Введение к работе
Актуальность работы. Поиск, выявление и комплексное изучение лекарственных растений п целью получения сырья для медицинегой промышленности является одной из приоритетных.государственных проблем. Известно, что лечебные средства растительного происхождения составляет 38f лекарственных препаратов, знпускаемых в мире, из них около 70^ для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Проблема расширения ассортимента и увеличения производства лекарственных препаратов в Республике рассматривается как одна из перспективных, так как из 3000 препаратов, применявшихся в'медицинской практике, лишь 3-5JJ производится в Узбекистане.
Естественная
vitro , представляется интересным в практическом и теоретическом плане.
Объектами исследовании послужили: Codonopsis clenatidea Schrenk- кодонопейс клематнеовидны" - ценное лекарственное растение, издавна используемое.в медицине. Кодонопейс является основным компонентом гёпатозащитного лекарственного сбора (ЛСХ-І - лекарственного сбора Ходжшатова), разработанного и внедренного в официальную 'зедицлну институтом ботаники АН РУз. Запланирован нарастающий объем промышленного выпуска этого сбора в ближайшие годы, пря'котором запасы'естественного сырья, вероятно будут испы-гызагь большую нагрузку. 3 этой огіязи поиск дополнительных источников сырья вполне оправден; Ruta graveolens L. - ценное лекарственное растение с широким спектром применения. В.'естественных условиях в Узбекистане она не имеет запасов. Создание ке промыш-ленньяс плантаций тоебуег больших площадей и' материальных вложений. Введение в культуру in vitro и разработка бпогехнологического способа получения сырья с непрерывным круглогодичным циклом производства возможны как один из'нетрадиционных подходов получения экологически чистой .продукции.
Цель и задачи исследования; Целью настоящих исследований являлось: введение в культуру, ткггней ценных лекарственных растений IUraveplens L. и C.cle:r.atidea Sciireni: . ДїїЯ достижения цели ста- . вились, следующие задачи: . -т 'разработка оптимальных условий культивирования, способствующих
4 л:ам.;д;альяому накоплению биомассы;
изучение особенностей развития тканей in vitro в зависимости от Пролсхо.тдештя экспланта;
установление оптимальных концентраций фитогормоиов, макросодей
и углеводов, обеспечльагаих максимальный выход бяомрссы; *
- проведение сравнительного'химического анализа биомассы; полу
ченной in vivo и vitro.
Каучнал новизне. Изучена культура тканей с. cle;.;atidsa Sciirenic к R.gr-Aveolans L. и возмойшбсть получения in vitro биомассы, пригодной для использования в практике. Разработаны условия получения стерильных эксплантса этих растения, оптимизированы состав питательной среды, концентрация макгосслеР, углеводов, фи-тогорконов, обуславливающих йцдуящш каллусо-, органогенеза, субкультуру к кикроклоналыюе размножение. Изучены характер роста и развития каллусных клеток K.graveolena L. и C.cleaatidoa Schrenk форсирование органов, динамика роста и развития расгений в зависимости от компонентов питательной среды и условий культивирования. Показано, что ткани дикорастущих растений R.gravaoiena Ь.и C.cle-natidea SchrerJc способны к быстрому переходу яа органогеяетлче-ский путь развития, нежели к соматическому эмбриогенезу. Проведен сравнительный химический анализ R. yraveolenn L. и С. eleaatidea Schrenic , выращенных-in vivo и in vitro . Установлено, что дифференцированные органик, craveoiena і ., выращенные методом культу-ры тканей и естественно произрастающие на грунте растения сохраняют способность биосинтезировать первичные и вторичные метаболиты. Дифференцированные ткани культуры in vitro с. clematidea achrenk содержат пигменты, липиды и алкалоиды, свойственные рас- тениям выращенным in vivo, и это дает основание полагать, чтс культура із vitro в перспективе пожег слу::пть источником.физиологически активных липид-пигкенгных концентратов и алкалоадбв.
. Практическая ценность. Разработанный нами биотехнологический способ микро-клонирования способствует быстрому размножению к. кга-veoiens L. и С. olematidea Schrcnk . Способ получения биомассы ценных лекарственных расгений в лабораторных условиях да-зг возможность круглогодично получать экологически чистую продукцию, которая послужиг дополнительным сырьем для практического испольэоваяия.-
Основные положения, выносимые на-защит:/. ' ._
I. Наиболее эффективным методом получения стерильных тканей in vitro К. graveolons 1. И С. clenratidea Schroni: С целью дальней- .
5-.
ааго микроклонирования является использование семян как входного материала.
2. Характер и интенсивность каллусе- и органогенеза зависят как
от.генотипа изучаемого объекта, так и от происхождения эксплан-
та.
Специфичность действия фигогормонов на каллусе- и морфогенез обеспечивает регулирование в бяотехнологической системе возможность получения сырья с заданннми параметрами.
3. При подборе оптимального состава питательной среды, температу
рного и светового режима растений in vitro сохраняют способ
ность синтезировать псе те химические соединения, что и рас
тения in vivo .
Биомасса (каллус и колбочные растения), полученная в условиях in vitro , по многим показателям (липидиый состав) идентична к таковым растениям, выращенным в грунте. Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены: на конференции - молодых ученых,посвященной пятилетию принятия государственного языка (Ташкент, 1994); на научной конференции "Биология ва экологиянинг хозирги замон муаммолари" (Ташкент, 1995); на научной конференции "Актуальные проблемы ботаники" (Ташкент, 1995); на заседании лаборатории антэколопш и цнтоэмбрио-логий растений Института ботаники АН FYs (1996);.па расширенном заседаний Отдела экологии е репродуктивной биологии Института ботаники АН РУз (1996)'; на расширенном заседания лабораторий локар-ственнс^-гехнических растений, химии, алкалоидов и.химии липидов Института химии растительных веществ АН РУз (1996); на расширенном заседании кафедры ботаники Ташкентского Государственного Педагогического Института игл. Низами (1997).
По-материалам диссертации опубликовано 6. работ. Объем-к структура работы. Диссертация изложена на 114 страницах маи'иг.описного.текстг и состоит из введения, 3 глав, выводов и рекомендаций..Список литературы включает 242 найменовация. Работа иллюстрирована 21 таблицами, 4 .графиками, 39 фотографиями.
. ГЛАВА I. ОБЗОР ЛІТЕРАТУР!! '
Проблеме ипкроклонального -размножения и.получения биомассы лекарстгвппнх растепли посвящено'большое.количество исследований.
опубликованных в виде монографических и обзорных работ (Бутенко,-І9Є4; Heinart ot al . , 1964; Zenic et al.,'. 1977; Formeebech , Ponne-sbech ,1930; Kassey , Stasey , 1981; Tombolato ot al .,1988; Беспалов и др., 1993).
В развитых странах-метода культуры тканей успешно применяются с целью размножения декоративных, лекарственных, исчезающих, эндемичных видов растений, получения безвирусио'го посадочного материала картофеля, цитрусовых и многих других культур, а также для получения природных веществ растительного происхождения (Бу~ тзико и др., 1982; Выхристова, Копылов, 1987; Donocq , 1988; За-ntana et al ., 1288; Рогове кий, .Забигайло, 1993 и др.). Многими исследованиями показано, что успех микроклональногб размножения . зависит от степени разработки методов биотехнологии ( Вохис ,1985; Cheo , Pool , 1985; Doro ,1988).
Изучение синтеза вторичных метаболитов в культуре тканей ра- .' стений показало, что практически-все классы соединений вторичного обмена (в т.ч. алкалоиды, стероиды, терпеноиды и др.) могут быть синтезированы культивируемыми клетками растений. Согласно данных литературы к концу 70-х годов было уже' известно более 100 -. соединений 12 классов веществ вторичного метаболизма сингезируе- . мых клеточными культурами"( Butcaer , 1977). Отмечено, что для культивируемых клеток растений характерно увеличение спектра синтезируемых соединений специализированного обмена по сравнению о ннтактными растениями. В ряде se случаев отмечается синтез веществ, не характерных для интакгного растения, .например, рутакуль-тин из культуры Ruta ( Wink, Witte , 1983). .
При совершенствовании питательной среди и подборе соотвегст-т'" вующих условий культивирования получены различные штаммы (напри-. - " мер, в культуре тканей payвольфии змеиной) с-тенденцией к увели-'; чению продуцента-аймзлина (Николаева и др., 1983). .
Некоторые культуры в условиях in vitro продуцируют повышен- ' ное количество алкалоидов, например, апоскополамин содержится в больших количествах в экстрактах из культур .некоторых Datura орр,., хотя in vivo этот алкалоид присутствует лишь в следовых количествах ( Corduan , 1975). В некоторых, случаях дифференцированные корни, стебли, листья или целые растения in vitro могут синтезировать больше вторичных метаболитов, нежели недифференцированные каллусные клетки ( Thoraas , Street : , 1970).
Такім образом, использование биомассы, выращенной in vitro ,
представляет большую перспективу для получения экологически ЧИСТЫХ вторичных метаболитов ( Bohra , 1980; Кислов и др., 1983; Petiard et.al., 1985; Stafford et al ., 1986; Гохар, Кузовкипа, .1988; Веіаізі ot al ., 1991; Цутонко и др., 1992; Запрсметов, 1992; Dolaet-Sahjuan et al ., 1992; Загоскина и др., 1993).