Ангиогенные факторы в коже человека в возрастном аспекте Васильева Ольга Валерьевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 11

1.1. Кожа: строение, функции 11

1.2. Возрастные изменения организма человека 16

1.3. Общие сведения о возрастных изменениях кожи 17

1.4. Общие сведения об ангиогенезе. Ангиогенез в коже человека 21

1.5. Регуляторы ангиогенеза 27

1.6. Иммуногистохимические маркеры клеточной пролиферации 40

1.7. Иммуногистохимические маркеры кровеносных сосудов 41

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 44

2.1. Характеристика исследуемого материала 44

2.2. Забор и первичная обработка материала 44

2.3. Методы исследования 45

2.4. Выявление Dll4 45

2.5. Выявление Jag-1 47

2.6. Выявление VEGF 47

2.7. Выявление ангиомотина 48

2.8. Выявление эндостатина 48

2.9. Выявление CD31 49

2.10. Выявление CTGF 49

2.11. Выявление PCNA 50

2.12. Выявление фибробластов в дерме 51

2.13. Количественная оценка результатов 51

2.14. Статистическая обработка результатов 52

ГЛАВА 3. Результаты исследования 55

3.1. Исследование VEGF в дерме в различные возрастные периоды 55

3.2. Исследование Dll4 в сосудах дермы человека в различные возрастные периоды

3.3. Исследование Jag-1 в дерме человека в различные возрастные периоды 68

3.4. Исследование ангиомотина в сосудах дермы в различные возрастные периоды

3.5. Исследование эндостатина в сосудах дермы человека в различные возрастные периоды 82

3.6. Кровеносные сосуды дермы человека с позитивным окрашиванием на CD31 в различные возрастные периоды 88

3.7. Фибробласты дермы в различные возрастные периоды 93

3.8. Исследование CTGF в фибробластах и сосудах дермы человека в различные возрастные периоды 96

3.9. Исследование PCNA-положительных фибробластов в дерме в различные возрастные периоды 102

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 107

Выводы 116

Список сокращений 118

Список литературы 119

• Общие сведения об ангиогенезе. Ангиогенез в коже человека
• Иммуногистохимические маркеры кровеносных сосудов
• Выявление эндостатина
• Исследование эндостатина в сосудах дермы человека в различные возрастные периоды

Введение к работе

играют регуляторы ангиогенеза, в частности сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), регулирующий митоз эндотелиальных клеток сосудов и проницаемость сосудистой стенки (Dvorak H., 2002); компоненты Notch-регуляторного пути – дельтаподобный лиганд 4 (Dll4) и Jagged-1 (Jag-1), влияющие на пролиферацию эндотелиоцитов (Li D. et al., 2014); ангиомотин, который играет ключевую роль в миграции и определении полярности клеток эндотелия (Boosani С, 2011; Moleirinho S. et al., 2014); фрагмент коллагена XVIII типа – эндостатин, ингибирующий пролиферацию эндотелиальных клеток (Dixelius J. et al., 2002; Xiao L. et al., 2015); фактор роста соединительной ткани (CTGF), регулирующий адгезию, миграцию эндотелиальных клеток (Starke R., 2013). Хорошо изучена роль этих молекул в регуляторных путях в процессе формирования новых кровеносных сосудов при опухолевом росте (Prabhakar N. еt al., 2012; Guo Z. et al., 2015; Alahuhta I. et al., 2015; Klose R. et al., 2015). Однако, роль молекул, принимающих участие в формировании сосудистой системы, в возрастных изменениях кровоснабжения кожи в физиологических условиях остается неизвестной (Starke R., 2011). Еще одним малоисследованным аспектом этой проблемы является отсутствие данных о биологической взаимосвязи между состоянием сосудистой системы и фибробластами дермы (Lee J. et al., 2010; Kim J.H. et al., 2011). Кроме того, исследования, проведенные в этой области, также охватывают определенный период жизни, отсутствуют длительные наблюдения от эмбрионального этапа до глубокой старости (Lecce L. et al., 2014). Классические морфологические методы визуализации не всегда позволяют корректно оценить морфологическое и функциональное состояние различных типов клеток, что ведет к недостаточной изученности тонких механизмов функционирования. Но с внедрением иммуногистохимических методов значительно расширились возможности идентификации клеток и оценки их функционального состояния.

Таким образом, исследование возрастных аспектов сосудистого обеспечения кожи, несомненно, актуально и может оказаться полезным в выявлении новых механизмов старения, а также в разработке способов его коррекции.

Исходя из этого, целью настоящей работы явилось изучение возрастных изменений содержания и распределения регуляторов ангиогенеза в дерме человека.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить содержание и распределение сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в дерме человека в возрастном аспекте.

2. Изучить возрастные изменения в распределении дельтаподобного лиганда 4 (Dll4) в дерме человека.

3. Изучить содержание и распределение Jagged-1 (Jag-1) в дерме человека в онтогенезе.

4. Изучить распределение ангиомотина в дерме человека в возрастном аспекте.

5. Изучить возрастные изменения содержания эндостатина в дерме человека.

6. Исследовать возрастные изменения содержания фактора роста соединительной ткани (CTGF) в дерме человека.

Научная новизна. Впервые выявлено, что уменьшение количества фибробластов дермы как основных продуцентов внеклеточного матрикса, происходящее в процессе физиологического старения, связано с ухудшением кровоснабжения дермы. Новыми являются данные о содержании регуляторов ангиогенеза в коже человека в возрастном аспекте. Приоритетными следует признать сведения о том, что возрастное увеличение содержания VEGF в кровеносных сосудах дермы не ведет к увеличению количества сосудов дермы. В работе впервые доказано влияние компонентов Notch пути на активность ангиогенеза в дерме человека на протяжении от эмбрионального периода до старости. Новыми являются сведения о негативном влиянии уменьшения содержания Dll4, происходящее после 20 лет, на степень кровоснабжения дермы. Новизной обладают данные о возрастном увеличении содержания Jag-1 в сосудах дермы. Это, вероятно, является одним из механизмов ухудшения ангиогенеза дермы. Приоритетными являются данные о роли эндостатина в процессе формирования кровеносных сосудов дермы. Показано постепенное планомерное возрастное увеличение содержания эндостатина, ведущее к ухудшению ангиогенеза дермы. Новыми являются сведения о распределении ангиомотина в кровеносных сосудах дермы человека в возрастном аспекте. Впервые продемонстрировано снижение уровня ангиомотина в дермальных сосудах, что является одним из механизмов, приводящих к ухудшению ее кровоснабжения в возрастном аспекте. Новизной обладают данные о том, что с

возрастом в фибробластах и кровеносных сосудах дермы отмечается
повышение содержания CTGF, что взаимосвязано с ухудшением

кровоснабжения дермы.

Таким образом, впервые, используя методы иммуногистохимии, были получены новые знания о содержании регуляторов ангиогенеза в дерме в возрастном аспекте.

Научно-практическая значимость. Проведенное исследование

механизмов ангиогенеза в коже человека существенно расширяет и дополняет знания о морфологических и структурных изменениях в дерме человека, происходящих в процессе физиологического старения. Впервые определены механизмы, ведущие к возрастным изменениям в ангиогенезе в коже человека. Полученные данные могут быть полезны для разработки клинических подходов в профилактике и терапии возрастных изменений кожи. Практическая значимость настоящей работы заключается в использовании полученных данных о возрастной регуляции ангиогенеза в дерме при проведении научных исследований в гистологии, патологической анатомии и геронтологии. Они дополняют существующие данные в области возрастной гистологии и могут быть использованы при чтении лекций и проведении практических занятий на медицинских и биологических факультетах вузов.

Основные положения, выносимые на защиту.

7. Содержание в кровеносных сосудах дермы человека сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), Jagged-1 (Jag-1), фактора роста соединительной ткани (CTGF) и эндостатина увеличивается, ангиомотина – уменьшается от 20 недель беременности до 85 лет жизни, а дельтаподобного лиганда 4 (Dll4) – увеличивается от 20 недель беременности до 20 лет с последующим снижением к 85 годам жизни.

8. Возрастные изменения содержания в кровеносных сосудах дермы человека регуляторов ангиогенеза (VEGF, Dll4, Jag-1, ангиомотин, эндостатин и CTGF) сопровождаются уменьшением численности кровеносных сосудов и фибробластов в дерме в онтогенезе.

Апробация работы. Результаты работы, отражающие основные положения диссертации, представлялись на ежегодных итоговых конференциях медицинского факультета Чувашского государственного университета им. И.Н. Ульянова (2010-2014 гг.), международной научной конференции «Актуальные

проблемы психологии и медицины в условиях модернизации образования и здравоохранения» (Чебоксары, 2012 г.), VIII международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: инновации в современном мире» (Москва, 2013 г.), The 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd International RESOLVE Meeting «Healthy Ageing and Regenerative Medicine» (Israel, 2013 г.), научной конференции «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии», посвященной 20-летию со дня основания Геронтологического общества при Российской академии наук (Санкт-Петербург, 2014 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из
них две в зарубежных и четыре в отечественных ведущих рецензируемых
научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты
кандидатских и докторских диссертаций, шесть тезисов докладов

Международных и Всероссийских конференций и конгрессов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов исследования, обсуждения и выводов. Объем диссертации – 153 страницы машинописного текста. Работа содержит 44 рисунка. Список цитированной литературы включает 7 отечественных и 261 зарубежный источник.

Общие сведения об ангиогенезе. Ангиогенез в коже человека

Кожа представляет собой наружный покров тела, площадь которого у взрослого человека составляет 1,5-2 м2. Кожа является барьерным органом, так как находится на границе внешней и внутренней среды. Она выполняет множество функций: защитная, иммунная, экскреторная, рецепторная, эндокринная, а также участвует в терморегуляции, депонировании крови и водно-солевом обмене [2, 34]. Кожа состоит из трех слоев: наружный слой представлен эпидермисом, под ним залегает дерма и самый глубокий слой — гиподерма [2].

Эпидермис представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием, образующимся из эктодермы. Среди эпителиальных клеток эпидермиса (кератиноциты) располагаются неэпителиальные клетки (меланоциты, клетки Лангерганса, Т-лимфоциты, клетки Меркеля) [115]. Основными клетками эпидермиса являются кератиноциты, которые образуют пять слоев — базальный, шиповатый, зернистый, блестящий и роговой. Особенностью кератиноцитов является то, что они непрерывно образуются в базальном слое и смещаются в вышележащие слои. Подвергаясь полной денуклеации, они дифференцируются, превращаясь в роговые чешуйки, слущивающиеся с поверхности кожи [79].

Отростчатые клетки эпидермиса представлены меланоцитами, клетками Лангерганса и клетками Меркеля [169]. Меланоциты – это пигментные клетки нейрального происхождения, образуются из нервной трубки и нервного гребня [79]. Тела меланоцитов находятся в базальном слое, а отростки проникают в шиповатый. Основная функция меланоцитов – это синтез пигмента меланина, который в виде гранул (меланосом) транспортируются в их отростки, а из них — в кератиноциты, защищая последние от ультрафиолетового облучения [2, 119]. Дендритные клетки (клетки Лангерганса, эпидермальные макрофаги) — антигенпредставляющие клетки костномозгового происхождения, которые локализуются в базальном или шиповатом слоях. Клетки Лангерганса захватывают антигены, попадающие в эпидермис, осуществляют их процессинг, затем передают информацию лимфоцитам, вызывая развитие иммунной реакции [162]. Клетки Меркеля имеют нейральное происхождение. Связываясь с афферентным нервным волокном, клетки Меркеля выполняют механорецепторную функцию. Тело тактильных клеток локализуется в базальном слое, а отростки соединены с эпителиоцитами базального и шиповатого слоев посредством десмосом [169].

Эпидермис и дерма разделены базальной мембраной, состоящей из полудесмосом базальных кератиноцитoв, светлой пластины, плотной пластины и фибрoретикулярной пластины.

Дерма (собственно кожа) представлена волокнистой соединительной тканью мезенхимального происхождения. Дерма включает два слоя – сосочковый и сетчатый. Сосочковый слой дермы состоит из рыхлой волокнистой соединительной ткани с лимфатическими и кровеносными капиллярами, нервными волокнами и окончаниями. В сосочковом слое содержатся в большом количестве клетки (фибробласты, тучные клетки, клетки костномозгового происхождения, макрофаги, лейкоциты, пигментные клетки) и небольшое количество внеклеточного матрикса (коллагеновые, эластические и ретикулярные волокна). Сетчатый слой образован плотной волокнистой соединительной тканью. Он представлен в основном коллагеновыми волокнами, выполняющими опорную функцию [42, 152]. Условная граница между сосочковым и сетчатым слоем проходит по одним данным на уровне субпапиллярного сплетения кровеносных сосудов [1], по другим — на уровне концевых отделов сальных желез [6]. Среди клеток дермы выделяют постоянно присутствующие в ней – это фибробласты, эндотелиоциты лимфатических и кровеносных сосудов и блуждающие клетки, которые мигрируют из крови в дерму (макрофаги, тучные клетки, лейкоциты) [34].

Основная масса клеток дермы представлена фибробластами разной степени зрелости: юные, дифференцированные и зрелые фиброциты. Незрелые фибробласты проходят этапы последовательной дифференцировки, достигая зрелости. Процесс пролиферации фибробластов контролируется различными цитокинами и медиаторами, в частности интерлейкин-1, инетерлейкин-1 и интерлейкин-8 [113, 199]. Основная часть фибробластов постоянно присутствует в дерме, но небольшая часть образуется из гемопоэтических стволовых клеток, мигрирующих из костного мозга в дерму [121]. Фибробласты являются основными продуцентами компонентов внеклеточного матрикса, включающих коллаген, фибронектин, эластин, протеогликаны, гликозаминогликаны и другие. Они также участвуют в поддержании гомеостаза в дерме за счет выработки цитокинов, факторов роста и ферментов, в том числе ферментов, разрушающих коллаген [77].

Морфологически фибробласты представляют собой клетки округлой или вытянутой формы с различным количеством отростков. Форма клетки и количество отростков зависят от степени зрелости фибробласта. Юные (недифференцированные) фибробласты имеют небольшие размеры, содержащие крупное ядро и равномерно распределенную по всему объему цитоплазму. Они имеют небольшое количество отростков, что определяет их способность к миграции в очаг повреждения, то есть, незрелые фибробласты участвуют в репаративных процессах и пролиферации. В качестве хемоаттрактанта выступают продукты деградации коллагена [113].

Дифференцированные фибробласты крупнее по сравнению с юными клетками. Они также имеют ядро овальной формы и большое количество цитоплазмы. Дифференцированные фибробласты обладают хорошей подвижностью ввиду большого количества отростков, располагающихся на их поверхности. Они участвуют в синтезе, перестройке и даже разрушении межклеточного вещества дермы, поддерживая химический гомеостаз.

Фиброцит – зрелая, дефинитивная (конечная) форма развития фибробластов. Они имеют веретенообразную форму с крыловидными отростками. Клетки содержат вытянутое ядро, небольшое число органелл, вакуолей, липидов и гликогена. Синтез коллагена и других веществ в фиброцитах резко снижен. Зрелые фибробласты участвуют в поддержании тканевой структуры дермы и медленном, непрерывном обновлении внеклеточного матрикса [92].

К мигрирующим клеткам дермы относят тучные клетки, выполняющие защитную, регуляторную, эффекторную и гомеостатическую функции. Наибольшая концентрация тучных клеток обнаружена в сосочковом слое вокруг кровеносных сосудов, а также рядом с придатками кожи и нервными окончаниями [75]. В дерме присутствуют клетки костномозгового происхождения – макрофаги, проникающие в нее из кровеносных сосудов. Основная функция макрофагов заключается в поглощении чужеродных антигенов, то есть осуществлении фагоцитоза, а также предоставлении информации лимфоцитам – антигенпрезентирующая функция [267]. В дерме также определяются стволовые клетки, мигрирующие из костного мозга. Здесь они подвергаются дифференцировке, в результате которой гемопоэтические стволовые клетки могут превращаться либо в фибробласты и участвовать в процессах регенерации в очаге воспаления, либо в тучные клетки и лейкоциты, а также в клетки кровеносных сосудов [41, 47].

Иммуногистохимические маркеры кровеносных сосудов

Следующим этапом проводили инактивацию эндогенной пероксидазы. Это достигали помещением препаратов в 0,1%-й раствор перекиси водорода на 10 минут. Далее срезы промывали, помещая последовательно (по пять минут в каждой) в дистиллированную воду и три порции 0,05 М трис-буфера с добавлением 0,15 М натрия хлорида (TBS) с рН 7,2-7,6. Затем следовала инкубация в растворе первых кроличьих антител против Dll4 (AHP1274, AbDSerotec, Великобритания). Антитела разводили на TBS с добавлением 0,1% ого тритона Х-100, в соотношении 1:100. Инкубация продолжалась в течение 12 часов при комнатной температуре. На следующем этапе промывали препараты в трех порциях TBS по 20 минут в каждой. Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). На следующем этапе промывали срезы тремя порциями TBS по 20 минут в каждой. Для проведения гистохимической реакции на пероксидазу использовали 3,3-диаминобензидин (SigmaChemical, США). Первоначально мы изготавливали инкубационный раствор, включающий в себя 100 мг имидазола,50 мг 3,3-диаминобензидина и 200 мл TBS с рН 7,4. Раствор профильтровывали, затем добавляли 25 мкл 33%-ого раствора перекиси водорода и тщательно перемешивали. В приготовленный раствор помещали исследуемые препараты на 10 минут при комнатной температуре. Результатом данной процедуры было окрашивание продукта реакции в коричневый цвет. На заключительном этапе проводили докрашивание клеточных ядер гематоксилином.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов. После предварительной подготовки срезов и иннактивации эндогенной пероксидазы мы также промывали срезы в трех порциях раствора TBS с pH 7,2-7,4 по пять минут. Но затем проводили инкубацию в растворе с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1% в течение 12 часов. Последующие этапы обработки срезов не отличались от иммуногистохимического окрашивания. При использовании данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания. Jag-1 выявляли с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения Jag-1 в дерме в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против Jag-1 (NBP1-90208, NovusBiologicalsInc., США) в разведении 1:100. Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления Jag-1 были идентичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

VEGF выявляли непрямым иммуногистохимическим методом [126]. Для обнаружения VEGF в дерме в качестве первых антител использовали кроличьи антитела против VEGF (NBP1 -22844, NovusBiologicalsInc., США). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления VEGF были такими же, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

Ангиомотин выявляли при помощи непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения ангиомотин-позитивных структур дермы в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против ангиомотина (ab85143, Abcam, США). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления ангиомотина были такими же, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

Выявление эндостатина производили с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения эндостатина в дерме в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против эндостатина (ab53702, Abcam, США). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления эндостатина были такими же, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

CD31-иммунопозитивные кровеносные сосуды выявляли с помощью непрямого иммуногистохимического метода [126]. Для обнаружения CD31-позитивных сосудов в дерме в качестве первых антител мы использовали мышиные моноклональные антитела против CD31 (M 0823, DakoCytomation, Дания). В качестве вторых антител использовали антимышиную EnVision систему, конъюгированную с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления CD31 были аналогичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

CTGF выявляли непрямым иммуногистохимическим методом [126]. Для обнаружения CTGF в качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела против CTGF (AHP 1278, AbDSerotec, Великобритания). Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, DakoCytomation, Дания). Иммуногистохимические методики и временные характеристики выявления были идентичными, как при выявлении Dll4. При данной процедуре продукт реакции окрашивался в коричневый цвет.

В качестве контроля специфичности иммуногистохимического окрашивания проводилась та же схема обработки срезов, но с нормальной кроличьей сывороткой в конечной концентрации 1%. При проведении данной схемы ни разу не было получено специфического окрашивания.

Выявление эндостатина

При сравнении группы 1 (20-40 недель беременности) и группы 2 (0-20 лет) мы выявили, что случаи с неокрашенными и со слабо окрашенными на эндостатин кровеносными сосудами не имели существенных различий (см. рисунок 26). Исследование показало незначительное увеличение количества случаев со средней интенсивностью окрашивания сосудов на эндостатин в группе 2 (0-20 лет) по сравнению с группой 1 (20-40 недель беременности). Нами отмечено незначительное снижение доли случаев с сильной интенсивностью окрашивания сосудов на эндостатин в группе 2 (0-20 лет) по сравнению с группой 1 (20-40 недель беременности). Отличия между группами 1 и 2 оказались статистически недостоверными по критерию 2.

В группе 3 (21-40 лет) рассмотрели 15 препаратов кожи: 6 от лиц женского пола и 9 от лиц мужского пола. В возрасте от 21 до 40 лет количество случаев, содержащих эндостатин-негативные кровеносные сосуды, составило 13,33%. Доля случаев со слабым окрашиванием сосудов на эндостатин составляла 66,67% (рисунок 28, А). Количество случаев, имеющих среднюю интенсивность окрашивания сосудов на эндостатин в данной группе, равнялось 13,33%. Случаи с сильной иммунореактивностью кровеносных сосудов на эндостатин составляли 6,67% (рисунок 28, Б).

В возрастном периоде от 21 до 40 лет так же, как в группе 1 и группе 2, преобладали случаи со слабым окрашиванием кровеносных сосудов на эндостатин.

Результаты исследования показали (см. рисунок 26) значительное снижение случаев с эндостатин-негативными сосудами дермы и незначительное снижение эндостатин-позитивных случаев со средней и сильной интенсивностью окрашивания в группе 3 (21-40 лет) по сравнению с группой 2 (0-20 лет). Установлено абсолютное превалирование случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на эндостатин в возрасте от 21 до 40 лет. Полученные результаты оценены статистически с помощью критерия 2. Данные изменения статистически достоверно отличались от результатов для группы 2 (p 0,001).

Кровеносные сосуды со слабой (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме людей в возрасте от 21 до 40 лет (3-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х

В возрастном периоде от 41 до 60 лет исследовали 20 препаратов кожи: 9 препаратов от лиц женского пола и 11 от лиц мужского пола. В группе 4 (41-60 лет) доля случаев с не окрашенными на эндостатин кровеносными сосудами составила 10%. Количество случаев со слабо окрашенными кровеносными сосудами на эндостатин равнялось 20% (рисунок 29, А). В данной группе ровно половина препаратов кожи (50%) имела сосуды дермы со средней интенсивностью окрашивания на эндостатин. Доля случаев с сильной иммунореактивностью кровеносных сосудов на эндостатин составила 20% (рисунок 29, Б).

В анализируемом возрастном периоде от 41 до 60 лет абсолютно превалировали случаи со средней интенсивностью окрашивания сосудов на эндостатин (см. рисунок 26).

При сравнении группы 3 (21-40 лет) с группой 4 (41-60 лет) отмечено незначительное уменьшение количества случаев с эндостатин-негативными сосудами и выраженное снижение доли случаев со слабой интенсивностью окрашивания с 66,66% для группы 3 до 20% для группы 4. Исследование показало абсолютное увеличение количества случаев со средней и сильной степенью окрашиванию кровеносных сосудов на эндостатин в группе 4 (41-60 лет) по сравнению с группой 3 (21-40 лет). Изменения для группы 4 достоверно отличались от группы 3 по критерию 2 (p 0,001).

Для оценки интенсивности экспрессии эндостатина в сосудах дермы в группе 5 (61-85 лет) мы исследовали 24 препарата кожи: 14 препаратов от лиц женского пола и 10 от лиц мужского пола. В группе 5 (61-85 лет) количество случаев, в которых сосуды не имели окрашивания на эндостатин, составило всего 4,17%. Количество случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов дермы было равно 25%. Доля случаев, в которых кровеносные сосуды имели среднюю интенсивность окрашивания на эндостатин, составила 37,5% (рисунок 30, А). Случаи с сильной иммунореактивностью кровеносных сосудов на эндостатин составляли 33,33% (рисунок 30, Б).

В возрастном периоде от 61 до 85 лет отмечено незначительное преобладание доли случаев со средней степенью окрашивания сосудов на эндостатин (см. рисунок 26).

При сравнении двух возрастных периодов от 41 до 60 лет и от 61 до 85 лет мы выявили, значительное уменьшение эндостатин-негативных случаев и случаев со средней интенсивностью окрашивания, незначительное увеличение количества случаев со слабой интенсивностью окрашивания сосудов на эндостатин в группе 5 (61-80 лет). Отмечено относительное увеличение количества случаев с сильным позитивным окрашиванием сосудов на эндостатин в группе 5 по сравнению с группой 4 – 33,33% и 20% соответственно. Отличия между группами 4 и 5 статистически достоверны по критерию 2 (p 0,001).

Кровеносные сосуды со средней (А) и сильной (Б) степенью окрашивания на эндостатин в дерме людей в возрасте от 61 до 85 лет (5-я группа). Непрямая иммуногистохимическая реакция на эндостатин. Увеличение 40х

Таким образом, интенсивность окрашивания сосудов дермы на эндостатин в нашем исследовании увеличивалась с возрастом, о чем свидетельствует увеличение доли случаев с сильной и средней степенью окрашивания кровеносных микрососудов дермы на эндостатин от 20 недель беременности до 85 лет на 25,73% и 21,57% соответственно.

Так же, как и на предыдущих этапах исследования, мы использовали кожу плодов и людей мужского и женского пола. В связи с чем был проведен анализ половых различий для возрастных изменений параметров дермы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа также не установили достоверного (р 0,05) влияния пола на изменение степени окрашивания на эндостатин в кровеносных сосудах дермы.

Кровеносные сосуды дермы человека с позитивным окрашиванием на CD31 в различные возрастные периоды CD31-позитивные кровеносные сосуды в коже человека мы определяли по характерному иммуногистохимическому коричневому окрашиванию. Кровеносные сосуды встречались во всех слоях дермы. Наше исследование показало, что в группе 1 (20-40 недель беременности) в дерме определяются многочисленные кровеносные сосуды (рисунок 31, А). Подсчет численности кровеносных сосудов дермы показал, что на 1 мм2 среза ткани дермы приходится 162,93±7,84 (M±m) CD31-положительный сосуд.

В группе 2 (0-20 лет) нами отмечено, что кровеносные сосуды дермы концентрируются непосредственно под эпидермисом, в более глубоких слоях дермы их количество уменьшается (рисунок 31, Б). Эндотелиоциты, выстилающие кровеносные сосуды, имеют цитоплазму темно-коричневого цвета с четким контуром. Подсчеты показали, что в 1 мм2 среза ткани дермы содержится 153,29±14,38 CD31-позитивных кровеносных сосуда.

Исследование эндостатина в сосудах дермы человека в различные возрастные периоды

В подтверждение этого предположения имеются данные в литературе, что фибробласты мышей, полученные на 17-19-й день эмбрионального периода, продуцировали в четыре раза меньше CTGF, чем фибробласты взрослых особей [109]. Кроме того, избыточный синтез CTGF был выявлен в культивируемых стареющих фибробластах и клетках печени старых крыс. В основе повышенного синтеза CTGF лежит стимуляция трансформирующего фактора роста- и его рецепторов 1-го и 2-го типов, синтез и содержание которых в фибробластах увеличивается с возрастом [106].

Другой возможной причиной повышения уровня CTGF в структурных элементах дермы, происходящее с возрастом, может быть уменьшение скорости его распада и увеличение время жизни молекулы. Являясь клеточно-внеклеточным протеином, CTGF связывает белки внеклеточного матрикса и интегрины, входящие в состав адгезионных межклеточных контактов [68]. Вероятно, что в связанном состоянии CTGF не подвергается воздействию протеолитических ферментов, что приводит к его медленному разрушению и увеличению содержания в ткани.

Наше исследование продемонстрировало возраст-зависимое снижение общего числа фибробластов, процента пролиферирующих фибробластов, числа кровеносных сосудов в дерме [5]. Мы выявили отрицательную корреляционную взаимосвязь между изменениями общего числа фибробластов, числа пролиферирующих фибробластов и количества фибробластов с положительной окраской на CTGF. Следовательно, можно предположить, что CTGF способствует уменьшению пролиферации фибробластов и снижению их общей численности. Мы так же выявили наличие отрицательной корреляционной взаимосвязи между изменениями числа сосудов и процента сосудов с положительной окраской на CTGF в дерме в возрастном аспекте. Таким образом, можно сделать вывод о негативном влиянии CTGF на рост и регенерацию кровеносных сосудов в дерме с возрастом.

В литературе имеются противоречивые данные о влиянии CTGF на пролиферацию фибробластов и ангиогенез [57]. Кроме общеизвестного стимулирующего влияния на пролиферацию, CTGF способен запускать апоптоз фибробластов [57]. Другой представитель семейства молекул CCN – Cyr61 оказывает ингибирующее влияние на пролиферацию малодифференцированных клеток мышечной ткани за счет повышения экспрессии протеинов, замедляющих прохождения клеток по клеточному циклу, в частности, протеины p53, p16, pRP. Установлено, что синтез Cyr61 в мышцах напрямую связан с активностью протеина Wnt-3a, концентрация которого увеличивается в организме с возрастом [161]. В свою очередь протеин Wnt-3a усиливает синтез CTGF в культуре фибробластов [245]. Существует мнение о тканевой и клеточной специфичности действия CTGF [57]. Опираясь на это предположение, можно сделать вывод, что в коже человека CTGF оказывает ингибирующее влияние на пролиферацию фибробластов и ангиогенез.

Наше предположение подтверждается исследованием, в котором показано, что глюкокортикоиды, обладающие блокирующим эффектом на пролиферацию фибробластов и ангиогенез, наоборот, стимулируют синтез CTGF культивируемыми фибробластами и фибробластами дермы в процессе регенерации раны, увеличение содержания CTGF связано с угнетением пролиферации фибробластов и ангиогенеза [83]. В литературе имеются данные о способности CTGF связываться с VEGF. В результате этого взаимодействия происходит ингибирование ангиогенеза, индуцируемого VEGF [68]. Возможно, поэтому высокий уровень содержания VEGF в сосудах дермы не способен индуцировать ангиогенез в возрастном аспекте. Одним из стимуляторов секреции CTGF является трансформирующий фактор роста-. Однако затем, наоборот, CTGF замедляет синтез трансформирующего фактора роста-, что в конечном счете приводит к снижению функциональной активности фибробластов и угнетению синтеза компонентов матрикса соединительной ткани [69]. Предыдущие исследования продемонстрировали, что эффекты CTGF напрямую зависят от его концентрации. Так, показано, что в низких концентрациях CTGF усиливает пролиферативную активность остеобластов в культуре. Однако его гиперэкспрессия тормозит работу остеобластов и приводит к развитию остеопении у мышей [107]. Следовательно, можно предположить, что повышенное содержание CTGF в дерме, наблюдаемое нами в процессе физиологического старения, оказывает ингибирующее влияние на пролиферацию фибробластов и ангиогенез.

Так как в исследовании мы использовали кусочки кожи плодов и людей мужского и женского пола, то нам было интересно узнать о влиянии пола на активность регуляторов ангиогенеза. Однако проведенный однофакторный дисперсионный анализ, где в качестве фактора использована половая принадлежность, не установил достоверного влияния пола на изменение процента фибробластов, сосудов с положительной окраской на CTGF, общего числа фибробластов и процента фибробластов с положительной окраской на PCNA в дерме, экспрессию ангиомотина, эндостатина, Dll4, Jag-1, VEGF.

Таким образом, на основании результатов нашей работы можно сделать вывод, что снижение активности ангиогенеза, происходящее с возрастом, приводит к ухудшению кровоснабжения дермы, что в свою очередь ведет к снижению общей численности фибробластов и их пролиферативной активности. Следовательно, настоящая работа демонстрирует потенциально новый механизм, лежащий в основе возрастного снижения численности фибробластов дермы. Возможно, используя полученные знания, можно будет найти новый подход к лечению, а главное, к профилактике возрастных изменений кожи, так как именно адекватное кровоснабжение является залогом нормального регенераторного потенциала ткани.