Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. PRP в лечении андрогенетической алопеции – предпосылки, достижения и нерешенные проблемы. Обзор литературы 12
1.1. Андрогенетическая алопеция – современное представление 12
1.1.1. Андрогенетическая алопеция. Вопросы терминологии 12
1.1.1.1. Эпидемиология 12
1.1.2. Современные представления об этиологии и патогенезе АГА 13
1.1.3. Представления о фолликулярной миниатюризации 18
1.2. Клиническая картина 19
1.3. Методы диагностики АГА 21
1.3.1. Клинические методы (не инвазивные) 21
1.3.2. Гистологические данные 25
1.4. Современные подходы к лечению АГА 27
1.5. PRP в лечении АГА 31
1.5.1. PRP – применение в медицине 31
1.5.2. Клинические эффекты PRP при АГА 32
1.5.3. Молекулярные и биологические эффекты PRP 36
1.5.4. Аспекты, влияющие на биологический потенциал PRP 38
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Материал исследования 41
2.2. Дизайн исследования 42
2.3. Методика приготовления и использования обогащенной тромбоцитами плазмы 42
2.4. Методы исследования 45
2.4.1. Оценка степени тяжести АГА 45
2.4.2. Фототрихологическое исследование 45
2.4.3. Гистологическое и морфометрическое исследование 47
2.4.4. Иммуногистохимическое и морфометрическое исследование 51
2.4.5. Математический анализ результатов обследования 53
2.5. Характеристика обследованных лиц 54
Глава 3. Результаты изучения маркеров пролиферативной активности клеток ВФ после PRP-терапии 58
Глава 4. Результаты изучения морфологических показателей роста волос после PRP-терапии 63
Глава 5. Результаты сравнительного исследования морфометрических показателей роста волос 67
5.1. Динамика фототрихологических показателей роста волос у пациентов группы наблюдения 1 после лечения 67
5.2. Динамика фототрихологических показателей роста волос у пациентов группы наблюдения 2 после лечения 69
5.3. Динамика фототрихологических показателей роста волос в группе сравнения после лечения 71
5.4. Сравнительная оценка динамики фототрихологических показателей роста волос у пациентов групп наблюдения 73
Глава 6. Результаты сравнительной оценки клинической эффективности терапии с использованием PRP 78
Заключение и обсуждение полученных результатов 81
Выводы 86
Рекомендации 87
Перспективы дальнейшей разработки темы 87
Список сокращений 88
Список литературы 89
- Современные представления об этиологии и патогенезе АГА
- Аспекты, влияющие на биологический потенциал PRP
- Результаты изучения маркеров пролиферативной активности клеток ВФ после PRP-терапии
- Результаты сравнительной оценки клинической эффективности терапии с использованием PRP
Современные представления об этиологии и патогенезе АГА
АГА считают мультифакториальным заболеванием. В его основе лежит избыток мужских половых гормонов в сочетании с генетической предрасположенностью [50]. Еще в 1942 году Гамильтон впервые указал на значение генетической предрасположенности в развитии АГА.
В соответствии с современными представлениями наследование АГА носит полигенный, а не менделевский характер. Низкий риск потери волос имеют сыновья тех отцов, у которых АГА отсутствует. Высокий риск развития АГА у мужчин, чьи отцы имеют алопецию, а также, если алопеция наблюдалась у их деда по материнской линии, 20% мужчин не имеют отягощенного семейного анамнеза.
У женщин с АГА реже, чем у мужчин с АГА, имеются родственники первой степени родства с облысением по мужскому типу [33, 69, 87]. Исследования на близнецах позволили установить, что конкордантность по АГА наблюдалась в 80% случаев [86].
Гипотеза андрогенной природы облысения позволяет объяснить ряд клинических особенностей заболевания наличие очагов облысения у человека и других приматов; дебют заболевания после пубертатного периода; сочетание облысения с акне и себореей, с гирсутизмом у некоторых женщин; локализация алопеции в теменных и фронтальных зонах волосистой части головы [1, 17]. У мужчин, кастрированных до половой зрелости, АГА развивается только на фоне заместительной терапии тестостероном, а временная отмена гормона вызывает прекращение выпадения волос [112]. В случае отсутствия у людей чувствительности к андрогенам, АГА также отсутствует, что подтверждает значение андрогенов в патогенезе АГА; несмотря на нормальный или повышенный уровень тестостерона эти люди имеют женский фенотип при генотипе XY, [93].
В коже человека с одной стороны происходит экстрагландулярный синтез стероидных гормонов, в частности в образовании андрогенов из стероидов предшественников [7], а с другой, кожа экспрессирует специфические рецепторы к половым стероидным гормонам, являясь к ним тканью-мишенью. Рецепторы к андрогенам обнаруживаются в различных андрогензависимых структурах -фибробластах, клетках сальных желез, ВФ, кератиноцитах эпидермиса, меланоцитах. Другой аспект экстрагландулярной динамики андрогенов заключается в их превращении в эстрогены, в частности андростендиона в эстрон [13].
В тканях-мишенях, в том числе и осуществляется превращение тестостерона в его более активный метаболит - дигидротестостерон (ДГТ) путем восстановления в 5-м положении, под действием фермента 5а-редуктазы [77, 80, 81]. Фермент 5а-редуктаза присутствует в организме в трех типах: 1, 2 и 3. Ферменты 1 и 2 типов содержатся в сальных железах и ВФ у мужчин и женщин [21].
В преобразовании на уровне ВФ тестостерона в ДГТ есть глубокий биологический смысл. Волосы должны регулироваться половыми гормонами, в зависимости от половой принадлежности организма и локализации волос на теле, так как являются важным половым признаком. Например, борода является мужским признаком, и ДГТ будет стимулировать ВФ, расположенные в области подбородка, а избыток эстрогенов в этих же фолликулах будет подавлять рост волос. Для женщин длинные волосы являются украшением, не характерным для мужчин , и ВФ, расположенные на голове, стимулируются женскими половыми гормонами и супрессируются мужскими. Если какой-то фолликул становится слишком чувствительным к андрогенам, то это супрессивное действие может стать для него чрезмерным [108].
В кератиноцитах ВФ (а именно в клетках волосяной луковицы и волосяного сосочка), 5-редуктаза катализирует превращение тестостерона в более активную форму - 5-ДГТ, который играет главную роль в развитии АГА [12, 14, 78, 87, 99, 118].
Активность 5-редуктазы в лобно-теменной области в 2 раза выше, чем в затылочной. И в волосяных фолликулах лобной зоны мужчин и женщин имеется большее количество 5-редуктазы и рецепторов к андрогенам, чем в волосяных фолликулах затылочной зоны. При этом у женщин уровень составляет примерно половину от наблюдаемого у мужчин.
Первичные культуры клеток волосяных сосочков с участков алопеции при АГА были исследованы N.A. Hiibberts с соавторами [53], которые применили меченный {3}H неметаболизируемый андроген (миболерон). Выяснилось, что в фолликулах из лобно-теменной (лысеющей) зоны содержалось больше рецепторов к андрогенам, чем в культурах клеток из фолликулов затылочных (не лысеющих) участков кожи головы. При изучении конкуренции со стороны миболерона, тестостерона и 5-ДГТ специфичность связывания рецепторами в фолликулах лысеющей и не лысеющей кожи отсутствовала. Это подтвердило гипотезу о действии андрогенов на ВФ через волосяные сосочки; последние могут использоваться для изучения АГА в качестве модели.
Под действием антагониста 5-редуктазы – ароматазы, активность которой наиболее выражена в затылочных фолликулах, происходит преобразование андрогенов в эстрогены. У мужчин ароматаза присутствует в незначительных количествах, это может являться причиной гендерных различий в клинической картине АГА [91, 100].
Считается, что картина, наблюдаемая при АГА, определяется распределением ферментов и ферментных рецепторов в ВФ волосистой части головы. Известно, что дерма лобной и теменной областей волосистой части головы происходит из нервного гребня, в то время как дерма затылочной части имеет мезодермальное происхождение [30]. Эти различия эмбриологического происхождения между дермой фронтальной / теменной и затылочной частей могут стать ключом к пониманию того, почему фолликулы в одной части головы особенно подвержены воздействию андрогена, а в другой части к нему невосприимчивы.
Из-за недостаточной активности ароматазы, которая могла снизить уровень андрогенов как прямым путем (расход андрогенов конверсией), так и косвенным (через эстрогены) путем, а также удвоенной активности 5-редуктазы и плотности рецепторов к андрогенам, в ВФ лобно-теменной области продуцируется повышенное количество ДГТ [1, 54, 130].
Таким образом, в возникновении андроген-зависимого облысения наличие рецепторов андрогенов и активность андроген-конвертирующих энзимов являются важными факторами. В свою очередь, концентрация рецепторов в клетках-мишенях может определяться уровнем соответствующих гормонов. Это означает, что клетки-мишени первоначально могут содержать небольшое количество молекул рецепторов, которые стимулируют свой собственный синтез. Связывание небольшого количества молекул рецепторов с гормонами, возможно, стимулирует транскрипцию мРНК этих рецепторов, что приводит к синтезу нового количества рецепторов [28].
Подтверждение роли ДГТ получено в ходе крупных клинических испытаний, показавших, что использование ингибиторов 5-редуктазы на приматах и финастерида (ингибитора 5-редуктазы 2 типа) мужчинами предупреждает прогрессирование облысения у большинства из них и стимулирует восстановление роста волос, по крайней мере, у двух из трех пациентов [11, 78, 87, 89].
ДГТ проникает в клетки и взаимодействует со специфичными внутриклеточными белками – рецепторами андрогенов, членами суперсемейства ядерных рецепторов к стероидным и тиреоидным гормонам. Как полагается, эти рецепторы представлены в ядрах кератиноцитов дермального сосочка и волосяной луковицы. В присутствии ДГТ рецепторы андрогенов претерпевают конформационные изменение, в результате чего образуется "активированный комплекс". Этот комплекс гормон-рецептор после взаимодействия с ядерным акцептором переходит в клеточное ядро, где в виде гомодимера связывается со специфическими рецепторами ядерного хроматина. Активируется экспрессия специфичных генов, запускается глобальный процесс изменения первичной морфологии и физиологии ВФ, в котором реализуется андрогенный эффект [1, 3, 8, 26, 54, 55, 87, 107, 119]. Таким образом, ВФ представляет собой мишень для половых стероидов и обладает собственным микроокружением, способным трансформировать и модулировать биологическую активность последних.
АГА сопровождается морфофункциональными изменениями микроциркуляторного русла, принимающего участие в васкуляризации пораженного ВФ. Кровеносные сосуды таких миниатюризированных фолликулов малочисленны и извилисты [1].
Аспекты, влияющие на биологический потенциал PRP
Необходимо учитывать, что есть несколько параметров, которые зависят от протокола приготовления PRP и могут влиять на ее биологическую активность в тканях. Один из них – это концентрация тромбоцитов в PRP относительно его базового уровня в периферической крови пациента. Существующие системы предлагают протоколы, позволяющие получить как низкую концентрацию тромбоцитов, в 2,5-3 раза превышающую базовый уровень, так и высокую – в 5-9 раз выше базового уровня в крови [36]. Предполагается, что повышение концентрации тромбоцитов, а, следовательно, и факторов роста, будет приводить к более выраженному эффекту. Graziani F. и соавторы в исследовании оценки влияния различных концентраций PRP на функционирование остеобластов и фибробластов in vitro, получили данные, что более высокие концентрации могут обладать ингибирующим действием и приводить к уменьшению пролиферации клеток [48]. Какая концентрация тромбоцитарных клеток в PRP является оптимальной для решения конкретных задач и существует ли от нее зависимость терапевтического эффекта, в настоящее время остаются невыясненным. Антикоагулянты, используемые в протоколах приготовления PRP, как правило, содержат цитрат декстрозы или цитрат натрия, обратимо связывающий кальций и препятствующий инициации каскада свертывания во время центрифугирования. Добавление цитрата делает pH крови более кислой, чем физиологическая. Так как рН ткани оказывает влияние на некоторые факторы роста, некоторые протоколы рекомендуют буферизацию PRP обратно в физиологический диапазон до проведения инъекции. Данный аспект требует дальнейшего изучения.
Еще одним параметром является активация тромбоцитов с последующей дегрануляцией активных веществ. В исследованиях Kakudo N. и соавторов выделение большого количества PDGF-AB и TGF-1 было связано с экзогенной активацией PRP ионами кальция. Дополнение этих факторов роста к стволовым клеткам и фибробластам кожи человека увеличило их распространение (in vitro). И наоборот: использование не активированной PRP не способствовало большей пролиферации клеток по сравнению с контролем [63]. Многие коммерческие наборы экзогенно PRP не активируют, предполагая более физиологичную эндогенную активацию. Возможно, также учитывается, что многие факторы роста имеют короткие периоды жизни и экзогенная активация должна производиться непосредственно перед инъекцией, что несколько усложняет процедуру. Исследование, проведенное Gentile P. и соавторами с применением разных коммерческих наборов для получения PRP, показало, что у пациентов, получавших не активированную PRP, было обнаружено большее увеличение количества волос, чем у пациентов, получавших активированную PRP [43]. Вопрос активации PRP на сегодняшний день остается на обсуждении.
Эффекты PRP, содержащей лейкоцитарный слой (buffy coat), характеризуются дополнительной биологической активностью, чем PRP, в которой он отсутствует. Содержащиеся в лейкоцитарном слое нейтрофилы и моноциты, имеющие фагоцитарную активность, играют определенную роль в балансировании про-воспалительном и противовоспалительном аспектах исцеления и могут по-разному влиять на процессы регенерации [120]. При исследовании антибактериального действия PRP против штаммов Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis выявлено, что препарат имеет сильное бактериостатическое действие на данные микроорганизмы, особенно, в первые 4 часа после применения. Добавление лейкоцитарного слоя к PRP не увеличивает бактериостатический потенциал плазмы, но более вероятно замедляет воспалительный процесс местно [19].
Результаты изучения маркеров пролиферативной активности клеток ВФ после PRP-терапии
При иммуногистохимическом исследовании после лечения достоверным положительным изменениям подверглись абсолютные и относительные значения площади экспрессии CD 34 (287%, p=0,0001 и 325%, p=0,0003 соответственно), (таблица 7, рисунок 7), а также абсолютные и относительные значения площади экспрессии -catenin (165%, p=0,0306 и 96%, p=0,0018 соответственно), (таблица 7, рисунок 8).
Увеличение индекса Ki67+ также было достоверным (191%, p=0,0111), с тенденцией к увеличению количества иммунопозитивных ядер в клетках ВФ (таблица 7, рисунок 9).
При иммуногистохимическом исследовании после лечения достоверным положительным изменениям подверглись абсолютные и относительные значения площади экспрессии CD 34 (p=0,0001 и p=0,0003 соответственно), абсолютные и относительные значения площади экспрессии -catenin (p=0,0306 и p=0,0018 соответственно). Увеличение индекса Ki67+ также было достоверным (p=0,0111), с тенденцией к увеличению количества иммунопозитивных ядер в клетках ВФ.
Результаты сравнительной оценки клинической эффективности терапии с использованием PRP
Квартильное распределение динамики показателей роста волос по пациентам всех групп после лечения представлено в таблице 16.
В группе пациентов, получавших PRP-терапию, у 9 пациентов (по 36%) наблюдали отсутствие динамики по каждому из показателей роста волос. Улучшение по показателю плотности волос зафиксировано у 9 чел. (36%), по среднему диаметру волос – у 9 чел. (36%), по доле телогеновых волос – у 9 чел. (36%), по доле веллусных волос – у 10 чел. (40%). Значительное улучшение по показателю плотности, среднего диаметра и доли телогеновых волос наблюдалось у 7 чел. (по 28%), по доле веллусных волос – у 6 пациентов (24%).
В группе пациентов, получавших PRP и миноксидил в комплексной терапии, отсутствие динамики по показателю плотности волос отмечалось у 1 пациента (4,5%), по доле веллусных волос – у 2 пациентов (9%), по показателям среднего диаметра волос и доле телогеновых волос такие пациенты отсутствовали. Улучшение по показателю плотности волос наблюдалось у 13 пациентов (59%), по показателю среднего диаметра волос – у 11 пациентов (50%), по доле телогеновых волос – у 13 пациента (59%), по доле веллусных волос – у 10 пациентов (45%). Значительное улучшение по показателю плотности волос наблюдалось у 8 пациентов (36%), по показателю среднего диаметра волос – у 11 пациентов (50%), по доле телогеновых волос – у 9 пациентов (41%), по доле веллусных волос – у 10 пациентов (45%).
В группе пациентов, получавших миноксидил, отсутствие динамики по показателю плотности и среднему диаметру волос наблюдалось у 7 пациентов (по 32%), по доле телогеновых волос – у 8 пациентов (36%), по доле веллусных волос – у 6 пациентов (27%). Улучшение по показателю плотности волос наблюдалось у 11 пациентов (50%), по среднему диаметру волос – у 15 пациентов (68%), по доле телогеновых волос – у 12 пациентов (54%), по доле веллусных волос – у 14 пациентов (63%). Значительное улучшение по показателю плотности волос наблюдали у 4 чел. (18%), по доле веллусных и телогеновых волос – по 2 чел. (по 9%), по среднему диаметру волос значительных улучшений не наблюдали ни у одного пациента.
При оценке лечебного эффекта в группе пациентов, получавших лечение миноксидилом (группа сравнения), улучшение после лечения наблюдалось у 13 пациентов (59%), отсутствие динамики наблюдалось у 9 пациентов (41%).
В группе пациентов, получавших PRP-терапию (первая группа), лечение сопровождалось улучшением у 7 пациентов, что составило 28%, (из них I стадия АГА наблюдалась у 1 пациента, III стадия – у 4 пациентов, IV стадия – у 2 пациентов); значительным улучшением – у 9 пациентов (36%, из них I стадия АГА наблюдалась у 1 пациента, II стадия – у 2 пациентов, III стадия – у 5 пациентов, IV стадия – у 1 пациента); без динамики – у 9 пациентов (36%, у 4 пациентов наблюдалась III стадия, у 5 пациентов – IV стадия АГА), (таблица 17). Таким образом, лечение PRP было более эффективным, чем терапия миноксидилом (2 = 10,652, р = 0,005).
В группе пациентов, получавших комплексную терапию PRP и миноксидила (вторая группа), лечение сопровождалось улучшением у 8 пациентов, что составило 36%, (у всех пациентов наблюдалась IV стадия АГА); значительным улучшением – у 14 пациентов, что составило 64%, (из них I стадия наблюдалась у 1 пациента, по 4 пациента с II, III и IV стадией, V стадия наблюдалась у 1 пациента). Таким образом, комплексная терапия оказалась более эффективной, чем монотерапия миноксидилом (2 = 24,190, р 0,0001) и монотерапия PRP (2 = 10,003, р = 0,007). Отсутствие динамики не наблюдалось ни у одного пациента.
У пациентов, получавших PRP-терапию, эффект от лечения наблюдался у 16 человек, что составило 64%. У пациентов, получавших комплексную терапию, эффект от лечения значимо превосходил эффекты монотерапии PRP и миноксидилом.