влиянием Кон А наблюдали снижение модуля Юнга нормоцитов больных ОЛЛ в ремиссии в области ядра и цитоплазмы соответственно на 84% и 44% (р 0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл. 10).
Площадь поверхности и объем нормоцитов больных ОЛЛ в ремиссии снизились соответственно на 28% и 40% (р 0,05) по сравнению с клетками доноров. Высота глобулярных структур нормоцитов снизилась на 86% (р 0,05) по сравнению с клетками доноров. Ширина выступов лимфоцитов больных ОЛЛ в ремиссии возросла на 71% (р 0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл. 12). Под влиянием Кон А на поверхности нормоцитов увеличилось количество глобулярных выступов у больных ОЛЛ в ремиссии на 40% (р 0,05) по сравнению с клетками доноров (рис. 38).
Глубина инвагинаций плазмалеммы нормоцитов больных ОЛЛ в ремиссии снизилась на 93% (р 0,05), при этом ширина углублений поверхности клеток увеличилась на 29% (р 0,05) по сравнению с нормоцитами доноров. В популяции нормоцитов больных ОЛЛ в ремиссии пучки элементов цитоскелета располагались в области околоядернного пространства в виде расходящихся от ядра структур (рис. 39).
Лимфобласты больных ОЛЛ в ремиссии имели неровные контуры цитоплазмы, располагающейся широким ободком. Под действием Кон А жесткость бластных форм больных ОЛЛ в ремиссии снизилась на 58% (р 0,05) по сравнению с лимфобластами доноров (см. табл. 9).
Площадь поверхности и объем лимфобластов больных ОЛЛ в ремиссии увеличились соответственно на 114% и 41% (р 0,05) по сравнению с клетками доноров. Для клеток характерно наличие крупных глобулярных структур и глубоких инвагинаций между ними (рис. 40).
Высота глобул лимфобластов больных ОЛЛ в ремиссии возросла на 2424% (р 0,05) по сравнению с лимфобластами доноров. В то же время их ширина увеличилась на 431% (р 0,05) по сравнению с бластами доноров (см. табл. 13). Количество глобулярных выступов под влиянием Кон А в группе больных ОЛЛ в ремиссии снизилось на 37% (р 0,05) по сравнению с лимфобластами доноров. Глубина инвагинаций плазмалеммы бластов больных ОЛЛ в ремиссии возросла на 413% (р 0,05), а ширина углублений увеличилась на 238% (р 0,05) по сравнению с лимфобластами доноров. Количество инвагинаций на клеточной поверхности лимфобластов больных ОЛЛ в ремиссии уменьшилось на 40% (р 0,05).
Элементы цитоскелета лимфобластов больных ОЛЛ в ремиссии формировали разветвленную сеть из пучков, расходящихся по направлению к краю цитоплазмы, причем в околоядерной зоне присутствовали плотные широкие пучки, а на периферии преобладали более тонкие структуры (рис. 41).
Структурно-функциональные свойства ФГА-стимулированных лимфоцитов
Результаты экспериментальных исследований, представленные в данной работе, расширяют современные представления функциональном статусе клеточных форм, циркулирующих в крови больных различными формами лейкоза.
Установлено, что в группе больных ОМЛ в суспензии лимфоцитов отсутствуют бластные формы. Клетки правильной округлой формы. ОМЛ объединяют группу болезней с нарушением пролиферации клеток-предшественников миелоидного ряда (Волкова М.А., 2007), в связи с чем, бластов среди субпопуляции лимфоцитов не наблюдается. Тем не менее, лимфоциты больных ОМЛ имеют свои характерные особенности: упруго-эластические свойства снижены, объем циркулирующих лимфоцитов увеличен. Не смотря на то, что форма лимфоцитов не отличается от таковой у здоровых людей, цитоархитектоника поверхности имеет характерные особенности. В частности, на поверхности лимфоцитов больных ОМЛ увеличено число глобулярных выступов, которые собраны в структуры дугообразной формы. Вероятно, в данном случае реализуется установленный ранее механизм тесной связи субпопуляций лимфоцитов с иммунофенотипическими особенностями миелобластов, который проявляется в непосредственном взаимодействии между молекулами CD7 и HLA-DR, локализованными на поверхности миелобластов и рецепторами лимфоцитов (Колбацкая О.П. и др., 2012).
Возрастание жесткости лимфоцитов больных ОМЛ создает определенные затруднения при продвижении клеток по капиллярам циркуляторного русла (Dong С, 2005). Вместе с тем, после измерения модуля Юнга в различных участках клеточной поверхности, установлено, что по краю цитоплазмы упруго-эластические свойства сохраняются и эта область более «мягкая» по сравнению с зоной ядра и перинуклеарного пространства, где отмечено максимальное скопление глобулярных структур и установлены высокие значения модуля Юнга.
Известно, что упруго-эластические свойства клеток крови тесно связаны с организацией подмембранных структур цитоскелета (Gatfield J. et al., 2005), однако в проведенном исследовании существенных различий в расположении и длине элементов цитоскелета между лимфоцитами доноров и больных ОМЛ не выявлено. Тем не менее, установлено повышение заряда клеточной поверхности и миграционной активности лимфоцитов больных ОМЛ. Вероятно, перераспределение электрических зарядов на поверхности клеток и как следствие деполяризация мембран лимфоцитов на фоне увеличения их миграционной активности способствует адгезии «жестких» клеток к сосудистой стенке (Cernuda-Morollon Е., Redley A.J., 2006). В результате, клетки не способны деформироваться при прохождении через мелкие капилляры, что может провоцировать нарушения микроциркуляции крови.
Показано, повышение поверхностного потенциала лимфоцитов при ге-мобластозах может быть связано как с перераспределением молекул холесте-рола клеточной мембраны (Moores В. et al., 2010), так и с снижением скорости трансформации глобулярного актина в полимерную форму, вследствие чего активируются ионные каналы (Negulaev Y. et al., 1996), участвующие в формировании электрического заряда клетки.
Для больных ОЛЛ характерно присутствие в периферическом русле бластных форм. Согласно данным литературы такой тип лейкоза характеризуется наличием незрелых лимфобластов, из которых 70% составляет пре-В-клеточный тип, недифференцирующийся в зрелые лимфоциты (Мовчан Л.В., 2012). Властные формы имеют неправильные контуры цитоплазмы и ядра. Полагаем, что это связано с особенностями организации структур цитоскеле-та, в частности микротрубочек (Small J.V. et al., 2002). Нами установлено, что фибриллы цитоскелета бластов больных ОЛЛ располагаются в виде отдельных нитей, значительно превышающих длину цитоскелетных пучков доноров. Миграционная активность этих клеток повышена, их жесткость, в области ядра и по периферии, снижена. Согласно данным литературы, уменьшение жесткости в области ядра является признаком диффузного распределения хроматина, что указывает на интенсификацию синтетических процессов в клетке (Mazumder А., 2008). Снижение значений модуля Юнга на периферии цитоплазмы может создавать условия для формирования ламеллоподий и фокальных контактов (Morrison Е.Е., 2007). Это предположение согласуется с полученными нами, данными о перестройке структур цитоскелета и увеличении миграционной активности лимфобластов больных ОЛЛ. Объем и площадь поверхности лимфобластов увеличены, их высота снижена, что указывает на способность распластываться на подложке. Рельеф поверхности лимфобластов больных ОЛЛ сглажен: утрата части морфологических образований, снижение высоты глобулярных выступов и их общего количества. Уве 133 личение поверхностного потенциала клеток способствует повышению адгезии к сосудистому эндотелию (Cernuda-Morollon Е., Redley A.J., 2006). Не исключено, что подобные изменения функциональных параметров и структуры могут спровоцировать выход «мягких» лимфобластов больных ОЛЛ в ткани и способствовать формированию метастатических очагов.
В группе пациентов больных ОЛЛ, находящихся в состоянии ремиссии болезни, для которых характерно улучшение клинической симптоматики и гематологических данных - атипичные бласты в костном мозге не превышают 5%, показатели периферической крови близки к норме (O Brien S., Keating M.J., 2005), бластных форм не обнаружено. Однако размеры лимфоцитов увеличены. Причем, так же как и для лимфобластов в период острого течения ОЛЛ, так и для лимфоцитов в период ремиссии сохранялось ключевое свойство - способность клеток распластываться на подложке.
В состоянии ремиссии ОЛЛ в периферической крови больных выявлено присутствие двух типов лимфоцитов с разной конфигурацией поверхности. Так, для первого типа клеток было характерно наличие мелких глобул и крупных инвагинаций, а для второго - крупных глобулярных образований сферической формы и редко встречающиеся мелкие инвагинации. Высота глобулярных выступов клеток с первым типом поверхности снижена по сравнению со структурами плазмалеммы здоровых людей. Высота и ширина глобул клеток второго типа напротив, превышала аналогичные размеры глобулярных структур на поверхности лимфоцитов доноров. Глобулы и инвагинации лимфоцитов больных ОЛЛ в ремиссии, как с первым типом клеточной поверхности, так и со вторым значительно превышали размеры аналогичных структур лимфоцитов больных лимфобластным лейкозом на стадии обострения. В лимфоцитах двух морфологических типов характерно снижение жесткости в области ядра и по периферии цитоплазмы аналогично клеткам больных лимфолейкозом на стадии обострения. Не исключено, что появление двух морфологически разнородных популяций клеток является следствием воздействия химиотерапии (Barret A.J., 2009).