Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Основные методы борьбы со злокачественными новообразованиями..13
1.2 Механизмы гибели опухолевых клеток под влиянием радиотерапии 19
1.2.1 Апоптоз опухолевых клеток .19
1.2.2 Некроз опухолевых клеток .22
1.2.3 Аутофагия опухолевых клеток .24
1.3 Генетическая нестабильность опухолевых клеток 26
1.4 Роль мутаций в формировании радиорезистентности злокачественных опухолей 28
1.5 Роль сигнальных путей в формировании радиорезистентности опухолевых клеток .32
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1 Объекты исследования 35
2.2 Ведение клеточных культур и условия проведения эксперимента 38
2.3 Методы молекулярного анализа 39
2.3.1 Оценка механизмов клеточной гибели 39
2.3.2 Выделение тотальной РНК .39
2.3.3 Электрофорез в агарозном геле .40
2.3.4 Обратная транскрипция 40
2.3.5 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 41
2.3.6 Подбор праймеров к исследуемым генам .42
2.3.7 Анализ уровня экспрессии генов с использованием матрицы HGU133А 43
2.4 Биоинформационный анализ 44
2.4.1. Анализ интенсивности экспрессии генов 44
2.4.2 Поиск генов с заданным уровнем экспрессии 45
2.4.3 Построение сетей молекулярных (белок - белковых) взаимодействий генов 46
2.4.4 Поиск и расчет активации внутриклеточных сигнальных путей.46
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 47
3.1 Сравнительный анализ радиорезистентности раковых клеточных линий K562, HCT-116р (+/+), HCT-116р (-/-) и Me45 . 47
3.2 Поиск общих генов и сравнительный анализ экспрессии в радиорезистентной и радиочувствительных раковых клеточных линиях после облучения их в дозе 4 Гр .52
3.3 Изучение сетей молекулярных (белок-белковых) взаимодействий генов DAAM1, IFNAR2, PALLD и STK17A в радиорезистентной и радиочувствительных раковых клеточных линиях 61
3.4 Изучение внутриклеточных сигнальных путей, на которые оказывают влияние гены DAAM1, IFNAR2 и PALLD .72
3.5 Расчет активации внутриклеточных сигнальных путей в радиорезистентной и радиочувствительных клеточных линиях .82
Заключение 88
Выводы 92
Литература 93
- Роль мутаций в формировании радиорезистентности злокачественных опухолей
- Сравнительный анализ радиорезистентности раковых клеточных линий K562, HCT-116р (+/+), HCT-116р (-/-) и Me45 .
- Изучение сетей молекулярных (белок-белковых) взаимодействий генов DAAM1, IFNAR2, PALLD и STK17A в радиорезистентной и радиочувствительных раковых клеточных линиях
- Расчет активации внутриклеточных сигнальных путей в радиорезистентной и радиочувствительных клеточных линиях
Введение к работе
Актуальность работы. Нарушения в работе генома имеют непосредственное отношение к развитию самого тяжелого недуга человечества - онкологических заболеваний. Ежегодно в мире выявляют более 14 миллионов случаев заболеваний раком, и, по прогнозам, в следующие десятилетия их количество вырастет до 22 миллионов [Schnitt, 2014]. При выборе метода лечения злокачественных новообразований учитывают их вид, стадию заболевания и другие факторы. В настоящее время для лечения больных используют хирургический метод, химио- и радиотерапию. На практике было доказано, что из вышеперечисленных методов радиотерапия имеет менее тяжелые последствия лечения.
Радиотерапия предлагает использовать ионизирующее излучение для разрушения
опухолевых клеток или для сокращения их объема. При проведении радиотерапии источник
излучения находится не в теле пациента. Под действием ионизирующего излучения
происходит разрушение генетического материала опухолевых клеток, что приводит к
торможению их деления и роста. По сравнению со здоровыми клетками, опухолевые клетки
более активны и поэтому более восприимчивы к радиации. При ее воздействии молекулы
воды в опухолевых клетках преобразуются в пероксид радикалы и оказывают разрушающий
эффект на внутриклеточные структуры, преимущественно на ДНК. Гибели опухолевых
клеток также способствуют мутации, которые образуются под действием ионизирующего
излучения. Тем не менее метод радиотерапии независимо от своих достижений сталкивается
с проблемой ускоренной репродукцией опухолевых клеток и радиорезистентностью
злокачественных новообразований [Rycaj K., 2014; Ahmed K.M., 2007; Chakradeo S., 2015].
Известно, что радиорезистентность опухолевых клеток развивается на разном уровне
воздействия на клетку и на каждом из них задействованы различные
молекулы [Sarkadi B., 2006], что может привести к блокированию некоторых
внутриклеточных процессов, нарушению контроля клеточного цикла и
апоптозу [Nielsen D., 2001]. По этим причинам многие специалисты стали рассматривать процесс канцерогенеза в качестве хронического стресса, а радиорезистентность опухоли связывают со сверхэкспрессией стрессовых белков, которая представляет собой реакцию клетки на стрессовое воздействие. Данное предположение было подтверждено в исследованиях, которые проводили на опухолевых клетках Герена крыс. После воздействия ионизирующего излучения на опухолевые клетки в дозе 8 Гр усиливалась экспрессия стрессовых белков. В других исследованиях, например, R.D. Bunting [Bunting R.D., 2002] обнаружено, что искусственное увеличение содержания белка Pgp способно защитить злокачественную опухоль от ионизирующего облучения. Также установлено, что ионизирующее излучение вызывает гиперэкспрессию генов P-gp, MRP1 и LRP в опухолевых клетках различного гистогенеза [Nielsen D., 2001; Hill B.T., 2000]. Поэтому одной из основных причин развития радиорезистентности опухолевых клеток является неправильная экспрессия генов, которая изменяет регуляцию внутриклеточных сигнальных путей.
Известно, что на влияние ионизирующего излучения радиорезистентные опухолевые клетки реагируют не напрямую. Между внешним раздражителем и особой реакцией опухолевой клетки находится особый каскад сигнальных молекул. Он представляет собой биохимический путь, который усиливает или ослабляет внутриклеточный сигнал и преобразует его в форму, позволяющую реализоваться ответным реакциям. Поэтому еще
одним условием для развития радиорезистентных опухолевых клеток, кроме активности отдельных генов является, изменение свойств и внутриклеточной концентрации белков. В данном случае имеется ввиду их биохимическое взаимодействие и взаимосвязи, которые осуществляют передачу сигналов в клетке. Такая совокупность белков формирует внутриклеточные сигнальные пути. Среди них есть такие, которые в клетках большого количества радиорезистентных опухолей имеют дефекты и отклонения от нормы. Поэтому для понимания процесса приобретения опухолевыми клетками устойчивости к ионизирующему излучению необходимо учитывать не только экспрессию отдельных генов, но и активацию внутриклеточных сигнальных путей, компонентами которых эти гены являются.
Исследование генов, ответственных за формирование радиорезистентных опухолевых клеток, и анализ активации внутриклеточных сигнальных путей имеет фундаментальное значение с позиции выявления конкретных генов и практическое значение, которое заключается в усилении ответа радиорезистентных опухолевых клеток на облучение ионизирующим излучением.
Цель исследования
В связи с этим целью настоящего исследования является изучение радиационно-индуцированной динамики транскриптома радиорезистентной и радиочувствительных раковых клеточных линий после облучения на основе функционального анализа генов и активации внутриклеточных сигнальных путей.
Задачи исследования
-
На основе модели культивируемых опухолевых клеток после однократного радиационного облучения выявить в радиорезистентной клеточной линии (К562) гены с постоянно увеличивающимся уровнем экспрессии, а в радиочувствительных клеточных линиях (HCT–116p53 (+/+), HCT–116p53 (-/-) и Me45) выявить гены с уровнем экспрессии, который снижался после 1, 12 или 24 часов эксперимента.
-
Выявить общие гены, которые можно рекомендовать для дальнейшего исследования в качестве генов терапевтического воздействия для радиорезистентной (К562) и радиочувствительных (HCT–116p53 (+/+), HCT–116p53 (-/-) и Me45) клеточных линий.
-
Изучить сети белковых взаимодействий генов – мишеней (DAAM1, IFNAR2, PALLD и STK17A) в радиорезистентной (К562) и радиочувствительных (HCT–116p53 (+/+), HCT–116p53 (-/-), Me45) клеточных линиях.
-
Изучить внутриклеточные сигнальные пути, на которые оказывают влияние гены – мишени (DAAM1, IFNAR2, PALLD и STK17A) и рассчитать их активацию для радиорезистентной (К562) и радиочувствительных (HCT–116p53 (+/+), HCT–116p53 (-/-), Me45) клеточных линий.
Научная новизна исследования
В рамках диссертационной работы впервые проанализирована динамика экспрессии генов в радиорезистентной (К562) и радиочувствительных (HCT–116p53 (+/+), HCT–116p53 (-/-), Me45) клеточных линиях после однократного радиационного облучения. На основании биоинформационного анализа выявлены потенциальные гены DAAM1, IFNAR2, PALLD и STK17A, которые связаны с феноменом радиорезистентности опухолевых клеток. Также впервые получены данные об особенностях активации внутриклеточных сигнальных путей Wnt signaling pathway, Interferon signaling pathway и p53 signaling pathway в радиорезистентных и радиочувствительных клеточных линиях, которые являются значимыми в процессе формирования радиорезистентности опухолевых клеток.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Одной из основных причин развития устойчивости опухолевых клеток к ионизирующему излучению является сверхэкспрессия генов DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A.
-
Участники сетей молекулярных взаимодействий под воздействием сверхэкспресии генов -мишеней (DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A) изменяют свою функциональную активность.
-
Значение активации внутриклеточного сигнального пути - Interferon signaling pathway в радиорезистетной (К562) клеточной линии выше, чем в радиочувствительных (HCT–116p53 (+/+), HCT–116p53 (-/-), Me45) клеточных линиях.
-
Значение активации внутриклеточных сигнальных путей - Wnt signaling pathway и p53 signaling pathway в радиорезистетной (К562) клеточной линии ниже, чем в радиочувствительных (HCT–116p53 (+/+), HCT–116p53 (-/-), Me45) клеточных линиях.
Научно-практическая ценность работы
В рамках исследовательской работы создан подход преодоления радиорезистентности злокачественных клеток, который базируется на выявлении генов-мишеней, блокирование которых позволяет значительно усилить ответ на облучение ионизирующим излучением. Найдены гены, которые отвечают сверхэкспрессией на радиационное облучение в дозе 4 Гр на протяжении всего времени эксперимента. Такого рода подход может быть перспективным для обнаружения ранее неизвестных генов-мишеней. С помощью метода Oncofinder исследованы и получены данные активации внутриклеточных сигнальных путей, в которых задействованы гены-мишени. Такой полнотранскриптомный анализ позволит усилить радиационный ответ злокачественных опухолей, устойчивых к воздействию облучения ионизирующим излучением.
Личное участие автора
Автором проанализирована отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора: на этапах постановки цели и задач, разработки методов их выполнения, проведении
исследований, обработки, анализа и обобщения полученных результатов, написания и оформления рукописи. Результаты исследования опубликованы в научных журналах.
Апробация работы
Материалы, представленные в работе, докладывались на Всероссийской конференции с международным участием «Экологическая физиология и медицина: наука, образование, здоровье населения» (Ульяновск, 2012) и VI Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 25-летию образования медицинского факультета Ульяновского государственного университета (Ульяновск, 2016).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 8 работ в журналах из списка ВАК.
Объем и структура работы
Роль мутаций в формировании радиорезистентности злокачественных опухолей
Радиорезистентность злокачественных опухолей к воздействию ионизирующей радиации, которая развивается вследствие облучения, является одной из главных причин неэффективности лучевой терапии и комплексного лечения. Начальная или приобретенная радиорезистентность злокачественных опухолей способна провоцировать появление рецидивов и метастазов. Радиорезистентность опухоли является следствием таких процессов, как репарация и адаптация, которые обеспечивают поддержание гомеостаза и защиту опухоли. Также радиоустойчивость опухоли может быть вызвана мутациями, длительной гипоксией и дефицитом глюкозы.
Значимую роль при влиянии ИИ на опухолевые клетки играет белок Pgp. Увеличение его концентрации в злокачественных клетках искусственным путем защищает их как от химических веществ, так и от облучения. Еще одним объектом в качестве мишени устойчивости к ИИ выдвигается рецептор эпидермального фактора роста (EGFR). Он обладает тирозинкиназной активностью и является трансмембранным гликопротеином, принимает участие в дифференцировке и регуляции роста клетки. EGFR экспрессируется на поверхности опухолевых клеток и состоит из трех частей: внеклеточного лиганда - связывающего домена, трансмембранного гидрофобного участка и внутриклеточного тирозин -киназного домена. EGFR в результате связывания и активации рецепторной тирозин - киназы, которая находится в плазматической мембране, стимулирует рост и деление клеток. Его рецепторы направлены на фосфорилирование сигнальных молекул, которые активируют каскад mitogen-activated protein kinase (МАРК). Этот каскад сигнальной трансдукции регулирует пролиферацию клеток [196]. Существует несколько механизмов, которые активируют в опухолевых клетках EGFR-зависимые сигнальные пути: сверхэкспрессия EGFR, мутация EGFR и гетеродимеризация этого рецептора. В настоящий момент активно исследуется связь между EGFR и радиорезистентностью опухолевых клеток. По результатам многих работ [81, 121, 137], доказано, что EGFR способен увеличить радиорезистентность клеток опухоли.
Роль репарации повреждений ДНК также является значимой в процессе формировании радиорезистентности. Так, белок гена ATM, который имеет структурное сходство с фосфатидилинозит-3-киназой (Phosphoinositide 3 -kinase - PI3K), накапливается в местах повреждения ДНК. Он приобретает киназную активность за счет связывания с фосфорилированными белками хроматина и белками-сенсорами нарушений структуры ДНК. Двунитевые разрывы ДНК, вызванные ИИ, способствуют активации белка ATM и его гомолога белка ATR. Эти активированные формы белков фосфорилируют ряд своих мишеней, к которым относятся гены TP53, BRCA1, NBS1, Mre11, CHK1, и CHK2. Фосфорилирование мишени CHK2 требует предварительного фосфорилирования комплекса белков Mre11/NBS1/Rad50. Данный комплекс располагается в местах повреждений ДНК и рекрутирует к себе такие молекулы, как PCNA, CHK2, E2F и BRCA1. Вовлеченная PCNA осуществляет остановку клеточного цикла в S - фазе и способствует переходу с репликативного синтеза на репарационный синтез ДНК. Также фосфорилирование мишеней CHK1 и CHK2 инактивирует белки семейства Cdc25. В результате происходит остановка клеточного цикла в фазе - G1 или G2 и подавление активности циклин - зависимых киназ. Кроме того, гены CHK1 и CHK2 амплифицируют сигналы к генам BRCA1 и TP53, что приводит к задержке клеточного цикла в фазе - G1 или G2 и активизирует системы репарации ДНК. Установлено, что онкогенный потенциал мутаций гена АТМ связан с измененной реакцией клетки на повреждения ДНК, которая приводит к генетической нестабильности. Так в облученных клетках, которые содержали дефектный ген АТМ, отсутствовали полная активация CHK1 и CHK2 и остановка клеточного цикла в фазе G1, S или G2.
В контроле клеточного цикла, детекции и в трансдукции сигнала от поврежденной ДНК участвуют два структурно связанных с АТМ протеина – ДНК-зависимая протеинкиназа (DNA-PK) и АТМ-связанный протеин (ATR). Доказано, что при трансфекции гена Ku-80, который кодирует одну из регуляторных субъединиц DNA-PK, в клетках радиочувствительной мышиной линии СНО xrs-6, дефектной по репарации радиационно-индуцированных двойных разрывов ДНК, наблюдается активация DNA-PК. Ее активация приводит к снижению радиочувствительности опухолевых клеток [172]. Вследствие чего мутации гена АТМ приводят к блокированию активизации системы репарации двунитевых разрывов ДНК и увеличивают вероятность размножения опухолевых клеток, устойчивых к ИИ.
Многие исследователи, основываясь на данных экспериментов, считают, что рост радиорезистентности клеток зависит от активности, продукта гена ТР53, белка 53 [124]. Его экспрессия индуцируется ИИ. Кроме того, белок р53 является участником индукции радиационного апоптоза [108]. Но на радиорезистентность клеток оказывает влияние не только этот белок, но и другие участники апоптотического сигнального пути. Клетки меланомы характеризуются высоким уровнем радиорезистентности несмотря на содержание в них немутантного р53. Из-за мутаций генов, которые кодируют киназу АТМ и Chk2/Hcds1 и отвечают за стабилизацию, активацию р53 и за передачу апоптотического сигнала, белок р53 не в состоянии вызывать задержку клеточного цикла или участвовать в запуске процесса апоптоза в ответ на радиационное повреждение ДНК [177]. Главными эффекторными киназами, которые активируются в ответ на радиационное повреждение ДНК, являются Chk1 и Chk2. Так, Chk2, которая выполняет роль опухолевого супрессора, после повреждения ДНК принимает участие в транскрипционной активации р53. Доказано, что мыши с мутантным геном Chk2, наиболее устойчивы к облучению в отличие от мышей с нормальным геном Chk2 [185]. Таким образом, неисправность активации р53 в ответ на повреждение ДНК обусловливает развитие радиорезистентности клеток.
Устойчивость к апоптозу ИИ связывают с работой гена – супрессора ТP53, который регулирует процессы контроля клеточного цикла, апоптоза, репарации ДНК и ангиогенеза [135]. Этот ген способен индуцировать апоптоз как посредством регуляции транскрипции генов, которые кодируют апоптоз (регуляторные белки), так и без нее. Из этих механизмов наиболее важным является экспрессия гена, который кодирует проапоптотический белок Bax и угнетение экспрессии гена, который отвечает за продукцию антиапоптотических белков группы Bcl-2. Доказано, что около 50% злокачественных опухолей человека содержат мутантный белок p53, продукт гена ТP53, который не участвуют в активации Bax [172, 187]. Белок p21BAX является одним из проапоптотических продуктов семейства Bcl-2. В норме белок p21BAX совместно с p21WAF1 при воздействии ИИ участвует в задержке клеточного цикла в фазе - G1. Большинство опухолей различного происхождения имеют мутации, которые являются причиной нарушения способности р53 участвовать в индукции апоптоза за счет активации p21BAX. Установлено, что клетки линии глиобластомы менее радиочувствительны к ИИ, чем медуллобластомная клеточная линия. Для радиорезистентных клеток глиобластомы характерен мутантный p53, который является причиной низкой активации проапоптотического промотора p21BAX [182]. Кроме того, многие опухоли с нормальным p53 имеют мутации самого гена Bax [172].
Сравнительный анализ радиорезистентности раковых клеточных линий K562, HCT-116р (+/+), HCT-116р (-/-) и Me45 .
В радиорезистентной суспензионной клеточной линии K562 и в радиочувствительных клеточных линиях HCT-116p53 (+/+), HCT-116p53 (-/-) и Me45 после облучения ИИ в дозе 4 Гр. встречаются клетки, размер которых уменьшился и изменилась форма (рис.1.). Особенно заметны изменения в радиочувствительных клеточных линиях. Их клетки сжались, а органеллы стали располагаться более компактно. Также встречались клетки, которые увеличились в размере и набухли. Преимущественно все клетки линий HCT-116p53 (+/+), HCT-116p53 (-/-) и Me45 располагались группами, но после облучение количество разрозненных клеток увеличилось. Таким образом, облучение ИИ в дозе 4 Гр вызывает морфологические изменения клеток радиорезистентной (K562) и радиочувствительных (HCT-116p53 (+/+), HCT-116p53 (-/-) и Me45) клеточных линий.
Для определения степени чувствительности опухолевых клеток линий K562, HCT-116р (+/+), HCT-116р (-/-), Me45 к воздействию ионизирующего излучения в дозе 4 Гр использован метод проточной цитофлуометрии с применением Annexin-V-FITC и иодида пропидия.
В процессе апоптоза на поверхность клетки высвобождается фосфотидилсерин. Annexin-V представляет собой фосфолипид-связывающий протеин, который способен в присутствии ионов кальция связываться с фосфотидилсерином. Поэтому клетки с признаками апоптоза связываются с Annexin-V-FITC. Клетки, имеющие признаки некроза связываются с Annexin-V-FITC и иодидом пропидия. При некрозе повышается проницаемость клеток для Annexin-V-FITC, который связывается с фосфотидилсерином на внутренней поверхности мембраны клетки. На рисунке 2 показаны данные определения клеточной смерти (апоптоз, некроз) в раковой клеточной линии К562.
Через 24 часа в клеточной линии K562 количество некротических клеток превышало похожий показатель в контрольной группе. Количество клеток с признаками апоптоза в экспериментальной группе выше, чем в группе клеток, не подвергающихся облучением. В клеточной линии Me45 количество клеток с признаками апоптоза выше (рис.3), чем в группе клеток линии K562. Количество клеток с признаками некроза в группе Me45 составило 13,83%, тогда как в K562 данный показатель составил 6,1% после облучения в дозе 4 Гр. Несмотря на то, что для клеточных линий K562 и Me45 характерны одинаковые механизмы клеточной смерти их чувствительность к ионизирующему излучению отличается.
В клеточных линиях HCT-116р (+/+) и HCT-116р (-/-) облучение ионизирующем излучением вызывало гибель по пути апоптоза у 8,2% и 7,9% клеток и гибель по пути некроза 11,6% и 10,3% клеток (рис.4). В клеточных линиях HCT-116р (+/+) и HCT-116р (-/-), также, как и в клеточных линиях K562 и Me45, преобладает такой механизм клеточной гибели, как некроз.
Выявлено, что клетки линий K562, HCT-116р (+/+), HCT-116р (-/-), Me45 обладают разной степенью чувствительностью к облучению ионизирующем излучением (рис. 5).
В клеточных линиях HCT-116р (+/+) и HCT-116р (-/-) количество клеток с признаками апоптоза и некроза составило 24,9% и 20%. Общее количество клеток, которые имели признаки деградации после облучения в дозе 4 Гр в клеточной линии Me45 составило 28,4%. Наиболее радиоустойчивой клеточной культурой является K562. При облучении ее в дозе 4 Гр только 12,8% клеток имели признаки деградации. Таким образом, проведенные эксперименты показали, что клеточная линия K562 менее чувствительна к воздействию ИИ, чем клетки линий HCT-116р (+/+), HCT-116р (-/-) и Me45.
Изучение сетей молекулярных (белок-белковых) взаимодействий генов DAAM1, IFNAR2, PALLD и STK17A в радиорезистентной и радиочувствительных раковых клеточных линиях
В основе всех процессов, протекающих в клетке, лежат сети молекулярных (белок – белковых) взаимодействий, которые представляют собой основу интерактома клетки. Исследование таких сетей при развитии патологии позволяет найти потенциальные мишени для терапевтического воздействия [171]. Поэтому при помощи базы данных STRING 9.0 (Search Toolforthe Retrievalof Interacting Genes/Proteins, которая доступна по адресу http://string-db.org/) был проведен анализ существующих взаимодействий среди белков отобранных генов. На основе полученных данных выявлены многочисленные взаимодействия между белками исследуемых генов и реконструирована генная сеть. Как видно из рисунка 11, продукт гена DAAM1 непосредственно взаимодействует с белками генов FNBP1, TRIP10, ARHGAP1, DVL1, DVL2, DVL3, PTBP2, RHOA, SRRM4, через которые влияет на функционирование белков генов ARHGDIA, BAIAP2, CDC42, PAK1, PAK2, PARD6A, PTBP2, TNK2, TRIP10, WAS, WASL.
В таблице 3 приведены результаты анализа экспрессии генов радиорезистентной и радиочувствительных клеточных линий, на активность которой оказывает влияние ген DAAM1. В клеточной линии K562 отмечен высокий уровень экспрессии генов CDC42, RHOA, TNK2, а у генов ARHGAP1, ARHGDIA, BAIAP2, WAS экспрессия снижается в течение всего эксперимента.
В радиочувствительной раковой клеточной линии HCT-116 с мутантным геном TP53 постоянный рост экспрессии отмечен у генов ARHGDIA, DVL1, DVL2, PAK1, RHOA, TNK2, а гены BAIAP2, WAS отличаются постоянно снижающейся экспрессией. В клеточной линии рака прямой кишки человека HCT-116 с нормальным геном TP53 гены CDC42, DVL2, DVL3, PAK1, TNK2, TRIP10 отличаются непрерывным ростом экспрессии, а у генов ARHGAP1, BAIAP2, DVL1, PTBP2, WAS экспрессия стабильно снижается. В раковой клеточной линии Me45 экспрессия неизменно увеличивается у генов DVL2, PARD6A, TNK2, TRIP10, WAS и снижается, достигая своего минимального значения, к 24 часам после облучения у гена PTBP2.
На основе анализа молекулярных (белок-белковых) взаимодействий и экспрессии 17 генов можно предположить, что взаимодействие гена DAAM1 с генами DVL2, PTBP2 и TNK2 и их продуктами является наиболее важными в процессе развития радиорезистентности опухолевых клеток. На рисунке 12 представлены графики, на которых экспрессия генов DVL2, PTBP2 и TNK2 в клеточной линии К562 существенно отличается от клеточных линий HCT-116р (-/-), HCT-116р (+/+) и MЕ45.
После радиационного облучения интенсивность экспрессии гена TNK2 (рис. 12 а) в радиорезистентной клеточной линии значительно выше, чем в радиочувствительных. Такая активность гена TNK2 может являться следствием взаимодействия его с геном – мишенью DAAM1. Доказано, что активность гена TNK2 влияет на злокачественную опухоль, делая ее устойчивой к ионизирующему излучению. Также TNK2 участвует в регуляции гена ATM [147], высокий уровень экспрессии которого играет ключевую роль в формировании радиорезистентности опухолевых клеток и затрудняет процесс радиотерапии [79, 100, 167].
Экспрессия гена DVL2 (dishevelled 2) также отличается в клеточных линиях. Его гиперэкспрессия (рис. 12 б) в К562 после 12 часов сменяется резким спадом, что может быть обусловлено влиянием на него гена DAAM1. В результате уровень экспрессии гена DVL2 в радиочувствительных клеточных линиях был значительно выше. Кроме того, по данным ряда исследований, данный ген выдвинут в качестве новой терапевтической мишени, которая отвечает за радиорезистентность рака поджелудочной железы [184], что подтверждает наши предположения.
Во всех клеточных линиях экспрессия гена PTBP2 (рис. 12 в) достигает своего минимального значения к 24 часам после облучения. Но перед этим, в К562 был зафиксирован ее резкий рост после 12 часов с момента облучения, что также может быть связано с влиянием гена DAAM1.
На рисунке 13 показано, что ген IFNAR2 взаимодействует с генами TYK2, GNB2L1, IFNA8, STAT1, IFNW1, STAT2, JAK1, IFNAR1, JAK2, STAT3 и IFNA5, через которые осуществляется связь с генами IL2RB, IRS1, EGFR, IFNGR1, IRF1, EP300, CREBBP и IRF9
В таблице 4 представлены данные экспрессии генов радиорезистентной и радиочувствительных клеточных линий, на активность которых оказывает влияние ген IFNAR2. В радиорезистентной клеточной линии высокий уровень экспрессии отмечен у генов STAT2, JAK1, IFNAR1 и IFNGR1, а у генов GNB2L1 и IRF9 экспрессия снижается в течение 1, 12 и 24 часов.
В радиочувствительной раковой клеточной линии HCT-116p (-/-) только у гена TYK2 экспрессия постоянно увеличивается к 24 часам, а у генов IFNA8, STAT1, IL2RB и IFNGR1 она стабильно снижается. В клеточной линии HCT-116p (-/-) гены IRS1 и EGFR отличаются непрерывным ростом экспрессии, а у генов STAT2, IRF1 экспрессия снижается в течение всего эксперимента. В клеточной линии Me45 наблюдается беспрерывное увеличение экспрессии у генов GNB2L1, IFNA8, RF1 и снижение ее до минимального значения к 24 часам после облучения у гена PIFNW1.
Опираясь на данные, полученные в ходе анализа молекулярных взаимодействий и экспрессии 18 генов, можно предположить, что связь гена IFNAR2 с генами GNB2L1, IRF9, STAT2, JAK1 и IFNAR1и их продуктами играет ключевую роль в становления устойчивости опухолевых клеток к воздействию ИИ. На рисунке 14 приведены графики, на которых уровень экспрессии генов GNB2L1, IRF9, STAT2, JAK1 и IFNAR1 в радиорезистентной клеточной линии значительно отличается от радиочувствительных клеточных линий.
Гиперэкспрессия гена – мишени IFNAR2, вызванная воздействием ИИ, служит причиной активности гена GNB2L1 (рис. 14 а) в радиорезистетной клеточной линии. Известно, что ген GNB2L1 играет важную роль в адгезии и миграции клеток глиомы [67], а также регулирует стабильность гипоксии индуцибельного фактора HIF-1 (Hypoxia-induciblefactor 1) [143]. Ошибка в регуляции приводит к избыточной экспрессии HIF-1, что является причиной плохого ответа на радиотерапию в некоторых типах злокачественных опухолей [59]. Доказано, что в случае, если HIF-1 не функционирует в опухолевых клетках, их уровень радиочувствительности повышается [191, 195]. Кроме того, в радиочувствительных клеточных линиях, где ген IFNAR2 не провоцирует спад экспрессии гена GNB2L1, в Ме45 она увеличивается, а в HCT-116р (-/-) и HCT-116р (+/+) не имеет четкой динамики развития.
Другой пример – ген IRF9 (рисунок 14 б), уровень экспрессии которого также снижается из-за взаимодействия с геном IFNAR2. IRF9 является одним из главных участников сигнального пути Interferon signaling pathway (IFN). Последние исследования доказали, что радиорезистентность злокачественных опухолей может быть связана с неправильным функционированием сигнального пути IFN [131].
Взаимодействие гена IFNAR2 в клеточной линии К562 с генами STAT2, JAK1 и IFNAR1 (рис. 14 в, г, д), наоборот, приводит к росту их уровня экспрессии. Гены STAT2, JAK1 и IFNAR1 являются участниками сигнального пути Jak/STAT signaling pathway, неправильное функционирование которого приводит к блокированию процесса апоптоза и приобретению опухолевыми клетками устойчивости к воздействию ионизирующего облучения [117, 190]. Причиной неправильного функционирования Jak/STAT signaling pathway может являться постоянный рост экспрессии генов STAT2, JAK1 и IFNAR1. В радиочувствительных клеточных линиях экспрессия генов STAT2, JAK1 и IFNAR1, на которую (рис. 14 в, г, д) не влияет активность гена IFNAR2, не имеет четкой направленности. Она изменяется в течение всего эксперимента и значительно отличается от уровня экспрессии генов в клеточной линии K562.
Как видно из рисунка 15, продукт гена PALLD непосредственно взаимодействует с белками генов TGFB1, EPS8, AKT1, ACTN1, LPP, ACTN2, SRC и EZR.
Расчет активации внутриклеточных сигнальных путей в радиорезистентной и радиочувствительных клеточных линиях
Как исследователи, так и клиницисты – практики неоднократно отмечали в последние годы, что назначение таргетных препаратов (таких, как моноклональные антитела — мабы или ингибиторы киназ — нибы) онкологическим пациентам по неполным данным об уровне экспрессии отдельных белков – онкогенов может оказаться неэффективным из-за неучета большого количества других онкогенов и онкосупрессоров, которые могут нейтрализовать терапевтическое действие назначенного препарата [13, 41, 109]. Известно, что в опухолевых клетках некоторые сигнальные пути активно принимают участие в онкогенезе, тогда как другие находятся в неактивном состоянии. Активность сигнальных путей клетки влияет на метастазирование опухоли и ее резистентность к воздействию ИИ. Наиболее полную картину о механизмах активации внутриклеточных сигнальных путей дают методы полнотранскриптомного анализа [141].
Поэтому отобранные дифференциально экспрессирующиеся гены DAAM1, IFNAR2, PALLD и STK17A загружались в систему Qiagen, которая отобрала сигнальные пути – Wnt signaling pathway, Interferon signaling pathway и p53 signaling pathway, участниками которых они являются. С помощью метода Oncofinder рассчитана их активация в радиорезистентной и радиочувствительных клеточных линиях.
На рисунке 21 показаны данные, отражающие влияние ионизирующего излучения в дозе 4 Гр на активацию сигнального пути Wnt signaling pathway во всех клеточных линиях. Его активация в линиях HCT-116p53 (+/+), HCT-116p53 (–/–) и Me45 до 12 ч снижается, а после наблюдается ее рост. В линиях HCT-116p53 (+/+) и HCT-116p53 (–/–) значения активации после 24 ч значительно ниже, чем в линии Me45. В радиорезистентной клеточной линии K562 активация этого сигнального пути снижается на протяжении всего эксперимента.
Графики, отражающие влияние ионизирующего излучения в дозе 4 Гр на активацию Interferon signaling pathway и p53 signaling pathway (рис. 22, 23), показывают, что, несмотря на схожий характер активации в клеточных линиях К562, HCT-116p53 (–/–), HCT-116p53 (+/+), ее значения в этих линиях заметно отличаются. Наибольшего значения активация Interferon signaling pathway достигает в радиорезистентной раковой клеточной линии после 24 часов, а в радиочувствительных клеточных линиях относительно низкие ее значения сохраняются до конца эксперимента.
Как видно из рисунка 23, активация пути p53 signaling pathway в радиорезистентной и радиочувствительных клеточных линиях также отличается. В HCT- 116p53 (+/+) и HCT-116p53 (–/–) она достигает своего максимального значения после 12 часов с начала эксперимента, а к 24 часам наблюдается ее спад. В клеточных линиях K562 и Me45 активация одинаково снижается, но после 12 часов в K562 она начинает расти, тогда как в Me45, напротив, продолжает снижаться.
Изучение активации сигнальных путей Wnt signaling pathway, Interferon signaling pathway и p53 signaling pathway в клетках линии K562, HCT-116р (+/+), HCT-116р (-/-) и Me45 через 1, 12 и 24 часов после радиационного излучения в дозе 4 Гр выявило ряд значительных отличий. В радиорезистентной клеточной линии К562 активация сигнальных путей Wnt signaling pathway, Interferon signaling pathway и p53 signaling pathway значительно отличалась от их активации в радиочувствительных клеточных линиях (рис. 21-23).
Ранее было продемонстрировано, что Interferon signaling pathway активирован в радиорезистентных опухолевых клетках [197]. Ключевым белком этого сигнального пути является белок, кодируемый геном STAT1. Белок IFNAR2 физически взаимодействует с белком STAT1. Жан и др. показали, что сверхэкспрессия STAT1 способствует формированию радиорезистентности клеток рака молочной железы [200]. Фрикнэс и др. доказали, что клетки миеломы с гиперэкспрессией STAT1 более радиорезистентны, чем клетки с низким уровнем экспрессии STAT1 [104]. В наших экспериментах увеличение экспрессии генов STAT1 (табл. 11.) и IFNAR2 наблюдалась только в радиорезистентной клеточной линии на протяжении всего эксперимента. Таким образом, показателем радиорезистентности помимо гена STAT1 может служить экспрессия гена IFNAR2. Многие злокачественные опухоли человека содержат мутации в гене ТР53 и большинство из них имеют генетические повреждения в p53 signaling pathway [180]. Например, увеальная меланома иногда имеет мутации в гене ТР53 [119, 120, 142], которые препятствуют нормальному функционированию p53 signaling pathway. В связи с этим увеальная меланома способна приобретать низкую радиочувствительность. В наших экспериментах мы использовали три клеточные линии с мутантным геном ТР53: это радиочувствительные клеточные линии HCT–116p53 (-/-) и Me45, и радиорезистентная клеточная линия К562. Во всех клеточных линиях белок р53 неактивен. Несмотря на это, активация p53 signaling pathway в этих клеточных линиях различна. В линии К562 радиационное облучение не влияет на активность p53 signaling pathway на всем протяжении эксперимента (рис. 21). В радиочувствительной клеточной линии HCT–116p53 (-/-) активность p53 signaling pathway через 1 час остается неизменной, а через 12 и 24 часов увеличивается, хотя остается на несколько более низком уровне, чем в изогенной клеточной линии HCT–116p53(+/+) с геном ТР53 дикого типа (рис. 21). В радиочувствительной клеточной линии Me45 активность p53 signaling pathway снижается в течение всего времени эксперимента. Данные наших экспериментов демонстрируют, что величина экспрессии гена ТР53 не связана с активностью p53 signaling pathway.