Введение к работе
Актуальность проблемы.
Пырейник {Eltjnms L.) является крупнейшим родом в трибе Пше-шщевые (Triticeae Dum.) семейства Злаковые (Poaceae Barnh.) и состоит более чем из 150 полиплоидных видов (Цвелев, 1976; Dewey, 1984). Виды этого рода, поделенные на ряд секций, распространены почти во всех внетропических странах обоих полушарий, а частично даже и в горных районах тропиков.
Широкий естественный ареал этого рода, охватывающий умеренный пояс Евразии: от зоны вечной мерзлоты и лесного пояса Сибири до аридных зон Казахстана и высокогорий Памиро-Алая обеспечивается высокой экологической пластичностью его представителей и устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды.
На территории бывшего СССР произрастает свыше 70 видов, большое количество подвидов и разновидностей пырейника (Черепанов, 1981) с широким диапазоном изменчивости. Многие виды представляют интерес как кормовые интродуценты (Макарова, 1974; Денисов, 1980) и как потенциальные доноры полезных признаков для улучшения хлебных культур (Lu, Bothmer 1990, 1991; Dong et al., 1992).
Виды и популяции рода пырейник заключают в себе большой запас генетической изменчивости, значительная часть которого не имеет четкого фенотипического выражения в морфологических или иных внешне различимых признаках. Эта часть представляет своего рода скрытый запас генетической изменчивости — генетический потенциал, который играет большую роль в существовании вида и его эволюции.
Однако, данные о внутривидовых пределах изменчивости и общем потенциале рода во многом противоречивы и очень ограничены. Крайне затруднены: анализ морфологически однородных популяций, идентификация и маркирование особей и генотипов, не имеющих внешних фенотипических различий. Практически отсутствуют сведения о чистоте исходных родительских форм, о генетическом расщеплении в гибридных поколениях, а следовательно, о наследственной природе признаков, как диагностических, так и хозяйственно-ценных.
Многие виды рода являются сенокосными и пастбищными кормовыми растениями. В силу исключительно высокой зимостойкости П. сибирского, особенно перспективным является возделывание данного вида в зоне вечной мерзлоты, на обширных территориях Республики Саха (Якутия) и Магаданской области, где в настоящее время площади под многолетними травами прирастают почти исключительно за счет волоснеца (Денисов и др., 1980). Но созданные к настоящему времени сорта П. сибирского (волоснеца) несмотря на высокие
кормовые качества, остаются невостребованными из-за наличия жесткой шероховатой ости, ухудшающей поедаемость его животными и, самое главное, крайне затрудняющей механизированный посев семян (Макарова, 1965; Новоселова и др., 1978; Денисов, 1980). Предпринималась поцытка получить формы П. сибирского с укороченными остями при помощи индуцированного мутагенеза, но она не принесла положительных результатов, так как полученная короткоостая форма оказалась стерильной (Агафонов и Тарасенко, 1980).
Все перечисленные выше обстоятельства значительно осложняют изучение огромного генетического потенциала рода пырейник и использование его генофонда в интродукции и селекции.
Во многом преодоление этих трудностей возможно с помощью белковых маркеров, характеризующихся значительным внутривидовым полиморфизмом и независимостью компонентного состава от внешних условий среды (Конарев, 1983; Созинов, 1985).
В то же время на практике не каждый белок может быть использован в качестве генетического маркера и не всякая генетическая система легко поддается маркированию белками. При этом, необходимо учитывать следующее.
-
Для проведения сравнительных исследовашнї по белкам-маркерам очень важно исключить влияние внешних факторов среды, а также онтогенетической и тканевой изменчивости.
-
Сравнительный анализ большого числа представителей многих видов, родов и семейств культурных растений и их диких сородичей методом электрофореза показал, что специфичность разных групп белков неодинакова. У одних она проявляется на уровне рода, трибы и семейства, у других — на уровне вида и подвида, у третьих — на уровне биотипов, их генетических групп и популяций.
Наиболее удобными маркерами в этом отношении многие авторы считают изоферменты эстераз и запасные белки эндосперма (проламины и глютелины).
Наши исследования с использованием изоферментов эстераз в качестве маркеров показали, что несмотря на явные преимущества по сравнению с другими ферментами, спектры изоферментов эстераз характеризовались относительно низкой изменчивостью, а также зависимостью от стадий онтогенеза. Другая группа белков — запасные белки эндосперма, свободна от отмеченных выше недостатков и характеризовалась значительным внутривидовым полиморфизмом и независимостью от условий произрастания растений. Доступность семешюго материала и высокая воспроизводимость результатов
электрофоретического анализа делают запасные белки эндосперма незаменимыми генетическими маркерами для точной идентификации родительских форм, контроля всех этапов гибридизации, а также в анализе популяций, видов и регистрации генетических ресурсов для ген-банков.
Однако, для решения аналогичных задач у представителей рода пырейник электрофоретический метод пока не получил широкого применения. Одной из причин, затрудняющих электрофорез белков из отдельных зерновок многолетников, является их малая масса. Существующие методы разделения проламннов ориентированы на индивидуальный анализ зерновок массой не менее 5-Ю мг. Приготовление белкового экстракта из муки мелкой отдельной зерновки многолетнего злака массой 0,1 — 1,0 мг затруднено тем, что с уменьшением общего количества запасных белков растет относительная доля оболочки.
Поэтому для изучения внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости у представителей рода пырейник предстояло модифицировать существующие методики экстракции и электрофоретического разделения в полиакриламидиом геле (ПЛЛГ) проламннов для анализа отдельных зерновок, характеризующихся малыми размерами.
Цель и задачи исследований.
Основной целью исследований явилось изучение изменчивости по изоферментам эстераз и запасным белкам эндосперма и возможности получения короткоостых форм в роде пырейник.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
-
Разработать методические подходы для изучения изменчивости по изоферментам эстераз и запасным белкам эндосперма у представителей рода пырейник.
-
Изучить пнутрнпопуляционную и внутривидовую изменчивость, межвидовые различия и геномную специфичность по изоферментам эстераз и запасным белкам эндосперма у некоторых видов рода пырейник.
-
Получить короткоостые формы П. сибирского, используя метод половой гибридизации в сочетании с белковым маркированием.
-
Провести генетический анализ признака безостости/остистости у гибридов F2 П. сибирского в сравнении с П. длинноколосым/П. якутским.
Защищаемые положения.
1. Изоферменты эстераз можно использовать для идентификации видов, а проламины и глютелины — для идентификации и регистрации конкретных генотипов, для выявления внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости, а также для установления межвидовых различий и геномной специфичности в роде пырейник.
-
Методом половой гибридизации в сочетании с белковым маркированием и последующим отбором можно получить короткоостые формы у П. сибирского и П. длинноколосого/П. якутского.
-
Признак безостости/остистости у П. сибирского контролируется двумя несцепленными аддитивными генами, в то время как у П. длинноколосого/П. якутского — одним геном с неполным доминированием.
Научная новизна работы.
Впервые разработаны и предложены методические подходы для изучения генетической изменчивости в роде пырейник. Проведен внут-рипопуляционный, внутривидовоіі и межвидовой анализ нзоферментов эстсраз и запасных белков эндосперма у видов рода пырейник. По изоферментам эстераз у представителей П. сибирского показана онтогенетическая изменчивость. Установлено, что наиболее полным и выраженным спектром нзоферментов эстераз характеризуются трехдневные проростки. По электрофоретическим свойствам запасных белков эндосперма выявлена геномная специфичность у видов рода пырейник. Впервые методом половой гибридизации в сочетании с белковым маркированием получены короткоостые формы у некоторых представителей рода пырейник. Проведен генетический анализ признака безостости/остистости у П. сибирского и П. длинноколосого/П. якутского.
Практическая ценность работы.
Модифицированный нами метод электрофоретического разделения в полиакриламидном геле запасных белков эндосперма можно использовать для всех представителей трибы Пшеницсвые, характеризующихся малыми размерами зерновки. Разрешающей способности данного метода достаточно, чтобы анализировать половину эндосперма зерновки, а оставшуюся часть вместе с зародышем проращивать и получать взрослое растение с известным исходным составом ироламиновых компонентов спектра. Изучение популяционной изменчивости у П. сибирского и вычисление коэффициента сходства позволило оценить степень изменчивости каждой популяции и степень сходства и различия между ними. Эти данные полезны в вопросах таксономии и филогении рода пырейник. Результаты по геномной специфичности представляют научный интерес для исследователей, занимающихся вопросами эволюции геномов, а также могут послужить научной основой для разработки вопросов маркирования геномов, контролирующих определенные признаки, в том числе хозяйственно-ценные, у дикорастущих злаков рода пырейник. Полученные короткоостые формы, несущие также гены морозо- и засухоустойчивости являются исходным
материалом для селекции короткоостых форм пырейника, улучшающих кормовые качества сена и способствующих облегчению механизированного посева семян. Определение количества генов, контролирующих признак безостостости/остистостости у П. сибирского и П. длинноколосого/П. якутского имеет определенное значение для развития частной генетики этих видов. Формы, биотипы и популяции пырейника могут быть записаны в виде "белковых формул" по спектру компонентов проламина, которые легко переносятся на перфокарту для машинной обработки заключенной в них информации с целью регистрации генетических ресурсов для генбанков.
Апробация работы. Результаты работы обсуждались на Отчетной научной сессии Центрального сибирского ботанического сада СО РАН (1996), материалы исследований были представлены на IV Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), на V съезде ВОГиС им. Вавилова (Москва, 1987), на IV Всесоюзном совещании по хемосистематике н эволюционной биохимии высших растений (Москва, 1990), на 72-м ежегодном совещании Тихоокеанского Отделения Американской Ассоциации по развитию науки (Логан, штат Юта, США, 1991), на VIII Международном симпозиуме по генетике пшеницы (Пекин, 1993), на 1 и 2 Международных симпозиумах по Пшеницевым (Хелсинборг, Швеция, 1991; Логан, Юта, США, 1994), на Международном Симпозиуме по онтогенезу у растений (Киев, 1995), на Всесоюзной конференции "Проблемы изучения растительного покрова Сибири" (Томск, 1995).
Публикации. По теме диссертации автором опубликовано 28 печатных работ (10 за рубежом), в том числе: одна монография (в соавторстве), одно изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста, имеет 19 таблиц, 40 рисунков и 2 приложения. Состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 221 наименование, в том числе 141 на иностранном языке.