Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. АКТОШОЗИНОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ НИЗКОДИШФЕРЕНЩРОВАННОЙ РАБДОМИОСАРКОМЫ С ПОМОЩЬЮ ТРАДИЦИОННЫХ МЕТОДОВ МЫШЕЧНОЙ БИОХИМИИ 16
Материалы и методы 17
Результаты и обсуждение 19
ГЛАВА 2. МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ АКТОШОЗЙНА ИЗ НИЗКОДИФФЕРЕН- ЦИРОВАННЫХ РАБДОМИОСАРКОМ 29
Материалы и методы 31
Результаты 33
Критерий степени чистоты опухолевого актомиозина 33
Факторы, влияющие на содержание примесей в
препаратах опухолевого актомиозина 35
Обсуждение 39
Проблемы выделения актомиозина из низкодиф-ференцированных рабдомиосарком . 39
Возможные подходы к получению опухолевого экстракта, содержащего большое количество
актомиозина и минимальную примесь хроматина. 41
Условия, препятствующие экстракции хроматина и благоприятные для экстракции актомиозина при 0.3 <^<0.5, рН 7.0 43
Гомогенизация 43
Растворы для гомогенизации и отмывка гомогената 44
Экстракция актомиозина 47
Локализация опухолевого миозина 49
Возможность применения метода 5 для выделения актомиозина из клеток, сходных с клетками А7 49
ГЛАВА 3. АКТOМИO3ИН ИЗ РАБДОМИОСАРКОМ 51
Материалы и методы 51
Результаты 56
ДСН-электрофорез 56
М-электрофорез 56
Соотношения концентраций легких цепей миозина в опухолевых и скелетно-мышечных актомиозиновых препаратах 59
Активность Са -АТФазы . 61
Синтетические миозиновые филаменты 62
Обсуждение 62
Электрофорез 62
Соотношения концентраций миозиновых легкихцепей 63
АТШаза и филаменты 65
ГЛАВА 4. СОДЕРЖАНИЕ МИОЗИНА И АКТИНА В НИЗШДИШФЕРЕНЦИРО-ВАННОЙ РАБДОМИОСАРКОМЕ 67
Материалы и методы 67
Результаты 68
Обсуждение 70
ГЛАВА 5. ОСНОВНЫЕ ИТОГИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА СОКРАТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ РАБДОМИОСАРКОМ 74
ГЛАВА б. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ СВЕДЕНИЯ, СЛЕДУЮЩИЕ ИЗ ДАННЫХ О СОСТАВЕ ОПУХОЛЕВЫХ БЕЛКОВ 84
Диагностика рабдомиосарком 84
Определение тканевого типа клеток, не имещих выраженных морфологических тканеспецифичных признаков 85
Индивидуальные характеристики линий опухолевых и нормальных клеток in vitro 87
Метод исследования многокомпонентных субклеточных элементов 88
ВЫВОДЫ 89
ЛИТЕРАТУРА 91
СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ 108
- Материалы и методы
- Критерий степени чистоты опухолевого актомиозина
- Соотношения концентраций легких цепей миозина в опухолевых и скелетно-мышечных актомиозиновых препаратах
- Материалы и методы
- ОСНОВНЫЕ ИТОГИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА СОКРАТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ РАБДОМИОСАРКОМ
Материалы и методы
Опухоль А7, индуцированная в 1968 г. введением 20-метилхо-лантрена в мышцы бедра мышей CC57W, затем многократно перевивавшаяся и клонировавшаяся in vivo, была предоставлена и охарактеризована как БД РМС И.Н.Швембергер /22/.
Традиционными здесь названы методы выделения AM, разработанные для скелетно-мышечных белков, основанные на неизбирательной экстракции их при ионной силе (j ) 0.5-1.0, рН 6.5-9.2 и последующем избирательном осаждении AM снижением v . до величин 4 0»3 при рН около 7. Нередко перед экстракцией AM мышечный гомогенат промывают раствором, удаляющим саркоплазматические белки, но не экстрагирующим миофибриллярные {j - 0.05-0.24, рН 7), что снижает степень гетерогенности первичного экстракта и несколько упрощает последующие операции, но мало влияет на конечный состав препарата AM и, таким образом, не принципиально. В то же время, этот дополнительный этап увеличивает время выделения AM и риск протеолити-ческого видоизменения или полной деградации искомых белков, что, как было отмечено выше, особенно опасно при работе с опухолями. По этим причинам в данной серии экспериментов отмывка гомогената не применялась.
Ткань А7, очищенная от продуктов некроза, или бедренные мышцы мышей CC57W измельчали ножницами, помещали в ступку, наполненную жидким азотом (-196) и растирали в тонкий порошок. AM экстрагировали из этого гомогената 30-60 мин в 10 объемах одного из растворов следующего состава:
Опухолевые экстракты образуют в этих условиях вязкий гель, из которого очень трудно удалить гомогенат. Поэтому перед осветлением их разбавляли 5мМ ЭДТА рН 7 до у= 0.42. Если требовалось более эффективное воздействие, то экстракт замораживали в жидком азоте на сутки, размораживали в водяной бане при 37 и разбавляли 5мМ ЭДТА рН 7 до JJL= 0.42. После осветления (I час, 20000g ) опухолевые экстракты вновь разбавляли 5мМ ЭДТА рН 7 до LL = 0.06 для осаждения AM.
Мышечные экстракты осветляли (I час, 20000g ), обычно, без предварительной обработки, затем разбавляли 5мМ ЭДТА рН 7 сразу до и.= 0.06.
Критерий степени чистоты опухолевого актомиозина
Примесь, подлежащая устранению из препаратов опухолевого актомиозина, по-видимому, - хроматин. Его главный белковый компонентгистоны. Поэтому, определяя электрофорезом содержание гистонов в препаратах, можно следить за изменением содержания в них всего комплекса примесей, вплоть до довольно низких величин. Основной помехой для электрофоретического обнаружения легких цепей миозина с молекулярным весом 18500 (L18) и 16500 (L16) служат гистоны НЗ, Н2В, Н2А и Н4 (глава I; /12/), их удаление из актомиозина А7 необходимо в первую очередь. В актомиозиновых препаратах А7, обогащенных гистонами, содержание Н4 обычно гораздо ниже, чем НЗ, Н2В или Н2А. Зона НЗ мигрирует в диск-ДСН-электрофорезе вместе с L18, поэтому НЗ также не подходит для регистрации содержания хроматина в препаратах. Остаются Н2В и Н2А.
Для наблюдения за изменением содержания примесей в опухолевом актомиозине при изменении условий выделения необходимо определять соотношение концентраций гистонов и сократительных белков. Из числа последних особенный интерес представляет миозин, молекула которого состоит из 4-6 субъединиц. Его легкая цепь с молекулярным весом 20700 (обозначаемая по традиции LC25 илиЬ25 в соответствии с ее подвижностью в ДСН-электрофорезе) занимает особенно удобную позицию в диск-ДСН-электрофорезе для сравнения с гис-тонами: на расстоянии, достаточном для полного разделения при любых соотношениях концентраций миозина и гистонов, но не слишком далеко и в области геля со сравнительно низким уровнем фона.
По этим причинам в качестве показателя чистоты актомиозиш вых препаратов А7 использовалось отношение где квадратными скобками обозначены концентрации легкой цепи миозина L25 и гистонов Н2В и Н2А, а коэффициент 0.5 введен для удобства интерпретации: если [ь25] сравнивается с усредненной величиной концентрации главных примесных компонентов, то легко оценить шансы электрофоретической идентификации двух других мио-зиновых легких цепей - L18 и L16, концентрации которых близки к [Ъ25] , а подвижности очень близки к подвижностям Н2В и Н2А.
Отношение принимается равным такому же отно 0.5( [Н2В] + [Н2А[) шению оптических плотностей соответствующих электрофорезных зон, то есть площадей пиков поглощения (S) на денситограммах . Обозначим эту величину через К. Каждая из ве 0.5( SH2B + %2А) личин К была получена по денситограмме одного геля, поэтому они лишь приблизительно отражают концентрации компонентов, но позволяют судить о тенденциях и масштабах изменений состава препаратов в ответ на изменение условий их выделения (табл.1).
Соотношения концентраций легких цепей миозина в опухолевых и скелетно-мышечных актомиозиновых препаратах
Определенное денситометрией ДСН-электрофорезных гелей соотношение [ь25] : L18J : [Ыб] очень близко к стехиометрическому (1М Ъ25:2М Ы8:1М L16 или 2В% L25:50# Ы8:22# Ыб)1 в препаратах скелетно-мышечного актомиозина (табл.3), что свидетельствует о том, что в наших условиях денситометрический метод дает достаточно точные результаты (ср. с данными Лови, Рисби /89/) и позволяет уверенно обсуждать данные о субъединичном составе опухолевого миозина. В актомиозине А7 (табл.3) квоты L25 и Ыб во фракции легких цепей иные, чем в скелетно-мышечном актомиозине:
Приведенное здесь весовое соотношение вычислено на основе молекулярных весов субъединиц кроличьего миозина из быстрых скелетных мышц: L25 - 20700, Ы8 - 18500, Ыб - 16500 /60,88/.
Соотношение [Ы8р] :[Ы8+Ы8Р] , полученное денситометрией М-электрофорезных гелей, определено для актомиозина А7 менее точно, чем [Ь25І : \Ь1&\ ! ьіб] , поскольку был обработан только один М-электрофорезный гель, содержащий компоненты актомиозина А7. Полученные данные (табл.3), однако, вполне достаточны для того, чтобы заключить, что величины [Ы8Р] : [Ы8+Ы8Р] в акто-миозиновых препаратах, выделенных из скелетных мышц и опухоли А7, очень близки.
Актомиозиновые препараты, выделенные из пяти РМС в наших предварительных экспериментах /10/, также содержали все скелет-но-мышечные легкие цепи миозина. В трех из этих препаратов были определены соотношения концентраций легких цепей миозина. Полученные величины являются ориентировочными, так как характеристика каждого из этих препаратов - результат денситометрии одного электрофорезного геля, а кроме того, как отмечалось выше, препараты содержали большое количество примесей. Средние арифметические этих величин таковы: 38# L25, 4-8$ L18, 14$ Ыб. Это соотношение интересно тем, что оно очень близко к соотношению концентраций миозиновых легких цепей опухоли А7 (табл.3), определенному более точно.
Материалы и методы
Аномалии в структуре и функционировании скелетно-мышечного сократительного аппарата часто связывают с аномальностью входящих в него сократительных белков, и, в частности, миозина, являющегося одной из двух крупнейших белковых фракций дефинитивных скелетных мышц /56,68,69/.
Клетки А7, в которых не обнаружено структур, в достаточной мере сходных с миофибриллами /22/, синтезируют миозин скелетно-мышечного типа с нормальным набором и количественным соотношением субъединиц (гл.З). Но количество миозина, производимого клетками НД FMC, возможно, не достаточно для построения нормального миофибриллярного комплекса. Или, может быть, структурная аномальность сократительной системы А7 связана с какой-либо иной аномальностью комплекса сократительных белков, например, с изменением относительного количества актина, составляющего вторую крупнейшую белковую фракцию скелетных мышц и непосредственно взаимодействующего с миозином в процессе сокращения.
Проверка справедливости предположений описана ниже. Одновременно, исследование соотношения количеств миозина и актина в НД РМС предоставляет материал для обсуждения основной проблемы данной работы: механизма регуляции генной экспрессии в связи с ци-тодифференцировкой.
Препараты, использовавшиеся для определения содержания миозина и актина в опухоли А7 и бедренных мышцах взрослых мышей CC57W, были приготовлены следующим образом. Мышечную или опухолевую ткани, освобожденные от стромы и продуктов некроза, гомогенизировали в четырех объемах ЮМ мочевины. Затем в суспензии вводили 2% додецилсульфата натрия (ДСН) и Ъ% -меркаптоэтанола. После чего суспензии были доведены до полного растворения добавкой 11-92 объемов раствора, содержащего 8М мочевину, 2% ДСН, Ь% р -меркаптоэтанол и помещены в жидкий азот (-196). Перед электрофорезом пробы были разбавлены тем же раствором в 2-4 раза. Эти препараты обозначаются как растворы мышц и А7.
Миозин из быстрых скелетных мышц был выделен по Трейер, Перри /124/.
Применялся человеческий сывороточный альбумин фирмы Reanal.
Для определения ядерного и клеточного объемов ткань А7 была мягко диспергирована гомогенизатором Поттера в растворе Хэнкса. Гомогенат содержал большое количество неповрежденных клеток, в этих условиях приобретавших шарообразную форму, удобную для определения объема. Диаметры клеток и ядер были измерены окуляр-микрометром М0В-1-15х.
Методы диск-ДСН-электрофореза, денситометрии и определения концентрации белков указаны в главах 1-3.
Основные итоги определения состава сократительных белков рабдомиосарком
Данные о сократительных белках РМС свидетельствуют в большинстве случаев о том, что эти опухоли содержат миозин скелетно-мышечного типа или, по крайней мере, некоторые его субъединицы.
Хирамото с соавторами /71/ исследовали шесть РМС человека. Они показали, что в цитоплазме трех из них содержатся антигены, реагирующие с антисывороткой против скелетно-мышечного дефинитивного миозина; в остальных РМС такие антигены не были обнаружены.
Хилдебранд с соавторами /69/ выделели и охарактеризовали актомиозин из большого количества кроличьих и крысиных высоко-дифференцированных (БД) РМС . Миозиновые легкие цепи всех опухолей соответствовали эмбриональной (миотубной) скелетно-мышеч-ной изоформе: Ь25 и L18 в приблизительно равных количествах (электрофорез в условиях, при которых L25 и L26 не различаются) , Ы8Р и L16 не обнаружены. Но по АТФазной активности (в 10-20 раз ниже скелетно-мышечной) и электрофоретической подвижности в неденатурирующих условиях опухолевый миозин резко отличался от эмбрионального. Эти различия авторы объясняют предполагаемой дефектностью тяжелых цепей миозина опухолей, связывая с нею иммобильность сократительного аппарата РМС.
Наши предварительные данные о миозине из пяти мышиных РМС, индуцированных 20-метилхолантреном /10/, таковы: содержание миозина во всех РМС примерно на 1-2 порядка ниже, чем в мышцах; все РМС содержат полный набор дефинитивных скелетно-мышечных
Индуцированные N:US2 первичные опухоли, содержащие участки с отчетливой саркомерной структурой легких цепей (L25, Ы8, Ы8Р, L16); в трех из этих опухолей, для которых получены количественные данные, соотношение концентраций легких цепей сходно с этим соотношением в А7 (глава 3).
Но некоторые РМС, содержат, возможно, только миозин, тлеющий ъ немышечного типа /25/ - L20 и L17, т.е. такие, которые синтезируются недифференцированными миобластами и немышечными клетками. Эти данные, так же как изложенные выше результаты Хирамото с соавторами, были получены на РМС человека. Вполне возможно, что три РМС, в которых Хирамото с соавторами не обнаружили субъединиц скелетно-мышечного миозина, содержали, как и опухоль, исследованная Адельштейном и Конти, немышечный миозин. Не менее вероятно, однако, что опухоли, не содержащие скелетно-мышечного миозина, были диагностированы как РМС ошибочно.
Резюмируя качественные и полуколичественные данные о субъединичном составе миозина из мышиных, крысиных, кроличьих и человеческих скелетно-мышечных опухолей, необходимо подчеркнуть, что ни в одной из исследованных РМС не было обнаружено таких комплексов миозиновых субъединиц, которые йе были бы совместимы ни с одной из известных изоформ. Но на большом количестве опухолей обнаружены нормальные комбинации субъединиц, соответствующие скелетно-мышечному дефинитивному, скелетно-мышечному эмбриональному и немышечному дифференцировочным статусам. Таким образом, координация синтеза изоформ миозина, определяющая взаимоисключение субъединиц, принадлежащих разным изоформам, не нарушена в клетках исследованных РМС.