Введение к работе
Актуальность работы. Поиск новых природных источников физиологически активных и химически ценных соединений среди биологических организмов является актуальной задачей биотехнологической науки.
Успехи экспериментальной микологии - самостоятельной ветви современной
биотехнологии, и применение новейших методов тонкого химического анализа
в исследованиях физиолого-биохимических особенностей грибных организмов
отнесли их в ряд перспективных биотехнологических объектов. Среди них
особое место занимают базидиальные макромицеты (БМ), которые являются
продуцентами не только пищевого и кормового белка, но и биологически
активных соединений (БАС) с широким спектром действия: антибиотическим,
антиопухолевым, иммуномодулирующим, тромболитическим,
гипогликемическим и др.
Первые сведения о терапевтической значимости и возможностей практического использования БАС высших грибов встречаются еще в работах Гиппократа и древних китайских рукописях. Однако систематические и научно обоснованные исследования в этой области начались сравнительно недавно. Сегодня во многих лабораториях мира занимаются исследованием высших лекарственных грибов, в частности БМ, в качестве ценного природного источника БАС.
В Армении комплексные исследования в этом направлении нами проводятся впервые. Накопленные к настоящему времени литературные сведения, а также результаты собственных исследований позволяют по достоинству оценить эти организмы, как источник БАС и открывают широкие перспективы их практического применения в фармакологии, медицине и других областях человеческой деятельности.
Активные метаболиты БМ в основном относятся к полисахаридам, терпеноидам, полипептидам, индольным и фенольним соединениям. В определенных дозах их можно использовать при лечении многих болезней. Грибные полисахариды с помощью активации макрофагов способны усиливать иммунный ответ организма на антигены цитотоксического действия. В больших дозах некоторые тритерпени проявляют нейротоксическое действие. Установлена также гиполипидная, гипогликемическая, антиопухолевая, тромболитическая, фибринолитическая и антибиотическая (антибактериальная, антифунгальная, антивирусная) активность метаболитов высших грибов. Наряду с физиолого-биохимическими исследованиями установление острой токсичности и фармакологической активности БМ представляет также практический интерес для клинической токсикологии в диагностировании грибных отравлений.
Следует отметить, что БМ - продуценты БАС, относятся к различным экологическим группам, а именно ксилотрофам, копротрофам, гумусовым и подстилочным сапротрофам, микоризообразователям. Среди них есть съедобные, несъедобные и ядовитые виды.
Выявление характера межвидовых взаимоотношений и установление биотической активности (БА) мицелия является первоначальным этапом в
процессе скрининга этих организмов по физиологической активности. Исследование внутривидовых взаимоотношений, познание механизмов вегетативной и генетической несовместимости, выявление интерстерильных групп и экотипов внутри таксономического вида имеет большое значение в понимании специфической структуры популяций и сложного эволюционного процесса видообразования у грибов. Разрешение этих проблем является актуальной задачей современной микоценологии и экологии.
Изучение морфологических и био-экологических особенностей БМ в культуре способствует разностороннему познанию жизнедеятельности этих организмов. Эти результаты имеют большое значение в налаживании процесса получения мицелиальной биомассы в производственных масштабах, что является важным этапом биотехнологического внедрения грибного объекта.
Из вышеизложенного становится очевидной актуальность выбранной темы -комплексное и всесторонее изучение морфолого-культуральных, экологических, физиолого-биохимических и фармакологических особенностей некоторых БМ и оценка возможностей их практического внедрения в биотехнологию. Результаты подобных исследований являются актуальными и в хемотаксономических разработках грибов. Комплексный подход в микологических исследованиях будет способствовать выявлению эволюционных путей развития внутри сложной и полиморфной группы грибных организмов и построению новых совершенных филогенетических систем.
Цель и задачи. Целью настоящей работы являлось: уточнение систематической принадлежности, всесторонние исследования биоморфологических и экологических особенностей, биохимии, физиологической и фармакологической активности плодовых теА (ПТ) и мицелия 47 видов БМ, относящихся к различным эколого-трофическим группам, в частности ксилотрофам для выявления и оценки возможностей их практического применения в качестве источника биологически активных и химически ценных соединений.
При этом были поставлены следующие задачи:
уточнить таксономическую принадлежность грибов, потенциально представляющих интерес для наших исследований, установить их систематическое положение в современном понимании;
выделить чистые культуры, исследовать макро- и микроморфологические особенности мицелия и структурных элементов ПТ с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Выявить новые и дополнить ранее известные признаки телеоморфы и анаморфы, имеющих таксономическое значение на различных систематических уровнях, включая их в диагнозы некоторых исследованных видов;
установить возможности комплексного применения био-экологических, хемотаксономических и генетических критериев в филогенетическом анализе БМ на примере видов рода Nematoloma;
исследовать характер межвидовых взаимоотношений и определить БА видов. Выявить степень и морфологические типы проявления вегетативной
несовместимости (ВН) при внутривидовых скрещиваниях различных групп изолятов, оценить таксономическую значимость этого явления у ксилотрофов;
выявить биохимический состав ПТ и мицелия некоторых БМ и прогнозировать дальнейшие пути исследования физиологической и фармакологической активности БМ. По возможности оценить хемотаксономическую значимость выявленных групп соединений. Провести анализ липидной фракции, полученной из экстракта ПТ N. fasciculare, с выделением и идентификацией отдельных соединений;
исследовать антибактериальную и антифунгальную активность в условиях in vitro, а также гемолитическую, гемакоагулирующую, гипогликемическую активность - in vitro и vivo, при в/б, в/в и пероральном введении экстрактов ПТ и мицелия некоторых БМ;
установить наличие внеклеточных ферментов, выделяемых мицелием N. fasciculare и F. velutipes, а также протеолитическую (молокосвертывающая и фибринолитическая) активность экстрактов ПТ, мицелия и культуральной жидкости (КЖ) у некоторых БМ;
с помощью специальных тестов исследовать фармакологическую активность и определить острую токсичность (LDm), а также спазмолитическое, нейротоксическое и аналгетическое действие при в/б и пероральном введении экстрактов некоторых видов БМ и выделенных из них фракций в условиях хронического эксперимента in vivo;
на основании полученных результатов и имеющихся в литературе данных выделить наиболее перспективную для дальнейших исследований экологическую группу или виды БМ для их дальнейшего внедрения в биотехнологию в качестве природного источника БАС.
Научная новизна результатов. Комплексные и многоаспектные исследования био-морфологических и экологических особенностей, биохимии, физиологической и фармакологической активности ПТ и мицелия некоторых БМ - потенциальных источников БАС в Армении проводятся впервые.
С помощью СЭМ исследовались макро- и микроморфологические характеристики мицелия и ПТ 7 видов, что позволило описать целый ряд новых признаков телеоморфы и анаморфы (диапазон изменчивости морфологии, характера и скорости роста мицелия, морфологические особенности микроструктур мицелия и ПТ, наличие и типы анаморфы, а также строение апикулюса, особенности морфогенеза и типы отбрасывания спор и др.), имеющих таксономическое значение на различных систематических уровнях. Оценена также их эволюционно-филогенетическая значимость. Приводятся диагнозы 27 видов БМ дополненные этими признаками.
Определено количество ядерного ДНК в дикариотических и монокариотических клетках мицелия и ПТ пяти видов рода Nematoloma. На основании полученных данных исследованные виды по уровню плоидии разделились на две группы: моноплоидные - n (N. fasciculare, N. capnoides, N. polytrichia и триплоидные - 3n [N. sublateritium, N. radicosum). Комплексное применение генетических, био-экологических и хемотаксономических критериев в филогенетическом анализе исследованных видов и учитывая, что низкий уровень плоидии является филогенетически старым признаком,
выдвинута гипотетическая схема распределения видов в составе рода по степени их эволюционной близости и филогенетической молодости: N. radicosum-+N. sub]ateritium->N. polytrichi->N. capnoides-*N. fasciculare.
Установлен антагонистический характер межвидовых взаимоотношений у исследованных БМ. Антагонизм с большой силой проявлялся при совместном росте ксилотрофных видов. При межвидовом антагонизме показатель БА, указывающий на степень конкурентоспособности вида в определенном пределе вариабельности является видоспецифическим признаком. Исследованные виды из различных эколого-географических регионов сохраняли свою пренадлежность к условно разделенной по этому показателю группе грибов: очень активные, активные и мало активные. Небольшой разрыв в показателях БА при взаимоотношениях видов одного рода указывает на их возможную филогенетическую близость. Выявление БА видов наряду с другими параметрами рассматривается нами как первичный этап в скрининге БМ по физиологической активности.
Внутривидовое скрещивание различных групп изолятов 6 ксилотрофных видов установило, что фенотипически ВН проявляется разными, но стабильными на уровне вида морфологическими типами реакциий: зоной редких гиф (ЗРГ) и мицелиальным валиком. Первый тип является выражением более слабой или частичной ВН и встречается при скрещивании скорее родственных или близкородственных изолятов одной популяции, нежели второй, который указывает на сильную несовместимость генетически различных индивидуумов. Последний проявляется при скрещивании изолятов из различных географических регионов или популяций, а также между интерстерильными группами и различными экотипами одного вида. Наличие на агаре или мицелии пигментированной демаркационной линии (ДЛ) с каплями экссудата на месте контакта колоний рассматривается нами как выражение более сильной несовместимости между изолятами одного вида.
Проведен сравнительный качественно-биохимический анализ метанольных и водных экстрактов ПТ и мицелия, а также полученных из них водо- и метанолрастворимых фракций (ВРФ, МРФ) исследованных БМ. Отмечено наличие свободных Сахаров и аминокислот, полиолов, терпеноидов (стероидные соединения, гликозиды, сапонины и др.), алкалоидов и других грибных токсинов, фенольных (фенольные кислоты, полифенолы), индольных и нингидрин-положительных соединений и отсутствие танинов. Сделана попытка оценки хемотаксономической значимости некоторых выявленных групп соединений.
Предварительные результаты исследований гипогликемической активности (ГТА) у БМ на примере N. fasciculare показали, что водный экстракт (ВЭ) этого вида в условиях in vivo при в/б и пероральном введении в дозе 50мг/кг не способствует снижению уровня сахара в крови, проявляя при этом нейротоксический эффект. Однако была установлена антибактериальная, антифунгальная, гемолитическая, гемакоагулирующая и протеолитическая (фибринолитическая и молокосвертывающая) активность экстрактов ПТ, мицелия и КЖ этого вида в условиях in vitro и in vivo при в/в, в/б и пероральном введении.
Впервые был описан папавериноподобный спазмолитический эффект у подопытных животных вызванный различными дозами метанольных экстрактов (МЭ) из ПТ видов АдгосуЬе ргаесох, F. velutipes, N. fasciculare, АгтШагіа mellea, P. ostreatus, в частности Paxillus involutus. Результаты опытов показали, что в испытуемых дозах экстракты из ПТ Tricholoma tigrinum, P. involutus, и F. velutipes не обладали стойким аналитическим эффектом. Наоборот, их пероральное введение увеличивало сокращение дорзо-абдоминальных мышц, вызывая алгогенныи эффект у подопытных животных. В определенных дозах они обладали и нейротоксическим действием. При этом фармакологический эффект ВРФ экстрактов был сильнее, чем эффект МРФ.
Выявлена антибактериальная и антифунгальная активность (АБА, АФА) исследованных видов БМ в отношении Г+ и Г" патогенных бактерий, микромицетов и дрожжей в условиях in vitro. АБА сильнее проявилась в отношении Г+ кокков (Staphylococcus aureus и др.) и спорулирующего вида Bacillus subtilis.
Высокой АФА обладали P. osrteatus, N. fasciculate, L. edodes, L tigrinus и другие ксилотрофы. Представители копротрофов, гумусовых и подстилочных сапротрофов во всех вариантах совместного роста с тест-микромицетами в различной степени также проявили АФА. Активностью в отношении штаммов Candida albicans обладали МРФ и ВРФ из экстрактов ПТ трех ядовитых видов: N. fasciculare, Т. tigrinum и P. involutus.
Впервые проведенный по специальным тестам скрининг растущего мицелия N. fasciculare и F. velutipes установил их способность в различном количестве выделять 16 внеклеточных ферментов. Выраженная молокосвертываящая активность (МСА) была установлена для экстрактов ПТ и КЖ, по сравнению с экстрактами мицелия (ЭМ) у 16 видов БМ. Эти данные свидетельствуют, что изученные грибы можно рассматривать не только в качестве природного источника БАС, но и экономически и биологически важных ферментов.
С помощью 12 тестов впервые определена фармакологическая активность и острая токсичность МРФ и ВРФ из экстрактов ПТ 7 видов БМ при их в/б и пероральном введении белым мышам. Окончательно уточнена степень токсичности и типы отравления этими видами, в частности N. fasciculare, который был отнесен к группе смертельно ядовитых грибов. Он в зависимости от дозы экстракта вызывал гастроэнтеральные, гемолитические и нейротоксические синдромы отравления с различными латентными периодами. Установлены Ц)м = 243.29мг/кгп Шюо— 250л/г/кг для этого вида.
Отклонения от нормы некоторых фармакологических тестов (двигательная активность, групповое поведение, эрекция шерсти и др.) под влиянием экстракта ПТ N. capnoides в дозе 2000д/г//гг позволили более осторожно интерпретировать съедобность этого вида и отнести его к группе несъедобных грибов.
Проведенные комплексные исследования позволяют рассматривать БМ как перспективные объекты для биотехнологии, а также в качестве ценного сырья для использования в нетрадиционной медицине и народном хозяйстве. По результатам опытов среди исследованных эколого-трофических групп грибов выделена физиологически наиболее активная группа ксилотрофов,
включающая виды Pleurotus osrteatus, Lentinula edodes, Lentinus tigrinus, Nematoloma fasciculare, Flammulina velutipes и др. Учитывая также выявленные особенности и характер их мицелиального роста, ксилотрофы были отнесены к группе перспективных и удобных для внедрения в биотехнологоческую промышленность видов в качестве источника БАС. Однако, приоритетность такого выбора не исключает поиск активных соединений и у представителей других эколого-трофических групп.
Практическая значимость работы. Результаты диссертационной работы являются теоретическим и практическим вкладом в области экспериментальной микологии и микоценологии. Они открывают новые перспективы для дальнейших совместных исследований микологов, биохимиков и фармакологов в области изучения БМ в качестве источника биологически активных и химически ценных соединений. Результаты подобных исследований могут найти применение в биотехнологической и фармакологической промышленности, а также других областях человеческой деятельности.
Дополненные выявленными морфологическими, экологическими,
биохимическими, физиологическими и генетическими характеристиками мицелия и ПТ диагнозы некоторых видов могут быть использованы при составлении современных определителей базидиальных грибов.
Способность исследованных грибов синтезировать лигно-целлюлолитические ферменты может найти практическое применение в биотехнологической промышленности и биоконверсии вторичного растительного сырья.
Установленная АБА и АФА, а также способность продуцировать
протеолитические ферменты исследованными БМ позволяют включить их в
список видов, перспективных для получения новых биопрепаратов с
антибактериальным, антифунгальным, тромболитическим и
фибринолитическим действием.
Результаты опытов по выявлению острой токсичности, гемолитической, гемакоагулирующей, нейротоксической, алгогенной и спазмолитической активности некоторых БМ могут быть использованы в клинической токсикологии при диагностировании грибных отравлений.
Материалы диссертации использовались при составлении курсов лекций и практических занятий по микологии в Ереванском и Московском государственном университетах, а также Пермском педагогическом Университете.
На кафедре ботаники ЕГУ создана коллекция чистых культур БМ, насчитывающая 44 вида и 122 штамма, относящихся к 19 родам, 11 семействам, 7 порядкам, подклассов Agaricomycetideae и Aphyllophoromycetideae. Некоторые штаммы выделенных нами культур переданы в коллекцию Регенсбургского университета и Института ботаники РАН (Санкт-Петербург). Экземпляры ПТ исследованных видов хранятся в гербарии кафедры ботаники ЕГУ.
На основании полученных результатов скрининга можно создать банк данных о лекарственных грибах Армении, что будет способствовать дальнейшему эффективному использованию грибного биоразнообразия республики.
Апробация работы и публикации. Основные результаты исследования были представлены на международных конгрессах, всесоюзных и региональных конференциях, симпозиумах и научных сессиях: III, IV всесоюзн. симп. Изучение грибов в биогеоценозах (Узбекистан, Ташкент, 1985; Россия, Свердловск, 1988); X научн. симп. микол. и лихенол. прибалт, республ. и Белоруссии (Латвия, Рига, 1985); научн. сессия ЕГУ (Армения, Ереван, 1985); Закавказск. конф. по спор, растениям (Армения, Ереван, 1986); X межд. конгресс европейских микологов (Эстония, Таллин, 1989); IV межд. миколог, конгресс (Германия, Регенсбург, 1990); III межд. конгресс Наука и практика грибоводства (Россия, Кашира, 1996); респ. конф. Загрязнение пищ. прод. биотич. и абиотич. контаминаитами (Армения, Ереван, 1996); межд. собрание европейского совета по охране грибов (Италия, Сиена, 1998); I межд. конф. Методолог, основы познания биол. особенн. грибов - продуцентов физиол. актив, соед. и пищев. продуктов (Украина, Донецк, 1998); IV межд. коллокв. Природ, соедин. растит, происхождения (Канада, Оттава, 1998); II межд. симпоз. Биотехнология растений (Украина, Киев, 1996); научн. совещ. посвящен. 75-летию каф. ботаники ЕГУ (Армения, Ереван, 1999); межд. совещ. по микологии (Франция, Лиль, 1999), а также на научных семинарах и заседаниях кафедр ботаники, экологии и охраны природы и ученого совета биологического факультеа ЕГУ.
Диссертационная работа была выполнена в Ереванском государственном университете на кафедрах ботаники, экологии и охраны природы биологического факультета (1980-1998), на кафедре низших растений МГУ им. М.В. Ломоносова (1982-1983), а также в рамках межвузовского сотрудничества на факультете фармации университета Монпелье-1 (Франция, 1993-1997) и по стипендии ДААД в институте ботаники Регенсбургского университета (Германия, 1993). Часть работы, представленная в Международный Научный Фонд им. Дж. Сороса (США) была удостоена премии.
По материалам диссертации в международных и местных научных журналах опубликовано 46 работ, из коих 26 статей, 19 тезисов и материалов и одна монография. На международных конференциях и конгрессах были представлены 3 постера.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 390стр. компьютерного текста (MS Windows'97, Times LatRus, 12/1.5), состоит из введения, шести глав, выводов, а также списков цитированной литературы и сокращенных слов. Работа включает 68 таблиц и иллюстрирована 79 рисунками. Список литературы состоит из 690 названий.