Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Старение. Теории старения 15
1.2. Старение нейронов (головного мозга, неокортекс) 21
1.3. Строение коры мозга и ее функции в норме .22
1.4. Структурные изменения коры при старении 27
1.5. Апоптоз .28
1.5.1. Активация апоптоза .30
1.5.2. Апоптоз. Внешний сигнальный путь .31
1.5.3. Апоптоз. Внутренний сигнальный путь .32
1.5.4. Третий, внутренний путь апоптоза с участием эндоплазматической сети 33
1.6. Регуляторы апоптоза 34
1.7. Роль апоптоза в процессе старения 36
1.8. Развитие нейродегенеративных заболеваний 38
1.8.1. Болезнь Альцгеймера 38
1.8.2. Болезнь Паркинсона .40
1.8.3. Болезнь Хантингтона 41
1.8.4. Боковой амиотрофический склероз .41
1.9. Модели старения 42
1.10. Рецептор эпидермального фактора роста HER-2/neu .43
1.11. Сигнальный путь PI3К/AKT/mTOR 45
1.12. Сигнальный путь MAPK/ERK .49
1.13. Связь апоптоза и рака .52
Глава 2. Материалы и методы 56
2.1. Экспериментальные модели 56
2.2. Методы 58
2.2.1. Гистологическая обработка материала 58
2.2.2. Метод TUNEL 58
2.2.3. Иммуногистохимический метод 58
2.2.4. Вестерн блоттинг анализ .59
2.2.5. Анализ изображений .61
2.3. Методы, позволяющие исследовать поведенческое состояние и психологический статус экспериментальных животных 62
2.3.1. Тест «открытое поле» .62
2.3.2. Suok-тест 64
2.4. Статистический анализ результатов .65
Глава 3. Результаты 66
3.1. Исследование антиапоптозной активности препаратов 66
3.1.1. Регуляция апоптоза нейронов сенсомоторной коры головного мозга, определяемая с помощью метода TUNEL, у экспериментальных групп мышей разного возраста 66
3.1.2. Изменение уровня апоптоз-ассоциированных белков в клетках сенсомоторной коры головного мозга у экспериментальных разновозрастных групп животных в онтогенезе 70
3.1.2.1. Уровень белка СD95 - члена суперсемейства поверхностно-активных рецепторов TNF и проапоптотического белка caspase-8 в клетках сенсомоторной коры головного мозга у экспериментальных разновозрастных групп животных в онтогенезе 70
3.1.2.2. Уровень белка-супрессора опухолей р53 и проапоптотического белка caspase-3 в клетках сенсомоторной коры головного мозга у экспериментальных разновозрастных групп животных в онтогенезе .74
3.1.2.3. Уровень антиапоптотических белков Mcl-1 и Вcl-2 в клетках сенсомоторной коры головного мозга у экспериментальных разновозрастных групп животных в онтогенезе 77
3.1.2.4. Уровень белков AKT (p-АКТ) и ERK (p-ERK)в клетках сенсомоторной коры головного мозга у экспериментальных разновозрастных групп животных в онтогенезе 80
3.1.2.5. Уровень белка Actin в клетках сенсомоторной коры головного мозга у экспериментальных разновозрастных групп животных в онтогенезе 89
3.2. Анализ результатов локомоторной активности, ориентировочно исследовательского поведения и психоэмоционального статуса у экспериментальных групп мышей разного возраста .90
3.3 Анализ результатов локомоторной активности, ориентировочно исследовательского поведения и психоэмоционального статуса у экспериментальных групп мышей разного возраста под воздействием цитофлавина и пирацетама 95
3.4 Уровень белка HER-2/neu в клетках сенсомоторной коры головного мозга у экспериментальных разновозрастных групп животных в онтогенезе .98
Глава 4. Обсуждение 100
4.1. Исследование механизма программированной смерти нейронов сенсомоторной коры головного мозга у мышей двух генетических линий FVB/N и HER-2/neu на поздних этапах онтогенеза 100
4.1.1. Уровень клеточной смерти нейронов у контрольной группы мышей при физиологическом старении 100
4.1.2. Уровень клеточной смерти нейронов у контрольной группы мышей при сверхэкспрессии HER-2/neu .103
4.2. Исследование механизмов влияния цитофлавина и пирацетама на регуляцию апоптоза у экспериментальных групп мышей при физиологическом старении и при сверхэкспрессии HER-2/neu 105
4.3. Изменения локомоторной активности, ориентировочно-исследовательского поведения и эмоционального состояния у мышей двух генетических линий FVB/N и HER-2/neu при старении 112
4.4. Исследование влияния цитофлавина и пирацетама на локомоторную активность, ориентировочно-исследовательское поведение и эмоциональное состояние мышей двух генетических линий FVB/N и HER-2/neu при старении 114
Заключение .119
Выводы 120
Список сокращений 122
Список использованной литературы .124
Приложение .161
- Строение коры мозга и ее функции в норме
- Уровень белка СD95 - члена суперсемейства поверхностно-активных рецепторов TNF и проапоптотического белка caspase-8 в клетках сенсомоторной коры головного мозга у экспериментальных разновозрастных групп животных в онтогенезе
- Анализ результатов локомоторной активности, ориентировочно исследовательского поведения и психоэмоционального статуса у экспериментальных групп мышей разного возраста
- Исследование механизмов влияния цитофлавина и пирацетама на регуляцию апоптоза у экспериментальных групп мышей при физиологическом старении и при сверхэкспрессии HER-2/neu
Введение к работе
Актуальность проблемы. Старение - многофакторный феномен, характеризующийся динамическим снижением физиологических функций (Mandavilli B.S. et al., 2002). На данный момент существует множество теорий, объясняющий процесс старения, однако ни одна из них не является общепризнанной (, 2010). Старение мозга сопровождается образованием свободных радикалов (, 1992), уменьшением функциональных связей между нервными клетками (Costa K.M., 2014), снижением выработки гормонов, нейрогормонов и нейромедиаторов, в том числе серотонина, норадреналина и дофамина (Miguez J.M. et al., 1999; Neven M.M. et al., 2012), образованием сенильных бляшек в различных отделах головного мозга (Howieson D.B., 2015), изменением проницаемости гематоэнцефалического барьера (Viggars A.P. et al., 2011; Marques F. et al., 2013; Almutairi M.M. et al., 2016).
В настоящее время исследование патологического старения, а именно
ускоренного старения представляет большой интерес, как для
фундаментальной биологии, так и для практической медицины. В нашем
исследовании моделью патологического старения были трансгенные мыши со
сверхэкспрессией HER-2/neu, контролем выступали мыши дикого типа линии
FVB/N. Трансгенные мыши линии HER-2/neu были выведены на основе линии
мышей FVB/N, поскольку линия FVB/N характеризуется высокой
плодовитостью и хорошей выживаемостью эмбрионов после инъекций (Taketo et al., 1991). Сверхэкспрессия активированного HER-2/neu у трансгенной самки мышей FVB/N приводит к злокачественной трансформации эпителиальных клеток молочных желез с последующим развитием нескольких аденокарцином молочных желез (Muller W.J. et al., 1988, 1998). Выявленная гиперинсулинемия, гипергликемия, а также снижение активности антиоксидантной системы и репродуктивной системы у трансгенных мышей HER-2/neu являются биомаркерами преждевременного старения (Panchenko A.V. et al., 2016). Таким образом, трансген HER-2/neu не только инициирует малигнизацию эпителиальных клеток молочных желез, но также вызывает гормонально-метаболические изменения, характерные для ускоренного старения (Panchenko A.V. et al., 2016).
Список сокращений: АФК – активные формы кислорода, АТФ – аденозинтрифосфат, ГАМК – гамма-
аминомасляная кислота, НАД – никотинамидадениндинуклеотид, НАДФ –
никотинамидадениндинуклеотидфосфат, ЦНС– центральная нервная система, AKT– RAC-альфа-серин /
треонин-протеинкиназа (RAC-alphaserine/threonine-proteinkinase), Bax – BCL-2-ассоциированный X белок (BCL-
2-associated X protein), Bcl-2 –B-клеточная лимфома-2 (B-cell lymphoma-2), CD95 –кластер дифференцировки 95
(cluster of differentiation 95), CD95L – лиганд CD95 (ligand CD95), FOXO –семейство Forkhead box класса О
(Forkhead box О), ERK–киназа, регулируемая внеклеточными сигналами (extracellular-signal-regulated kinase
), Mcl-1 – миелоидная клеточная лейкемия-1 (Myeloid cell leukaemia-1), Mdm2 – мышиной двойной минуте 2
гомолог (Mouse double minute 2 homolog), NMDA – N-метил-D-аспартат (N-methyl-D-aspartate), PARP– поли-
(АДФ-рибозы)-полимеразы (poly-(ADP-ribose)-polymerase), р53 – опухолевый белок (tumor protein p53), p-АКТ
– фосфорилированная форма RAC-альфа-серин/треонин-протеинкиназы (phosphorylated form RAC-alpha
serine/threonine-protein kinase), p-ERK – фосфорилированная форма киназы, регулируемой внеклеточными
сигналами (extracellular-signal-regulated kinase ), TNF – фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor),
VES– сукцинат витамина Е (vitamin E succinate).
При старении наблюдается потеря нейронов, доходящая до 20 и более процентов, в различных частях головного мозга, таких как голубое пятно, черная субстанция, гиппокамп, хвостатое ядро, скорлупа и кора головного мозга (Anglade P. et al., 1997; Park D.C., Yeo S.G., 2013).
По литературным данным (Warner H.R., 1999; Higami Y., Shimokawa I., 2000), апоптоз тесно связан со старением и нейродегенеративными заболеваниями. Повышение уровня апоптоза фиксируется в постмитотических тканях при старении (Pollack M. et al., 2002), в том числе в стриатуме старых крыс (Zhang A.L. et al., 1995). Показано, что причиной активации апоптотической смерти Т-клеток, миоцитов сердца, скелетных мышц и нейронов коры головного мозга при физиологическом старении является митохондриальная дисфункция (Pollack M., Leeuwenburgh C., 2001). Выявлена апоптотическая активность у старых крыс, о чем свидетельствуют такие маркеры, как цитоплазматический цитохром С, активация Bax, p53 и caspase-3, расщепление PARP и ник-концевое мечение dUTP (Kapasi A., Singhal P., 1999; Martin D. et al., 2002). Однако в настоящее время недостаточно данных, описывающих молекулярные механизмы, связанные с апопотической смертью нейронов. В связи с этим представляется актуальным исследовать механизмы апоптотической смерти клеток при физиологическом старении и при сверхэкспрессии онкогена HER-2/neu, поэтому важно определить содержание белков-индукторов апоптотической смерти клеток и антиапоптотических белков.
Кроме того, при физиологическом и патологическом старении (сверхэкспрессия онкогена HER-2/neu) важную роль играют сигнальные каскады PI3K/AKT/mTOR и MAPK/ERK, активируемые рецепторами эпидермального фактора роста (ERBB, HER), следовательно, актуально исследовать данные сигнальные пути.
Для увеличения продолжительности жизни человека необходимо понять,
какие клеточные программы ответственны за старение, и выявить возможности
их тонкого регулирования (DiLoreto R., Murphy C.T., 2015). Старение связано с
возрастными изменениями когнитивных и двигательных процессов (Smith C.D.
et al., 1999; Krampe R.T., 2002). Возрастные изменения моторной деятельности
связаны с проблемами координации (Seidler et al., 2002), замедлением движения
(Kirkendall D.T., Garrett W.E., 1998) и обусловлены дисфункцией центральной и
периферической нервной системы, а также дегенерацией мышечных тканей
(Seidler et al., 2010). Инволюция некоторых функций тканей и органов может
начаться в довольно молодом возрасте. В связи с этим важно исследовать
локомоторную активность, ориентировочно-исследовательское поведение и
эмоциональное состояние трансгенных мышей HER-2/neu в сравнении с
мышами дикого типа FVB/N на поздних этапах онтогенеза. Согласно
литературным данным, современные поведенческие тесты, такие как «открытое
поле» и Suok-тест, являются важными методами изучения механизмов, которые
лежат в основе ориентировочно-исследовательского поведения и
психоэмоционального поведения (Калуев А.В., Туохимаа П., 2005; Курьянова Е.В. и др., 2013).
Возрастные изменения различных систем организма, - сердечно
сосудистой, легочной, нервной, эндокринной, иммунной, а также двигательной,
требуют фармакокоррекции. Актуальным является поиск средств,
способствующих восстановлению локомоторных и когнитивных функций, а также лечению возрастных изменений.
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время для коррекции возрастных изменений в клинической практике используются различные лекарственные препараты. Так, выявлен нейропротекторный эффект лекарственного препарата мемантина, применяемого для лечения болезни Альцгеймера (Karolczak D. et al., 2013). В результате клинических исследований ( et al., 2013) было выявлено, что мелатонин обладает нейропротекторной активностью и может применяться при лечении нейродегенеративных заболеваний, отека головного мозга после черепно-мозговой травмы или инсульта посредством сохранения митохондриального гомеостаза, уменьшения образования свободных радикалов и синтеза АТФ. Выявлено (Li T. et al., 2016), что терапия рутином улучшает метаболическую функцию у старых крыс. Показано, что применение рапамицина способствует снижению уровня -амилоида на моделях болезни Альцгеймера и устранению когнитивных нарушений (Spilman P. et al., 2010), при длительном приеме рапамицина в течение жизни наблюдается улучшение возрастных расстройств познавательных способностей (Majumder S. et al., 2012), данный препарат благоприятно влияет на обучение и память у молодых мышей и сохраняет память у старых мышей, а также оказывает анксиолитическое и антидепрессивное действие (Halloran J. et al., 2012). Однако результаты не всегда бывают однозначными, и проблемы, связанные со старением организма, в настоящее время не решены. Механизм действия многих лекарственных препаратов, в том числе цитофлавина и пирацетама, до конца не изучен, несмотря на их использование в клинической практике. Таким образом, изучение возможного про- или антиапоптотического действия лекарственных препаратов цитофлавина и пирацетама является актуальной задачей.
Цель исследования: выяснение механизмов апоптоза нейронов
сенсомоторной коры головного мозга, изучение участия цитофлавина и
пирацетама в регуляции апоптоза, а также оценка ориентировочно-
исследовательского поведения, локомоторного и психоэмоционального статуса
мышей при физиологическом и патологическом (сверхэкспрессия HER-2/neu)
старении и возможность фармакологической коррекции возрастных
двигательных и поведенческих нарушений.
Задачи исследования:
1. Оценить уровень апоптоза, выявить механизмы и пути его реализации
(определить содержание апоптоз-ассоциированных белков (p53, CD95, caspase-3, caspase-8, Mcl-1, Bcl-2)) и активность AKT- и ERK-сигнальных путей в клетках сенсомоторной коры головного мозга при физиологическом старении и при сверхэкспрессии онкогена HER-2/neu.
-
Определить механизмы влияния цитофлавина и пирацетама на регуляцию апоптоза нейронов коры головного мозга при физиологическом и патологическом (сверхэкспрессия HER-2/neu) старении.
-
Определить ориентировочно-исследовательскую активность, локомоторный и психоэмоциональный статус старых мышей в сравнении с молодыми двух линий - FVB/N (дикий тип) и HER-2/neu-трансгенных в контрольной группе и под воздействием цитофлавина и пирацетама.
Научная новизна работы. Показано, что при физиологическом старении наблюдается запуск возраст-зависимого апоптоза нейронов сенсомоторной коры головного мозга, протекающего по внешнерецепторному пути. При сверхэкспрессии HER-2/neu отмечается подавление основных механизмов активации программированной гибели, одной из причин является активация рецепторами HER-2/neu AKT-зависимого пути выживания.
Впервые выявлено участие лекарственных препаратов цитофлавина и пирацетама в регуляции апоптоза клеток сенсомоторной коры головного мозга при физиологическом старении. Нейропротекторное действие цитофлавина и пирацетама при физиологическом старении осуществляется путем активации антиапоптотического белка Mcl-1, что способствует подавлению гибели клеток коры и, таким образом, предупреждению возраст-зависимой нейродегенерации.
Впервые установлено проапоптотическое действие цитофлавина и пирацетама при сверхэкспрессии HER-2/neu. Показано, что данные препараты подавляют активность антиапоптотических AKT и ERK сигнальных путей, активируемых трансмембранными рецепторами HER-2/neu, что приводит к умеренному повышению уровня апоптоза.
Выявлено, что у молодых трансгенных мышей при действии пирацетама апоптоз клеток коры головного мозга протекает по р53-зависимому и внешнерецепторному пути. У старых трансгенных мышей после введения цитофлавина наблюдается активация р53- и TNF-зависимых каскадов, при действии пирацетама апоптоз идет по р53-зависимому пути.
Впервые описаны характерные черты локомоторной активности,
ориентировочно-исследовательского поведения и психоэмоционального
статуса трансгенных мышей линии HER-2/neu. Показано, что молодые
трансгенные мыши обладают низкой локомоторной активностью, в отличие от
молодых мышей дикого типа, и не обнаружено значительных изменений при
старении. Молодые трансгенные мыши более стрессоустойчивы и обладают
пониженными вегетативными признаками тревоги, по сравнению со старыми.
Показаны значительные изменения ориентировочно-локомоторной
деятельности у старых животных обеих линий при действии цитофлавина и пирацетама.
Теоретическая и практическая значимость работы. Анализ
полученных данных имеет фундаментальное значение для понимания механизмов апоптотической смерти клеток сенсомоторной коры головного мозга при физиологическом и патологическом старении (сверхэкспрессии HER-2/neu), при этом определено значение активации или подавления сигнальных путей выживания клеток – AKT- и ERK-зависимого.
Понимание про- или антиапоптотического действия лекарственных препаратов цитофлавина и пирацетама является перспективным для разработки новых подходов при лечении ряда нейродегенеративных и, возможно, онкологических заболеваний.
Кроме того, полученные в результате исследования данные могут быть использованы в курсах лекций для студентов и аспирантов биологических и медицинских направлений.
Материалы и методы исследования. Экспериментальная модель -трансгенные мыши самцы со сверхэкспрессией онкогена HER-2/neu в возрасте 2 и 10 месяцев. В качестве контроля служили мыши самцы дикого типа FVB/N в возрасте 2 и 18 месяцев. Мышей получали из Italian National Research Center for Aging, их разведение поддерживается в НИИ онкологии им. Петрова (г. Санкт-Петербург). Животные каждой линии были разделены на 2 возрастные группы. В каждой возрастной группе было 3 подгруппы: первая подгруппа являлась контрольной, второй и третьей подгруппе вводили лекарственные препараты цитофлавин и пирацетам. Всего было 12 групп мышей, в каждой подгруппе было 6 животных. Схема эксперимента приведена в таблице 1.
Таблица 1. Схема эксперимента.
3. Пирацетам, п=6 | 3. Пирацетам, п=6 | 3. Пирацетам, п=6 | 3. Пирацетам, п=6
Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и к корму.
Цитофлавин, раствор для внутривенного введения производства ООО «НТФФ «ПОЛИСАН» вводили внутрибрюшинно в дозе 0,014 мл/10 г 1 раз в сутки в течение 10 дней; пирацетам, раствор производства ОАО «Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий «Синтез» (0,05 мл/10 г - внутрибрюшинно 1 раза в сутки также в течение 10 дней). Контрольной группе вводили 5% раствор глюкозы. Согласно инструкции, препараты можно разводить в одном из совместимых инфузионных растворов, среди которых упоминается 5% раствор глюкозы. Для проведения экспериментов мы выбрали 5% раствор глюкозы, как один из возможных универсальных растворителей. Необходимые дозы были вычислены на основании терапевтических доз препаратов.
По завершении десятидневного эксперимента у всех групп животных оценивали локомоторную активность, ориентировочно-исследовательскую активность и эмоциональный статус с помощью двух современных методов: теста «открытое поле» и Suok-теста. Далее животных под золетиловым
наркозом (золетил 4 мг/кг веса) декапитировали, извлекали головной мозг для дальнейшего гистологического и биохимического исследования. Эксперимент проводили по схеме, предлагающей проведение тестов, оценивающих поведение, и забой по 2 группы мышей в день.
Гистологическая обработка материала. Исследуемый материал (мозг) фиксировали в 4% растворе формальдегида на PBS (24ч, +40С). Затем материал промывали 2 часа в PBS и помещали в раствор сахарозы (24ч, +40С). В конце была применена быстрая заморозка биологического материала в изопентане при –500С с помощью сухого льда. Материал хранили при –800С. Далее на криостате изготавливались серии чередующихся срезов сенсомоторной коры головного мозга, сделанных во фронтальной плоскости, толщиной 6 мкм.
Метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick
End Labeling) использовали для определения уровня апоптоза нейронов
сенсомоторной коры головного мозга мышей разного возраста
(нерадиоактивное мечение биотином, выявление диаминобензидином) с
использованием терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазы для
выявления разрывов ДНК (кит для TUNEL Sileks, Россия).
Иммуногистохимический метод. Выявление поверхностного
рецептора, члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (tumor necrosis factor receptor superfamily) CD95 (APO-1) в нейронах сенсомоторной коры головного мозга проводили иммуногистохимическим методом.
Вестерн блоттинг анализ. Содержание исследуемых белков (p53, CD95, caspase-3, caspase-8, Mcl-1, Bcl-2, AKT, p-AKT, ERK, p-ERK, Actin) в пробах оценивали с помощью Вестерн блоттинга.
Анализ изображений. Изображения срезов сенсомоторной коры головного мозга после выполнения TUNEL и ИГХ реакции были получены с помощью микроскопа PFM (WPI, USA) и цветной видеокамеры camera DIC-E (WPI, USA), Leika DFC 300 FX (Германия), разрешение 1392х1040 пикселей (увеличение х40). Для оценки интенсивности содержания изучаемого белка и уровня апоптоза использовалась программа VideoTestSoftware.
Подсчитывали количество апоптотических клеток (абсолютные значения, т.е. подсчитывалось количество темноокрашенных апоптотических клеток, взятое как среднее на один срез) на 4-5 срезах коры мозга у каждого экспериментального животного.
Проводили количественную оценку содержания СD95-
иммунореактивного вещества в клетках на 5-6 срезах сенсомоторной коры головного мозга для каждого животного. С помощью полученных данных подсчитали среднюю оптическую плотность (выражена в относительных единицах, представляющих отношение яркости фона к яркости объекта) исследуемого белка для каждой группы животных.
Содержание апоптоз-ассоциированных белков (CD95, р53, caspase-8, caspase-3, Bcl-2, Mcl-1, AKT, p-AKT, ERK, p-ERK) и Actin в коре головного мозга после выполнения Вестерн блоттинг анализа определяли с помощью программы ImageJ (денситометрия).
Тест «открытое поле». В тесте «открытое поле» локомоторную активность оценивали по горизонтальной активности, которая складывается из количества пересеченных периферических квадратов и пересеченных центральных квадратов (Акулина И.В., Булыгина И.Е., 2012; Леушкина Н.Ф., Калимуллина Л.Б., 2010; Кучер Е.О. и др., 2012). Количество пересеченных периферических квадратов регистрируют отдельно от количества пересеченных центральных квадратов. Вначале мыши передвигаются вдоль стен, а внутренние квадраты пересекают достаточно редко (Буреш Я. и др., 1991). Исследовательскую активность регистрировали по количеству пересеченных центральных квадратов, периферических стоек, центральных стоек (Акулина И.В., Булыгина И.Е., 2012; Леушкина Н.Ф., Калимуллина Л.Б., 2010), ориентировочную активность – по вертикальной активности, которая складывается из количества периферических стоек и центральных стоек, в том числе стоек с упором о стенку арены и без упора.
В тесте «открытое поле» «определение типологических особенностей поведения крыс возможно проводить по параметрам двигательной и исследовательской активности, рассчитывая на их основе суммированный показатель основной активности» (Курьянова Е.В. и др., 2013). Таким образом, в тесте «открытое поле» основная активность является комплексным параметром, которая складывается из числа пересеченных периферических и центральных квадратов, и количества периферических и центральных стоек (Курьянова Е.В. и др., 2013).
Эмоциональный статус животных регистрировали по количеству болюсов дефекации, уринации (Буреш Я. и др., 1991), количеству времени и актов груминга (Курьянова Е.В. и др., 2013), остановкам (Леушкина Н.Ф., Калимуллина Л.Б., 2010). По методу Буреша (Буреш Я. и др., 1991) у животных, обладающих низкой локомоторной активностью, отмечается большое количество болюсов, и они являются более эмоциональными, чем те, у которых наблюдается высокий уровень двигательной активности и низкая дефекация.
Suok-тест . Двигательную активность в Suok-тесте оценивали по количеству пересеченных сегментов, латентному периоду выхода из центральной зоны, количеству переходов через центр, исследовательскую активность – по количеству заглядываний вниз, ориентировочную активность -по количеству ориентационных движений головой (Dow E. et. al., 2014). В Suok-тесте поведенческая активность является комплексным параметром, которая складывается из горизонтальной активности, т.е. числа пересеченных сегментов, а также количества заглядываний вниз и ориентационных движений головой (Кучер Е.О. и др., 2012).
Эмоциональный статус регистрировали по количеству болюсов дефекации, латентности дефекации, количеству остановок, времени груминга, количеству актов груминга, количеству падений, латентности первого падения, количеству соскальзываний задних лап (Кучер Е.О. и др., 2012; Dow E. et. al., 2014).
Снижение показателей, характеризующих поведенческую активность (пересечения, стойки, заглядывания, ориентации), и увеличение количества
соскальзываний, падений, уринаций, дефекаций говорит об увеличении уровня тревоги у животных (Кучер Е.О. и др., 2012).
Статистический анализ результатов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента с помощью программы Microsoft Excel 5.0a. В исследовании были использованы методы, применяемые для нормального распределения данных, по причине однородности содержания животных во всех исследуемых группах и невозможности опровергнуть нулевую гипотезу о нормальности распределения из-за небольшого количества единиц наблюдения в статистической обработке. Проводилось определение границ вариации изучаемого признака (коэффициент вариации CV), который не превышал 10%, что позволяет считать уровень вариабельности признака слабым. Согласно полученным результатам, значение нормированного отклонения признака колебалось в допускаемых пределах +3 сигмы. Определяли статистическую достоверность различия величины изучаемых показателей в сопоставляемых группах при р<0,05.
Положения, выносимые на защиту:
1. У мышей дикого типа на поздних этапах онтогенеза апоптоз клеток
коры головного мозга протекает по внешнерецепторному пути с участием CD95
и caspase-8. При действии цитофлавина и пирацетама происходит снижение
уровня апоптоза в коре головного мозга при физиологическом старении.
2. У трансгенных мышей HER-2/neu уровень гибели нейронов коры мозга
низкий и не изменяется при старении. После введения цитофлавина и
пирацетама наблюдается снижение активности белков p-AKT и p-ERK с
последующей инициацией клеточной смерти. У молодых трансгенных мышей
при действии пирацетама апоптоз протекает по р53-зависимому и по
внешнерецепторному пути. У старых трансгенных мышей после введения
цитофлавина активируются р53- и TNF-зависимые каскады, при действии
пирацетама - р53-зависимый.
3. При физиологическом старении отмечается снижение локомоторной
активности и ориентировочно-исследовательского поведения, и повышение
психоэмоционального статуса (мыши линии FVB/N). При сверхэкспрессии
HER-2/neu наблюдается низкая двигательная реакция у старых мышей, а также
повышение эмоциональной реактивности, по сравнению с молодыми. По
уровню психоэмоционального состояния мыши обеих линий (FVB/N и HER-
2/neu) практически не различаются.
4. При физиологическом старении (мыши линии FVB/N) после введения
цитофлавина наблюдается повышение двигательной и ориентировочно-
исследовательской активности. У молодых и старых трансгенных HER-2/neu
мышей при введении цитофлавина и пирацетама наблюдается активация
локомоторной и исследовательской деятельности. Исследуемые препараты
обладают анксиолитическим действием при физиологическом и
патологическом старении.
Апробация работы. Результаты исследования представлены и
обсуждены на Всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических
состояний мозга» (Санкт-Петербург-Колтуши, 2014), XV Всероссийском
совещании с международным участием и VIII школы по эволюционной
физиологии, посвященной памяти академика Л.А. Орбели и 60-летию ИЭФБ
РАН (Санкт-Петербург, 2016), Научно-практической конференции
«Инновационные российские технологии в геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2017).
Публикации. Основные положения диссертации нашли полное отражение в 8 печатных работах, 3 из которых – статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций, 1 - статья в рецензируемом журнале и 4 - тезисы докладов на всероссийских и международных конференциях.
Личный вклад автора. Личный вклад автора в диссертационное исследование состоял в составлении плана исследования, проведении опытов, статистической обработке и анализе данных, полученных в результате изучения путей апоптотической смерти клеток сенсомоторной коры головного мозга и экзогенного влияния на эти пути, а также в результате исследования двигательной активности, ориентировочно-исследовательского поведения и психоэмоционального статуса мышей дикого типа в сравнении с трансгенными мышами.
В ходе выполнения исследования автором освоены метод TUNEL,
иммуногистохимический метод, Вестерн блоттинг анализ, а также
поведенческие тесты, позволяющие исследовать локомоторные способности,
ориентировочно-исследовательскую активность и оценить уровень
эмоциональной реактивности. Автор принимала участие во всех
экспериментах, включавших в себя гистологическую обработку материала, микроскопию, денситометрию и статистический анализ данных. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 164 страницах и состоит из введения, обзора литературы – глава 1, описания методики – глава 2, описания результатов исследования – глава 3, обсуждения результатов – глава 4, заключения, выводов, списка сокращений и списка литературы, который включает 344 источников (из них 314 иностранных), а также приложения. Работа иллюстрирована 70 рисунками и 5 таблицами.
Благодарности. Автор и научный руководитель работы выражают благодарность сотрудникам Лаборатории сравнительной биохимии клеточных функций ИЭФБ РАН им. И.И. Сеченова: главному научному сотруднику, доктору биологических наук, Черниговской Елене Валерьевне, кандидату биологических наук, заведующий лабораторией Глазовой Маргарите Владимировне, старшему научному сотруднику, кандидату биологических наук, Никитиной Любови Сергеевне за полезные рекомендации и консультации при написании диссертационной работы.
Строение коры мозга и ее функции в норме
Кора большого мозга представлена слоем серого вещества, в котором содержатся сети глутаматергических и ГАМК-эргических нейронов, поддерживаемых глиальными клетками и кровеносными сосудами. Толщина серого вещества коры головного мозга варьирует примерно от 1,5 мм до 5 мм. Наиболее сильно развита кора в передней центральной извилине. Серое вещество охватывает основное белое вещество, которое состоит из миелинизированных аксонов, происходящих из вышестоящего серого вещества, на периферии головного мозга. Кора содержит пять различных типов нервных клеток: пирамидальные, веретенообразные, звездчатые, паукообразные и горизонтальные клетки. В коре различают шесть основных слоев: I – молекулярный; II - наружный зернистый; III – пирамидный, IV – внутренний зернистый, V – гаглионарный, VI – слой полиморфных клеток. Каждый слой коры отличается от другого преобладанием одного вида нейронов (Афанасьев Ю.И. и др., 2001; Florio M., Huttner W.B., 2014; Greenstein B., Greenstein A., 2000; Shipp S., 2007) (рис. 1).
Онтогенез больших полушарий протекает по принципу «изнутри наружу», вновь образующиеся пирамидальные клетки радиально мигрируют от пролиферативной зоны к месту формирования нижних слоев коры, а последующие клетки образуют верхние слои. Нервные клетки коры дифференцируются из мало специализированных пролиферирующих клеток, расположенных в вентрикулярной зоне конечного мозга. В результате миграции нейроцитов из вентрикулярной области, образуется «предпластина» под поверхностью мозгового пузыря. Затем «предпластина» разделяется на маргинальную зону и субпластинку, из которой выделяется поверхностная кортикальная пластина, т.е. миграция нейронов идет сверху вниз. В дальнейшем из зачатков кортикальной пластины формируются II и VI слои, после расширения первой корковой закладки, в нее мигрируют другие нейробласты будущих V, IV, III слоев, согласно принципу «изнутри наружу». I бесклеточный слой образуется из маргинальной зоны развивающейся кортикальной пластины (Афанасьев Ю.И. и др., 2001; Обухов Д.К., 2008; Mountcastle V.B., 1997).
Верхний слой коры состоит из незначительного числа небольших нейронов веретеновидной формы, их нейриты лежат вблизи поверхности мозга и составляют часть тангенциальной прослойки молекулярного слоя. В поверхностном слое содержится множество дендритов и аксонов нейроцитов нижележащих слоев, формирующих межнейронные связи.
Наружный зернистый слой характеризуется наличием мелких нервных клеток размером примерно 10 мкм и разной формы: округлой, угловатой, пирамидной и звездчатой. Дендриты этих нейроцитов находятся в молекулярном слое. Нейриты лежат в белом веществе или входят в состав тангециального сплетения нервных волокон первого слоя. Пирамидные нейроны представляют самый широкий третий слой коры, который ступенчато увеличивается в границах 10-40 мкм наружного слоя к внутреннему слою. Главный дендрит пирамидной клетки расположен в молекулярном слое, боковые дендриты формируют синапсы с соседними клетками. Нейрит малой пирамидной клетки ответвляется от основания нейроцита и лежит в границах коры. Аксон крупного пирамидного нейрона также отходит от основания, однако образует миелиновое ассоциативное волокно. Внутренний зернистый слой особенно хорошо развит в зрительной и слуховой областях коры, однако практически отсутствует в сенсомоторной области. В этом слое сосредоточены малые клетки звездчатой формы и большое число горизонтальных волокон. Ганглионарный слой состоит из крупных пирамидных клеток (клеток Беца), содержащих глыбки хроматофильной субстанции. Аксоны клеток Беца ответвляются вниз к белому веществу и формируют нисходящие пирамидные пути. Большинство нейроцитов шестого полиморфного слоя коры имеют веретенообразную форму, исключение составляют пирамидные клетки и клетки Маринотти. Крупные нейроны находятся в наружном участке этого слоя. Более мелкие и далеко расположенные друг от друга клетки входят в состав внутреннего участка полиморфного слоя. Аксоны нейроцитов проникают в белое вещество и составляют часть эфферентных путей. Дендриты поднимаются в I молекулярный слой (Афанасьев Ю.И. и др., 2001).
Нейроны коры могут быть возбуждающими (пирамидные) и тормозными. Пирамидные нейроны расположены практически во всех слоях коры, за исключением первого, и отличаются размерами и формами. Апикальный дендрит пирамидной клетки уходит в I слой коры, где дихотомически ветвится. Система базальных дендритов ответвляется с другой стороны тела нейроцита. Главная ветвь аксона крупной пирамидной клетки отходит вниз и формирует систему эфферентных путей за пределами коры мозга. Однако внутри коры образуются сложные связи между нейроцитами (Афанасьев Ю.И. и др., 2001; Shipp S., 2007).
Непирамидные нейроны, в большинстве случаев тормозные, более разнообразны по морфологии, по сравнению с пирамидными клетками. Звездчатые клетки являются мелкими нейронами, тела которых имеют полигональную форму. От тел таких нейроцитов отходят несколько дендритов и короткий аксон. Горизонтальные клетки Кахаля обладают маленькой формой и преобладают в молекулярном слое коры. Веретеновидные клетки лежат перепендикулярно слоям неокортекса, их дендриты, ветвящиеся со всех полюсов нейрона, пролегают в самые глубокие слои коры. Клетки Маринотти представляют собой маленькие мультиполярные клетки с аксоном, уходящим в I слой, и короткими дендритами (Афанасьев Ю.И. и др., 2001; Greenstein B., Greenstein A., 2000).
Кора головного мозга разделяется на четыре части: лобную, теменную, височную и затылочную доли. Лобная доля является частью моторной и ассоциативной коры головного мозга и ответственна за контроль человеческого поведения. Теменная доля, расположенная позади первичной соматосенсорной коры, связана с соматосенсорной ассоциативной корой. Это место осознавания и запоминания информации. Затылочная находится в задней части головного мозга и отвечает за обработку и анализ визуальной информации. Височная — в нижней части головного мозга, ответственна за связь со зрительной и слуховой ассоциативной корой, также она контролирует речь и язык (Varvatsoulias G., 2015).
Кора головного мозга разделена на три зоны: первичную зрительную, первичную слуховую и первичную соматосенсорную. Первичная соматосенсорная кора мозга располагается в центре мозга, позади центральной борозды и связана с аспектом восприятия, т.е. ощущением и осознанием. Она является рецептивной областью, которая получает информацию из различных частей тела и преобразует ее в тактильные, вкусовые и температурные ощущения (Varvatsoulias G., 2015).
Уровень белка СD95 - члена суперсемейства поверхностно-активных рецепторов TNF и проапоптотического белка caspase-8 в клетках сенсомоторной коры головного мозга у экспериментальных разновозрастных групп животных в онтогенезе
Основная задача исследования состояла в определении механизма программированной клеточной смерти клеток сенсомоторный коры головного мозга при старении. В результате исследования мы обнаружили, что у старых мышей дикого типа клеточная гибель протекает по внешнерецепторному пути. Апоптоз клеток коры старых животных FVB/N реализуется при участии поверхностно-клеточных рецепторов, членов суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей CD95 (рис. 5, 15, 16), с последующей активацией сaspase-8 (рис. 17, 18), в отличие от трансгенных животных, у которых уровень апоптоза низкий и не меняется с возрастом (рис. 7).
Уровень CD95, рецептора фактора некроза опухолей, в клетках сенсомоторной коры у молодых мышей двух генетических линий невысокий (рис. 15, 19). Однако у мышей FVB/N содержание данного рецептора повышается на поздних этапах онтогенеза, в то время как у мышей HER-2/neu уровень CD95 не изменяется при старении (рис. 15, 16, 19). Эти данные сопоставимы с содержанием caspase-8 (рис. 17, 18, 20) и уровнем апоптоза (рис. 5, 7).
Другая задача исследования состояла в определении возможности изменения сигнального каскада под внешним контролируемым воздействием. Результаты показали, что применение цитофлавина и пирацетама приводит к повышению содержания CD95 и caspase-8 в клетках коры у молодых мышей дикого типа (рис. 15, 17). Однако у старых мышей FVB/N наблюдается повышение уровня CD95 только при действии цитофлавина, тогда как пирацетам не изменяет содержание данного белка (рис. 15). Также у старых мышей дикого типа после введения пирацетама и цитофлавина происходит снижение клеточной смерти (рис. 5), хотя не наблюдается изменения уровня caspase-8 (рис. 17).
У молодых трансгенных мышей после введения цитофлавина и пирацетама наблюдается увеличение уровня CD95 (рис. 19, 21). Однако содержание caspase-8 повышается только в группе молодых трансгенных мышей, получавших пирацетам (рис. 20). Эти данные коррелируют с динамикой апоптоза (рис. 7). Вероятно, что у молодых мышей HER-2/neu при действии пирацетама клеточная смерть протекает по внешнерецепторному пути.
У старых мышей HER-2/neu наблюдается высокий уровень CD95 и некоторое повышение содержания caspase-8 только после введения цитофлавина, в то время как пирацетам подобного воздействия не оказывает (рис. 19, 20, 22).
Опираясь на эти данные, можно предположить, что у старых мышей HER-2/neu, получавших цитофлавин, апоптоз клеток коры мозга идет по внешнерецепторному пути.
Анализ результатов локомоторной активности, ориентировочно исследовательского поведения и психоэмоционального статуса у экспериментальных групп мышей разного возраста
В тесте «открытое поле» молодые мыши дикого типа показывают высокую двигательную активность, уровень которой выше по сравнению со старыми мышами, что подтверждается снижением количества пересеченных периферических квадратов (рис. 52А). В отличие от молодых мышей дикого типа, у молодых трансгенных мышей уровень локомоторной активности ниже и практически не изменяется при старении (рис. 52Б). Полученные результаты подтверждаются изменением горизонтальной активности в Suok-тесте (см. Приложение, таблица 4).
У молодых мышей дикого типа наблюдается уменьшение количества пересеченных центральных квадратов при старении, это говорит о снижении исследовательской активности (рис. 53А). У молодых и старых трансгенных животных уровень исследовательской активности выше, чем у молодых и старых мышей дикого типа (рис. 53Б). В Suok-тесте, ориентируясь на одинаковое количество заглядываний вниз у мышей контрольных групп, можно сказать, что данные линии не различаются по уровню исследовательской активности (см. Приложение, таблица 4).
Одним из параметров, позволяющих оценить ориентировочную активность в тесте «открытое поле», является вертикальная активность. Ориентировочная активность несколько снижается у мышей дикого типа при старении (рис. 54А). У трансгенных животных данный показатель уменьшается на поздних этапах онтогенеза (рис. 54Б). В Suok-тесте количество ориентировочных движений головой было сходным у всех контрольных групп мышей (см. Приложение, таблица 4).
Уровень ориентировочной активности (вертикальная активность - количество периферических и центральных стоек).
По методике Буреш (Буреш Я. и др., 1991), эмоциональный статус животных в тесте «открытое поле» оценивают по вегетативным проявлениям.
Показано, что животные, обладающие низкой двигательной реакцией и большим количеством дефекаций, более эмоциональны, чем те, которые характеризуются высокой локомоторной активностью и низким уровнем дефекации. По нашим данным выявлено, что молодые мыши дикого типа менее эмоциональны (менее тревожны), чем старые (рис. 55А). Молодые трансгенные мыши более стрессоустойчивы и показывают пониженные вегетативные признаки тревожности, по сравнению со старыми трансгенными мышами (рис. 55Б).
По данным Suok-теста по уровню психоэмоционального состояния мыши обеих линий практически не различаются, однако, молодые трансгенные мыши более стрессоустойчивы, по сравнению с молодыми мышами дикого типа, судя по вегетативным проявлениям (см. Приложение, таблица 5).
Исследование механизмов влияния цитофлавина и пирацетама на регуляцию апоптоза у экспериментальных групп мышей при физиологическом старении и при сверхэкспрессии HER-2/neu
Цитофлавин представляет собой сбалансированный комплекс веществ, таких как янтарная кислота, рибоксин, никотинамид, рибофлавин мононуклеотид (Регистр лекарственных средств в России, 2003) (рис. 65). Следовательно, фармакологическое действие цитофлавина обусловлено комплексным воздействием компонентов, входящих в его состав (Биттирова А.Э., 2014).
Основным компонентом цитофлавина является янтарная кислота. Она стимулирует шестую стадию цикла трикарбоновых кислот, т.е. сукцинатгидраназа катализирует обратное окисление сукцината до фумаровой кислоты, активизируя аэробный гликолиз (Tretter L. et al., 2016). Показано, что терапия цитофлавином снижает клеточную смерть нейронов в пирамидальном слое гиппокампа у крыс с моделью ишемии головного мозга (Bul on V.V. et al., 2004). Следовательно, можно предположить, что цитофлавин, помимо антиоксидантного, метаболотропного действия обладает нейропротекторным влиянием. По нашим данным, у молодых мышей дикого типа введение цитофлавина не изменяет долю апоптотических клеток, возможно, причиной выживаемости клеток коры является повышение уровня антиапоптотического белка Mcl-1 (рис. 5, 30, см. предлагаемую нами схему - рис. 66А). В литературе описано, что белок Mcl-1, входящий в состав семейства Bcl-2, способствует выживаемости различных клеток, в том числе нейронов (Arbour N. et al., 2008), лимфоцитов (Opferman J.T. et al., 2003) и нейтрофилов (Dzhagalov I. et al., 2007).
В литературе есть сведения об участии сукцината и его производных в запуске клеточной смерти, хотя данные по этому вопросу противоречивы. Установлено, что янтарная кислота посредством активации АКТ может ингибировать гибель кардиомиоцитов при гипоксии (Tang X.L. et al., 2013). Однако в нашей работе показано, что у старых мышей дикого типа при действии исследуемого сукцинатсодержащего препарата происходит снижение активности p-АКТ (рис. 38), а также наблюдается ингибирование клеточной смерти. Вероятно, предупреждение возраст-зависимой нейродегенерации осуществляется, как мы выявили, посредством повышения содержания антиапоптотического белка Mcl-1 (рис. 30, см. предлагаемую нами схему - рис. 66Б). При этом у молодых и старых мышей дикого типа после инъекций циитофлавина наблюдается повышение содержания апоптозассоциированных белков таких, как CD95, p53, cаspase-3 (рис. 15, 23, 25), но это не приводит к активации клеточной гибели (рис. 5, см. предлагаемые нами схемы - рис. 66А, 66Б).
Пирацетам является циклическим производным нейротрансмиттера ГАМК (Winblad B., 2005) (рис. 67). В результате фармакокинетического исследования пирацетама (Федин А.И., 2006) было выявлено, что циклическая часть его молекулы не подвергается размыканию с образованием ГАМК, следовательно, механизм действия пирацетама не связан с влиянием ГАМК (Winblad B., 2005; Navarro S.A. et al., 2013), и точный механизм действия исследуемого препарата остается неизвестным.
Данный препарат используют для восстановления когнитивных способностей при онкогенезе, травмах головного мозга и деменции (Muller W.E. et al., 1999; Winblad B., 2005). Показано, что положительное влияние пирацетама на текучесть мембраны в лобной коре, гиппокампе и стриатуме, а также на плотность NMDA в гиппокампе может быть связано с улучшением когнитивных функций у старых крыс (Scheuer K. et al., 1999). Однако механизм действия пирацетама остается до сих пор не раскрытым.
Показано, что при действии аналога пирацетама леветирацетама наблюдается снижение доли апоптотических клеток как в гиппокампе, так и в коре головного мозга у новорожденных крыс линии Wistar при гипоксии.
Следовательно, леветирацетам проявляет противоэпилептическую и антиапоптотическую активность (Kilicdag H. et al., 2013). Как выявлено в нашей работе, у молодых и старых мышей дикого типа при действии пирацетама наблюдается снижение уровня белков p-АКТ и p-ERK (рис. 38, 45), а также подавление смерти нейронов (рис. 5). Вероятно, это можно объяснить высоким содержанием белка Mcl-1 у таких мышей (рис. 30, см. предлагаемые нами схемы -рис. 68А, 68Б). Наши данные подтверждают широко известные сведения об антиапоптотической функции белка Mcl-1, так, выявлено, что в миелоидной клетке-предшественнике обнаруженная гиперэкспрессия Mcl-1 подавляет апоптотическую смерть (Zhou P. et al., 1997).
Поскольку низкий уровень клеточной смерти способствует раку или аутоиммунным расстройствам (Wu M. et al., 2001), мы предположили, что с помощью цитофлавина и пирацетама можно повысить у трансгенных животных долю апоптотических клеток. При этом одной из задач исследования было выявление механизмов влияния цитофлавина и пирацетама на регуляцию апоптоза. Мы предположили, что это влияние осуществляется через сигнальные каскады, активируемые эпидермальными факторами роста, например, AKT- и ERK-сигнальные пути.
У молодых мышей HER-2/neu при введении цитофлавина наблюдается высокий уровень проапоптотических белков, таких, как CD95, р53 (рис. 19, 24), но это не влияет на уровень апоптоза клеток коры (рис. 7), вероятно, из-за высокого содержания белка Mcl-1 (рис. 31, см. предлагаемую нами схему - рис. 69А). Показано, что активированная Mcl-1 является маркером разных наследственных аномалий при канцерогенезе (Beroukhim R. et al., 2010). Обнаружено, что продуктивный синтез Mcl-1 способствовал повышению выживаемости гемопоэтических клеток у трансгенных мышей (Zhou P. et al., 1998).
Многие авторы сообщают, что VES (Vitamin E Succinate) обладает противоопухолевой активностью (Fariss M.W. et al., 1994; Malafa M.P. et al., 2006).
Следовательно, -токоферилсукцинат проявляет апоптотическое действие в раковых клетках посредством различных апоптотических сигнальных путей (Patacsil D. et al., 2012). Так, VES-индуцированный апоптоз в клетках рака молочной железы человека стимулирует активацию JNK посредством запуска TGF- и поверхностного рецептора смерти CD95. VES-индуцированный апоптоз сопровождается перемещением цитозольного белка Bax в митохондрии с последующими изменениями в митохондриальной проницаемости, высвобождением цитохрома С из митохондрий в цитозоль, активацией caspase-9, -3 и фрагментацией ДНК (Kline K. et al., 2004). Таким образом, в нашей работе показано, что у молодых мышей HER-2/neu терапия цитофлавином оказала стимулирующее воздействие на уровень CD95 и caspase-3 (рис. 19, 26, см. предлагаемую нами схему - рис. 69А), что, возможно, обусловлено действием янтарной кислоты, как отражено в других работах.
В другой работе показано, что VES проявляет антипролиферативное и проапопточеское действие путем подавления активности p-АКТ и p-ERK (Donapaty S. et al., 2006). Выявлено, что VES стимулировал индукцию p53, что, в свою очередь, активировало DRs, это привело к запуску TRAIL–опосредованного апоптоза (Tomasetti M. et al., 2006). Эти результаты согласуются с нашими данными, что у старых трансгенных животных при действии цитофлавина наблюдается снижение содержания p-АКТ и p-ERK (рис. 40, 47), что также приводит к повышению уровня проапоптотических белков CD95, р53 (рис. 19, 24) и росту уровня апоптоза (рис. 7). Клеточная смерть протекает по внешнерецепторному пути и по р53-зависимому пути (см. предлагаемую нами схему - рис. 69Б). Можно заключить, что влияние цитофлавина на апоптотическую смерть клеток зависит от биохимического состояния клетки.
При обзоре литературы, посвященной фармакологии лекарственного препарата пирацетама, не было обнаружено данных, описывающих участие пирацетама в активации сигнальных путей AKT/PI3K и RAS/ERK/MAPK.
Сигнальные пути PI3K/AKT и RAS/ERK/MAPK являются основными механизмами трансдукции сигнала к ядру клетки для контролирования клеточной пролиферации, выживания, метаболизма, мотильности, апоптоза в ответ на внеклеточные стимулы (Brzezianska E., Pastuszak-Lewandoska D., 2011; Ye Q., She Q.B., 2013; Pappalardo F. et al., 2016). В литературе встречается достаточно много данных, показывающих, что совместное мутационное активирование сигнальных путей AKT и ERK приводит к прогрессии канцерогенеза. Некоторые авторы отмечают, что для снижения активности основных компонентов сигнальных путей AKT и ERK, подвергшихся мутации, используются ингибиторы (Ye Q., She Q.B., 2013). По нашим данным, у молодых мышей HER-2/neu при воздействии пирацетама происходит снижение активности p-АКТ и p-ERK (рис. 40, 47) и, соответственно, это приводит к стимуляции синтеза апоптоз-ассоциированных белков. Клеточная смерть идет по внешнерецепторному пути с участием CD95 и последующей активацией caspase-8, и р53-зависимому пути (см. предлагаемую нами схему - рис. 70А). Можно заключить, что у молодых мышей HER-2/neu пирацетам способен оказывать проапоптотическое действие, снижая уровень фосфо-АКТ и ERK.
При этом у старых мышей HER-2/neu после введения пирацетама происходит снижение активности p-АКТ (рис. 40), повышение содержания другого белка - pERK (рис. 47), а также уровень белка CD95 не измененяется (рис. 19), однако повышается содержание р53 (рис. 24) и, соответственно, наблюдается индукция апоптоза (рис. 58, см. предлагаемую нами схему - рис. 70Б).
Выявлено, что активация ERK ингибирует апоптоз, вызываемый различными воздействиями, такими как TNF, CD95L (Lu Z., Xu S., 2006). Как показано в нашей работе, у старых мышей HER-2/neu после введения пирацетама наблюдается повышение уровня р-ERK (рис. 47), который по литературным данным способен ингибировать CD95, и действительно, мы не наблюдаем повышения уровня CD95 (рис. 19). Однако повышается содержание другого проапоптотического белка - р53 и, соответственно, наблюдается индукция апоптоза (рис. 7). Таким образом, у старых мышей HER-2/neu клеточная смерть протекает по р53-зависимому пути (см. предлагаемую нами схему - рис. 70Б).
На основании этого можно предположить, что цитофлавин и пирацетам блокируют передачу сигнала на p-АКТ и p-ERK у мышей со сверхэкспрессией HER-2/neu, тем самым исследуемые препараты могут индуцировать развитие апоптоза клеток сенсомоторной коры головного мозга. Можно заключить, что механизм терапевтического действия данных препаратов заключается именно во влиянии их на антиапоптотические AKT- и ERK-сигнальные пути (см. предлагаемые нами схемы - рис. 69Б, 70А, 70Б).