Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1 Клинико-морфологическая характеристика базальноклеточного рака кожи 7
1.2. Дерматоскопия в диагностике базальноклеточного рака кожи 11
1.2.1 Методы диагностики базальноклеточного рака кожи 11
1.2.2 Инвазивные методы диагностики 12
1.2.3 Неинвазивные методы диагностики 13
1.3 Дерматоскопия – неивазивный метод диагностики злокачественных опухолей кожи 15
1.3.1 Общее применение дерматоскопии 15
1.3.2 Дерматоскопия в диагностике меланоцитарных опухолей кожи .16
1.3.3 Дерматоскопия в диагностике эпителиальных опухолей кожи .18
1.4 Опухолевый неоангиогенез 22
1.4.1 Иммунногистохимические маркеры неоангиогенеза 23
1.4.2 Неоангиогенез или морфология опухолевого роста 25
1.4.3 Новообразование сосудов в эпителиальных опухолях кожи .27
1.4.4 Неоангиогенез в базальноклеточном раке кожи 28
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Характеристика материала 31
2.2 Методы исследования .34
Клинические случаи .40
Глава 3 Особенности дерматоскопической картины базальноклеточного рака кожи 49
3.1 Дерматоскопические признаки клинических форм .49
3.2 Дерматоскопические признаки морфологических типов 65
Глава 4. Особенности ангиогенеза и пролиферации клеток базальноклеточного рака .84
4.1 Экспрессия маркеров CD31 и CD34 в базальноклеточном раке кожи 84
4.2 Пролиферативная активность клеток базальноклеточного рака 96
Заключение 107
Выводы .116
Список литературы
- Методы диагностики базальноклеточного рака кожи
- Иммунногистохимические маркеры неоангиогенеза
- Методы исследования
- Дерматоскопические признаки морфологических типов
Методы диагностики базальноклеточного рака кожи
Также существует класификация W. Lever в зависимости от направления дифференцировки и типа клеток. [104] Также присутствует три группы (дифференцированные, недифференцированные, особые формы), отсутстуют малодифференцированные формы, добавлены новые формы опухолей, иначе происходит распределение базальноклеточного рака кожи по формам. К дифференцированным опухолям относятся кистозный, аденоидный, кератотический, гранулярный, адамантиноподобный типы. К недифференцированным – солидный, пигментный, склеродермоподобный (морфеа) и поверхностный.
Согласно ВОЗ (Lyon, 2006) выделяют: поверхностную, нодулярную (солидную), микронодулярную, инфильтративную, фиброэпителиальную, базалиому с придатковой дифференцировкой, базально-плоскоклеточный (метатипический) рак, кистозный, кератотический, аденоидный, морфеаподобный, инфундибулокистозный, пигментный и другие типы. И.Н. Чупров считает, что по клиническим проявлениям базальноклеточный рак кожи представляет собой гетерогенную группу опухолей, биологическое поведение которой позволяет условно разделить БКР на неагрессивные и агрессивные (рецидивирующие, проникающие, метастазирующие) формы. И предлагает выделять, основываясь на формах роста опухоли, гистотопографический вариант, который складывается из комплекса особых топографических соотношений и организации опухолевой паренхимы и стромы, что в совокупности формирует тот или иной тип роста опухоли. [49]
Поверхностный БКРК характеризуется медленным интраэпидермальным ростом. Гистологически представляет длительно существующие булавовидные базалоидные пролифераты, которые развиваются из эпидермиса, не нарушая целостности базальной мембраны. Нодулярный тип роста представляет собой четко очерченную бляшковидную опухоль, из солидных, аденоидных, кистозных гистологических структур, организованных в мелко- или крупнонодулярный гистотопографический тип. Опухолевый узел обычно находится не ниже уровня придатков кожи, имеет экспансивный рост с отсутствием инвазии и разрушения тканей. Рецидивы после удаления практически отсутствуют. В некоторых случаях нодулярный БКР частично или полностью может трансформироваться в инфильтративный тип. [49] Инфильтративный вид БКР характеризуется неправильными и нечеткими контурами с небольшим «жемчужным» валиком. Микроскопически мелкие солидные опухолевые комплексы составляют инфильтративно-рассеяный тип роста с выраженной фибропластикой опухолевых клеток, более глубоким уровнем инвазии. Существует повышенный риск развития рецидивов. Деструирующий вариант БКР является крайним проявлениям этого вида. Характеризуется значительной длительностью существования, большими начальными размерами, стойким изъязвлением, распространением опухоли в подлежащие ткани с их деструкцией, регулярным рецидивированием. [48, 49, 62, 66, 67, 74, 90, 97, 139, 148]
В повседневной практике применяется клиническая классификация базальноклеточного рака кожи Т. Фицпатрика, [45] где выделяется пять клинических форм: опухолевая, поверхностная, язвенная, склеродермоподобная, пигментная. Б.А. Беренбейн, А.М. Вавилова и В.В. Дубенский предлагают выделять поверхностную, опухолевую, язвенную, пигментную, склеродермоподобную формы базальноклеточного рака кожи. [21] В.А.Молочков и Е.С.Снарская выделяют поверхностную, нодулярную, склеродермоподобную формы опухоли и разновидности внутри каждой формы. [41]
Базальноклеточный рак кожи может быть представлен единичным или множественными очагами. [3, 16] Они могут возникать единовременно либо последовательно. В последнее десятилетие отмечается рост множественной базалиомы, при которой преобладает наличие поверхностной формы. Отмечено, что при давности заболевания 12 лет чаще регистрировались множественные базалиомы по сравнению с давностью заболевания в 1 год. [11]
Развитие множественной базалиомы в юном возрасте может являться проявлением генетических синдромов (пигментная ксеродерма, синдром Горлина -Гольца). Синдром Горлина-Гольца (синдром базально-клеточного невуса) – генетически детерминированное заболевание, основным признаком которого является множественный базальноклеточный рак кожи с наличием патологии нервной, опорнодвигательной, эднокринной систем, а также глаз и других органов. Регистрируется мутация гена РТСН в хромосомном локусе 9q 22.3 q31. Для данного синдрома характерны одонтогенные кисты, ладонно-подошвенные вдавления, кисты костей, расщепления ребер, врожденная слепота, катаракта и другие признаки. Синдром составляет 0.5% всех случаев базалиом. [11, 13, 69]
При диагностике базальноклеточного рака кожи необходимо принимать во внимание ряд факторов, таких как: первичный или рецидивный рост опухоли, количество, размер, локализация, форма. Встречаются рецидивы образований после удаления различными методами. Количество рецидивов колеблется от 10 до 29% по данным различных авторов. Наиболее часто регистрировались после применения криодеструкции (47.5%). [9] Есть ряд различий в течении первичного и рецидивного базальноклеточного рака кожи. По данным литературы существует зависимость от локализации опухоли и частоты рецидивов. [36] Так, на коже нижнего века с вовлечением интрамаргинальной зоны рецидивы наблюдались в 1.9 раз чаще, чем при локализации только на веке. Рецидивы при язвенной форме регистрировались в 57%. [11]
Иммунногистохимические маркеры неоангиогенеза
Дерматоскопические изображения были выполнены при помощи дерматоскопа Heine Delta 20 и цифровой камеры Саnon. После выполнения дерматоскопического исследования, была проведена биопсия очагов. Полученный материал после обычной процедуры приготовления микроскопических препаратов и установления диагноза при окраске гематоксилином-эозином с уточнением гистологического типа подвергался иммуногистохимическому исследованию с применением моноклональных антител к CD 31, CD 34 (DАКО: Endothelial Cell), Ki-67 («Novocastra», Великобритания). Алгоритм иммуногистохимического исследования осуществлялся по протоколу иммуногистохимической реакции, предлагаемый компанией Dako:
Экспрессию CD31 оценивали количественно, подсчитывая позитивно окрашенные сосуды в 10 репрезентативных полях зрения сверху вниз, слева направо. Экспрессию CD34 оценивали при помощи запатентованной методики оценки степени васкуляризации в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена «Способ оценки степени васкуляризации» №2366951.
Сущность методики заключается в подсчете количества сосудов на парафиновом срезе образца исследуемой ткани при помощи специально разработанной программы. Способ осуществляют с использованием пленочного фотосканера высокого разрешения. Для выполнения задачи одновременно оцифровывают срез исследуемой ткани с сосудами, выявленными с помощью иммуногистохимических реакций. Это позволяет точно выбрать участок ткани, предназначенный к исследованию, что сокращает время, необходимое для оцифровки соответствующих площадей препарата при использовании микроскопа. Далее оцифрованное изображение подвергают многостадийному контрастированию в соответствии со специально разработанной методикой обработки изображения. Все стадии обработки сохраняют в отдельных слоях файла изображения, обеспечивая возможность визуального контроля и последующего уточнения полученных результатов. В программе обработки изображения (Adobe Photoshop или подобной поддерживающей полноценные слои и н-каналы) проводят многостадийное контрастирование полученного изображения препарата. Последовательность действий при разметке изображений следующая: 1. Вручную выделяют и закрашивают черным цветом не нужные участки изображения (например, пустые места). Сохраняют выделение в а -канале. 2. Сдвигают цвета изображения для повышения цветового контраста (инструмент HUE) на +82, что облегчает визуальное выделение участков со слабой иммуногистохимической окраской. 3. Инструментом Magic Wang выделяют участки, соответствующие сосудам. Чувствительность (диапазон значений пикселей относительно точки выделения) инструмента подбирается под конкретное изображение. Сохраняют выделение в н-канале. 4. Контролируют точность выделения на исходном изображении. (Слой Background). Добавляют пропущенные объекты в предыдущее выделение и сохраняют в н-канале. 5. Закрашивают выделенные объекты красным цветом. 6. Инвертируют выделение (Select/Invers). Выделенными оказываются структуры без сосудов. Сохраняют выделение в и-канале. 7. Закрашивают выделение голубым цветом. 8. Меняя прозрачность соответствующих слоев, производят контроль правильности разметки. В результате, получают изображение, где все сосуды закрашены красным цветом, участки, не содержащие сосуды, - голубым, неопухолевые участки - черным. При этом отсутствует оптическая гетерогенность внутри соответствующих областей изображения. Граница между структурами четкая, структуры однозначно определяются с помощью программ анализа изображений. Определение количества участков изображения, соответствующих сосудам, производят в программе анализа изображений (Например, Leica QWIN 500IW). На рисунке 2.2.1 представлено изображение отсканированного среза исследуемой ткани с предварительно проведенной иммуногистохимической реакцией на сосуды. Подсчет количества сосудов осуществлялся на средней площади, выведенной c учетом размера полученных препаратов.
Процедура оцифровки среза исследуемой ткани, с предварительно проведенной иммуногистохимической реакцией на сосуды, заключается в том, что вместо фотопленки в фотосканер помещают стекло с исследуемым срезом и сканируют (т.е. оцифровывают) в соответствии с инструкцией к конкретному сканеру. Разрешение при сканировании среза должно быть не менее 2400 dpi.
Статистический анализ данных проводился с использованием критерия Стьюдента (Т-критерия) для нормально распределенных показателей и статистического непараметрического критерия - точного метода Фишера, не зависящего от характера распределения показателя. Этот критерий непосредственно применим для сравнения дискретных переменных (обозначающих, например, наличие или отсутствие симптома или степень тяжести проявления какого-либо нарушения). Точный метод Фишера можно применять даже в тех случаях, когда значение признака встречается очень редко (вплоть до нуля раз). Для каждого признака (из числа включенных в анализ) проводится попарное сравнение заданных групп пациентов (реализаций), выявляются достоверные различия. Вычисляется также относительный риск каждой градации факторов риска (признаков) с доверительным 95% интервалом. Для формирования графиков, а также для проверки нормальности распределения количественных признаков, получения описательной статистики и проведения сравнения сформированных групп пациентов с использованием критериев Стьюдента (Т-критерия) и Манна-Уитни (для признаков, имеющих отличное от нормального распределение) использованы пакеты программ EXCEL 2010 и STATISTICA 6.0.
Методы исследования
Сравнительная оценка встречаемости дерматоскопических признаков в поверхностной и нодулярной форме БКР показала, что гомогенные зоны белого и красного цвета (49,3%; p 0,04) с относительным риском 1,42 (доверительный интервал --ДИ 1,04—1,95), также сосуды в виде шпилек (52,1%; p 0,009) с относительным риском 1,5 (ДИ 1,09--2,05) чаще встречались при поверхностной форме. При нодулярной форме чаще встречались древовидные сосуды (53,8%; p 0,000005), относительный риск 2,39 (ДИ 1,71—3,36) и большие сине-серые овоидные гнезда (15,4%; p 0,04) с относительным риском 1,54 (ДИ 1,03--2,3) (табл. 3.1.7).
При дерматоскопии склеродермоподобной формы было выявлено наличие древовидных сосудов, гомогенных зон, извитых сосудов, сосуды в виде шпилек и точек. (рис.3.1.5) В пигментной форме было выявлено наличие велосипедных колес, древовидных сосудов, а также линейных и сосудов в виде шпилек.
По данным литературы [69, 142] наиболее частыми дерматоскопическими признаками БКР кожи являются древовидные сосуды, которые встречаются примерно в 52% случаев. По нашим данным основным признаком базалиомы были сосудистые структуры, которые определялись в 100% случаев, однако вид их был достаточно разнообразный. Древовидные сосуды встречались в 31,7% случаев, более часто (41,5%) наблюдали сосуды в виде шпильки и извитые сосуды (39,4%). Значительно реже наблюдали короткие тонкие телеангиэктазии (26,8%), запятые (26,8%), точки (18,3%), линейные нерегулярные сосуды (16,9%), клубочки (11,3%). При анализе сосудистых структур отдельно в нодулярной и поверхностной клинической форме опухоли было установлено, что в обеих формах наблюдается весь спектр сосудистых структур.
Структуры в виде кленового листа 9 13,8 5 6,8 Сосуды в виде клубочков 9 13,9 7 9,6 Множественные сине-серые точки 5 7,7 1 1,4 Структуры в виде велосипедных колес 0 0 были выявлены преимущественно в нодулярной форме (53,8%), тогда как в поверхностной они определялись только в 10,9% случаев (p 0,000005). Аналогичные результаты были получены Д.А. Древаль и В.И. Новик [19], которые наблюдали древовидные сосуды в 71% случаев нодулярных базалиом и только в 19% поверхностных. В поверхностной форме в нашем исследовании доминировали сосуды в виде шпильки (52,1%), их частота в нодулярной форме составляла 29,2% (p 0,009). Ранее их отмечали с одинаковой частотой в обеих формах [19]. В тоже время исследователи [19] констатировали преобладание в поверхностной форме коротких тонких телеангиэктазий, полиморфных, неровных линейных и точечных сосудов.
В ходе исследования выявлено большое разнообразие сосудистых структур. Как правило, в опухоли присутствовало сочетание нескольких сосудов. По данным D. Altamura [52] короткие тонкие телеангиэктазии, а также различные виды сосудов, выявленных при дерматоскопии базальноклеточного рака кожи, можно отнести к предшественникам древовидных сосудов. В своем исследовании сосудистых структур новообразований кожи G. Argenziano и соавт. [53] выявили высокую прогностическую значимость наличия различных видов сосудов в опухоли. Наиболее часто среди сосудистых структур при меланоме кожи встречались линейные сосуды (67,7%). Полиморфные сосуды выявлены в 52,6%, к ним авторы отнесли комбинацию сосудов из двух и более структур, наиболее часто – это точки и линейные сосуды. При описании базальноклеточного рака кожи было выявлено наличие древовидных сосудов в 94,1% случаев, полиморфных сосудов -- в 10,5% [50].
Гомогенные зоны белого, красного цвета являются частым дерматоскопическим признаком базалиомы [6, 17]. В ряде исследований их наблюдали в 100% случаев [86,134], в других – в 66% беспигментных базалиом [19]. В нашем исследовании частота встречаемости гомогенных зон белого, красного цвета в базалиоме в целом составила 40,1%. Они преобладали в поверхностной форме (49,3% случаев), а в нодулярной отмечены в 30,8% случаев (p 0,04). Ранее отмечали, что данный признак с одинаковой частотой встречается в обеих клинических формах опухоли [19], другие же исследователи также чаще наблюдали его в поверхностной форме [142].
Специфичные для БКР кожи признаки -- большие сине-серые овоидные гнезда, множественные сине-серые точки, структуры в виде кленового листа и велосипедного колеса по данным литературы [17] являются признаками пигментной формы. В тоже время Д.А. Древаль и В.И. Новик [19] серо-голубые глобулы встречали в случаев беспигментных базалиом, листовидные зоны в , а крупные серо-голубые овоидные гнезда и спицевые колеса в 4%. Мы наблюдали большие сине-серые овоидные гнезда, множественные сине-серые точки и структуры в виде кленового листа в беспигметной базалиоме (9,2, 4,2 и 9,9% соответственно). Структуры в виде велосипедного колеса отмечены нами только в пигментной форме. Необходимо отметить значительное преобладание больших сине-серых овоидных гнезд в нодулярной форме (15,4%; p 0,04), по сравнению с поверхностной (4,1%).
Таким образом, наиболее часто встречаемым дерматоскопическим признаком в БКР являются сосудистые структуры, которые наблюдались в 100% случаев. Они представлены различными типами сосудов: сосуды в виде шпильки (41,5%), извитые сосуды (39,4%), древовидные сосуды (31,7%), короткие тонкие телеангиэктазии (26,8%), запятые (26,8%), точки (18,3%), линейные нерегулярные сосуды (16,9%), клубочки (11,3%). Другие дерматоскопические признаки встречались реже: яркие гомогенные зоны белого, красного цвета в 40,1% случаев, изъязвления -- в 35,2%, синие/серые овоидные гнезда -- в 9,2%; структуры в виде кленового листа -- в 9,9%, структуры в виде велосипедных колес – в 0,7% , множественные сине-серые точки – в 4,2% случаев. Сравнительная оценка встречаемости дерматоскопических признаков в различных формах базалиомы показала, что при поверхностной форме базалиомы чаще встречаются гомогенные зоны белого и красного цвета (49,3%; p 0,04) и сосуды в виде шпилек (52,1%; p 0,009); при нодулярной форме -- древовидные сосуды (53,8%; p 0,000005) и большие сине-серые овоидные гнезда (15,4%; p 0,04).
Дерматоскопические признаки морфологических типов
По данным литературы отмечали различную плотность сосудов, в центре и по периферии опухоли. При поверхностной форме ввиду ее особенности в предыдущих исследованиях подсчет производился только в пограничной области и плотность сосудов, экспрессирующих CD34, составляла 19,7±0,1 %. [49] В нодулярной форме вне зависимости от гистологического типа плотность сосудов в пределах опухолевого узла составляла 21,2±0,7 %, что было больше, чем в пограничной зоне (20,5±0,6 %). В инфильтративном варианте плотность сосудов в зоне опухоли и в пограничной зоне составляла соответственно 6,3±0,2 и 10,7±0,4 %. [49]. В нашем и исследовании в поверхностной и нодулярной форме БКР отмечалась различная экспрессия сосудистых маркеров в разных зонах опухоли: при поверхностной форме отмечалась преимущественно в субэпидермальной области, где встречались сосуды малого и реже среднего диаметра. Для нодулярной формы были характерны сосуды среднего и крупного диаметра вокруг опухолевых комплексов и в верхней, средней и нижней части дермы, по периферии, на границе со здоровыми тканями сосудов было значительно больше, чем в центре опухоли. Отмечалась корреляционная пропорциональная зависимость между экспрессией маркеров CD31 и CD34 в обеих формах опухоли.
Существует значительная взаимосвязь по данным литературы между плотностью микрососудов и гистологическими типами базальноклеточного рака кожи. При исследовании 25 образцов БКР агрессивного типа (БКР 1) и 25 БКР неагрессивного типа (БКР 2), среди БКР 2 плотность микрососудов составила 40. 22 случая из 25 отличались агрессивным клиническим течением. Cреди БКР 18 случаев соответствовали БКР 2 ( 40). Интересно, что в 5 случаях из них выявлено агрессивное клиническое поведение в отличие от их гистологической картины. Высокий уровень плотности сосудов отмечался в опухолях с агрессивным течением и авторы предположили наличие корреляции между неоангиогенезом гистологической картиной и морфологией опухоли. [54]. Наши исследования показали наличие значимой достоверной связи между экспрессией CD31 и CD34 в гистологических типах базальноклеточного рака кожи: в поверхностной мультицентрическом типе коэффициент корреляции между CD31 и CD34 составил 0,76, в нодулярном – 0,99, в инфильтративном – 0,95. При сравнении количества сосудов, экспрессирующих CD31 и CD34, в разных морфологических типах наблюдалась выраженная тенденция к их увеличению при инфильтративном типе, характеризующимся агрессивным ростом, по сравнению с поверхностным мультицентрическим и нодулярным.
Различия в ангиогенезе при разных морфологических типах опухоли наблюдали и в других исследованиях [25]. Высокий уровень экспрессии моноклональных антител к СD34 отмечали в солидных типах БКР, средний – в БКР с пилоидной дифференцировкой, наиболее низкий уровень – при БКР типа морфеа [25]. В данном исследовании наоборот авторы отмечали, что при морфологических формах базальноклеточного рака кожи, отличающихся агрессивным ростом, имеется малое количество микрососудов и низкая степень выраженности ангиогенеза. Однако было подчеркнуто, что для выявления более чётких закономерностей между морфологическими формами базальноклеточного рака кожи и процессами ангиогенеза необходимо дальнейшее исследование на большем количестве материала [25].
Установлено наличие значимой достоверной связи между количеством сосудов, экспрессирующих CD31, и количеством сосудов, экспрессирующих CD34, при различных гистологических типах базальноклеточного рака кожи: коэффициент корреляции между экспрессией маркеров CD31 и CD34 при поверхностном мультицентрическом типе составил 0,76 (p 0,05), в нодулярном – 0.99 (p 0,05), в инфильтративном 0,95 (p 0,05). При сравнении экспрессии маркеров CD31 и CD34 в разных гистологических типах отмечена выраженная тенденция к увеличению количества сосудов, экспрессирующих CD31 и CD34, в инфильтративном типе базальноклеточного рака кожи, по сравнению с поверхностным мультицентрическим и нодулярным.
Таким образом, выявлена различная васкуляризация при поверхностной и нодулярной формах базалиомы. При поверхностной форме отмечались сосуды малого и реже среднего диаметра, экспрессирующие СD31 и CD34, локализующиеся преимущественно в субэпидермальной области. Для нодулярной формы были характерны сосуды среднего и крупного диаметра, локализующиеся вокруг опухолевых комплексов и в верхней, средней и нижней части дермы. Выявлена корреляционная пропорциональная зависимость между количеством сосудов, экспрессирующих CD31, и количеством сосудов, экспрессирующих CD34, как в поверхностной, так и в нодулярной формах (коэффициент Спирмена 0,93; р 0,05).