Экстракорпоральная фотохимиотерапия в комплексном лечении ограниченной склеродермии ФОМИНА Ольга Александровна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы .11

1.1. Современные представления об этиологии и патогенезе ограниченной склеродермии 11

1.2. Классификация и клиническая картина ограниченной склеродермии .15

1.3. Современные методы лечения ограниченной склеродермии 22

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования

2.1. Клиническая характеристика больных ограниченной склеродермией .34

2.2. Методика проведения экстракорпоральной фотохимиотерапии .43

2.3. Методы исследования

2.3.1. Определение поверхностных дифференцировочных антигенов и адгезивных молекул на клетках периферической крови методом проточной цитофлюорометрии 44

2.3.2. Методы статистической обработки полученных результатов 44

Глава 3. Клинический анализ применения экстракорпоральной фотохимиотерапии в комплексном лечении ограниченной склеродермии .45

Глава 4. Особенности иммунной системы больных ограниченной склеродермией и влияние на нее экстракорпоральной фотохимиотерапии 59

Заключение 76

• Классификация и клиническая картина ограниченной склеродермии
• Современные методы лечения ограниченной склеродермии
• Определение поверхностных дифференцировочных антигенов и адгезивных молекул на клетках периферической крови методом проточной цитофлюорометрии
• Клинический анализ применения экстракорпоральной фотохимиотерапии в комплексном лечении ограниченной склеродермии

Введение к работе

Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям

ограниченная склеродермия (ОС) – это аутоиммунное заболевание

мультифакториального генеза, в основе которого лежит прогрессирующее поражение соединительной ткани с преобладанием фиброзно-склеротических и сосудистых нарушений. При ОС наблюдается очаговое и диссеминированное поражение кожи и подлежащих тканей различной степени выраженности. Заболевание характеризуется длительным, хроническим, проградиентным течением с периодами обострений и ремиссий [Дворников А.С. и др., 2007;Valanciene G. et al. 2010].

По данным ряда авторов частота заболеваемости ОС колеблется в пределах от 0,4 до 2,7 случаев на 100 тыс. населения. Пик заболеваемости приходится на лица трудоспособного возраста, в 75% случаев заболевают женщины [Fett N. et al. 2011].

При ОС возможно поражение подкожной жировой клетчатки, фасций, мышц, сухожилий, что приводит к выраженным органическим, функциональным, косметическим и психологическим нарушениям больного [Laxer R.M. et al., 2006]. Кроме того, проведенные эпидемиологические исследования показывают, что у 0,9-5,7% пациентов ОС прогрессирует в системную форму [Peterson L.S. et al., 1995; Chung L. et al., 2006].

Традиционные методы терапии приводят к недостаточной клинической
эффективности и непродолжительной ремиссии у 40% больных ОС, подлежащих
лечению [Rcken M. et al., 2003]. Так, клиническая эффективность антибиотиков
пенициллинового ряда (10-30 млн. ЕД ежедневно в течение 2-4 недель) была
отмечена только у 5% пациентов [Mancuso G. et al., 2003], кроме того, отмечают
частое возникновение аллергических реакций при их применении (крапивница,
бронхоспазм, анафилактический шок) [Навашин Н.М., 1988].

Глюкокортикостероиды (ГКС) являются базисными препаратами в терапии системной склеродермии и широко используются при лечении ОС, в частности при глубокой, линейной и генерализованной формах [Zulian F. et al., 2006].

Однако их эффективность отмечена только на воспалительной стадии
заболевания, а на уже сформировавшиеся очаги фиброза влияния не оказывают
[Weibel L. et al., 2006]. ГКС также вызывают множественные осложнения и
побочные эффекты (артериальная гипертензия, аритмия, панкреатит, язва желудка
и др.) [Chrousos G.A. et al., 1993]. При лечении Д-пеницилламином зачастую
развиваются побочные эффекты в виде лейкопении и тромбоцитопении,
эрозивно-язвенного поражения слизистых оболочек, протеинурии, развитии
гломерулонефрита [Steen V.D. et al., 1986]. При использовании

противомалярийных препаратов отмечается очень медленное развитие

клинического эффекта (до 6 месяцев) и недостаточная его выраженность
[Главинская Т.А, 2000]. В связи с тем, что лечение ОС должно быть
комплексным, многокурсовым, длительным, происходит существенная

медикаментозная нагрузка на организм больного [Волнухин В.А., 2004]. Развитие побочных эффектов, недостаточные клиническая эффективность и длительность ремиссии, медикаментозная перенасыщенность диктуют необходимость поиска новых методов лечения ОС.

Наиболее перспективным методом для лечения аутоиммунных заболеваний является метод экстракорпоральной фотохимиотерапии (ЭФХТ) (фотоферез) [French L.E. et al., 2002]. Сегодня ЭФХТ является методом выбора для лечения пациентов с эритродермической формой грибовидного микоза и синдромом Сезари [Edelson R.L. et al., 1987; Trautinger F., 2006]. Появилось множество данных об успешном применении фотофереза в лечении вульгарной пузырчатки, системной красной волчанки, саркомы Капоши, атопического дерматита, псориатического артрита [Rook A.H.et al., 1999]. Об эффективности ЭФХТ при ОС имеются только единичные публикации [Chiesa-Fuxench Z.C. et al., 2010].

В патогенезе ОС огромная роль отводится аутоиммунным механизмам с мононуклеарной инфильтрацией пораженных тканей, что послужило основанием для применения ЭФХТ [Gabrielli A. et al., 2009; Atzeni F. et al., 2006]. Впервые выраженный эффект от данного лечения описали у 2 больных с быстро прогрессирующей системной склеродермией, резистентной к другим методам

лечения [Rook A.H. et al.,1989]. Также Cribier и соавт. (1995) описали больного бляшечной склеродермией с наличием крупных бляшек в области верхних конечностей, который получал лечение фотоферезом в качестве монотерапии, в результате лечения количество элементов уменьшилось и некоторые даже исчезли. Данные обстоятельства послужили для нас основанием для проведения научно-исследовательской работы по изучению клинической эффективности и механизма действия ЭФХТ у больных ОС.

Цель исследования

Повышение эффективности лечения больных ограниченной склеродермией
на основе включения в комплексную терапию экстракорпоральной

фотохимиотерапии.

Задачи исследования

1. Оценить характер и выраженность нарушений клеточного звена иммунитета в развитии аутоиммунного процесса при ОС;

2. Определить значение и роль ЭФХТ в комплексном лечении ОС на основании клинической оценки критериев эффективности лечения;

3. Провести патогенетическое обоснование включения ЭФХТ в комплексное лечение больных ОС.

Научная новизна

Впервые разработан и научно обоснован новый комплексный метод лечения с применением ЭФХТ у больных ОС.

Впервые на основании проведения сравнительной оценки клинической эффективности ЭФХТ в комплексном лечении ОС установлено его преимущество перед стандартными методами лечения.

При проведении иммунологических исследований на основании изучения
экспрессии молекул коактивации и адгезии у больных ОС, были выявлены
изменения со стороны функциональных свойств иммунокомпетентных клеток,
отражающие дисбаланс активационных и толерогенных механизмов,

обеспечивающих иммунологический гомеостаз, с преобладанием активационного потенциала.

Было установлено, что достигнутое улучшение у больных ОС
сопровождается восстановлением иммунологического гомеостаза,

характеризующееся снижением активационных процессов и увеличением толерогенных за счет снижения экспрессии молекул коактивации на эффекторных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах. Таким образом, установлено, что ЭФХТ обладает выраженным иммунорегуляторным действием, что коррелирует с клиническим улучшением.

Научно-практическая значимость работы

Впервые разработан и внедрен патогенетически обоснованный метод комплексного лечения ОС с применением ЭФХТ. Продемонстрирована его высокая клиническая эффективность как у пациентов с резистентностью к ранее проводимой терапии, так и у больных на начальных этапах заболевания. Использование ЭФХТ в комплексе с традиционными методами позволяет увеличить продолжительность ремиссии в 2,4 раза.

Отсутствие побочных реакций и осложнений, высокая клиническая эффективность позволяют рекомендовать включение ЭФХТ в комплекс лечебных мероприятий у больных ОС

Результаты иммунологического исследования свидетельствуют о

выраженной патогенетической направленности действия ЭФХТ.

Положения, выносимые на защиту

1. Больные ОС характеризуются дисбалансом функциональных свойств иммунокомпетентных клеток с преобладанием активационного иммунофенотипа СD3⁺CD4⁺CD62L⁺CD28⁺CD27⁺ над толерогенным СD3⁺CD8⁺CD62L⁺СD27^-CD28^-.

2. Использование метода ЭФХТ в комплексном лечении ОС значительно повышает клиническую эффективность в отношении как ближайших, так и отдаленных результатов;

3. Механизм действия ЭФХТ обусловлен восстановлением иммунного гомеостаза благодаря снижению экспрессии коактивационных маркеров CD27 и СD28 на СD4+ и СD8+ Т-клетках.

Внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность
отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗ МО МОНИКИ им.
М.Ф. Владимирского, Московского областного кожно-венерологического
диспансера и используются в учебной деятельности на кафедрах

дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского.

Апробация и публикация материалов исследования

Основные материалы диссертации доложены на научно-практической
конференции «Плазмаферез 2013» (Санкт-Петербург, 2013г.), научно-

практической конференции «Актуальные вопросы нефрологии, диализа, хирургической гемокоррекции и гемафереза» (Москва-Тверь, 2013г., Москва-Углич, 2014г.), научно-практической конференции молодых ученых «Фотоферез, трансиммунизация и трансляционная клеточная иммунотерапия» (Москва, 2014г).

Апробация диссертации состоялась 10 июня 2015 года на заседании кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует паспорту научной специальности 14.01.10 – Кожные и венерические болезни; формуле специальности: Кожные и венерические болезни, а также области исследований согласно пунктам 1,3,4.

Структура и объем диссертации

Классификация и клиническая картина ограниченной склеродермии

Склеродермия представляет собой аутоиммунное заболевание мультифакториального генеза, в основе которого лежит прогрессирующее поражение соединительной ткани с преобладанием фиброзно-склеротических и сосудистых нарушений по типу облитерирующей микроангиопатии [28, 30].

Согласно МКБ-10 (ВОЗ) различают 2 основные формы склеродермии: ограниченную и системную (с вовлечением внутренних органов). При ограниченной склеродермии (син. «локализованная», «очаговая», «морфеа») наблюдается очаговое и диссеминированное поражение, главным образом, кожи и подкожной клетчатки различной степени выраженности. При системной склеродермии происходит вовлечение в патологический процесс не только кожи и подлежащих тканей, но и висцеральных органов (почек, сердца, легких, желудочно-кишечного тракта). Заболевание характеризуется длительным, хроническим, проградиентным течением с последовательным чередованием стадий воспаления, фиброза и атрофии в эволюции патологического процесса [12, 28,186, 187].

Этиология склеродермии сложна и недостаточно изучена. Предполагают, что данное заболевание мультифакториального генеза и обусловлено взаимодействием неблагоприятных экзо- и эндогенных факторов с генетической предрасположенностью. К экзогенным факторам относят: переохлаждения, вибрации, травмы, действие различных химических агентов (промышленных, алиментарных, бытовых), лекарственных препаратов, инфекции (вируса Эпштейн-Барра, варицелла Зостер, вирус кори и др.), вакцинации. Эндогенные факторы включают в себя: психоэмоциональный стресс, нейроэндокринные сдвиги, беременность, менопаузу и др. [28, 35, 82, 150, 157, 161]. Распространенность заболевания в одной семье, высокая частота других аутоиммунных заболеваний в семьях пациентов со склеродермией, и различия в фенотипах среди рас и этнических групп позволяют сделать вывод о генетической предрасположенности к склеродермии. Склеродермия связана с полиморфизмом генов, кодирующих цитокины, цитокиновые рецепторы, хемокины и внеклеточные белки. Есть убедительные доказательства сцепления определенных молекул гистосовместимости класса HLA II с клиническими фенотипами и определенными аутоантителами. Полученные данные говорят о том, что склеродермия представляет собой не четко определенную болезнь, а синдром, охватывающий различные фенотипы. Кроме того, несколько докладов указывают, что во время беременности, эмбриональные или материнские лимфоциты могут пересечь плаценту и инициировать реакцию трансплантата ткани против хозяина, которая достигает максимального развития при склеродермии. Есть клинические, серологические и гистопатологические общие черты между склеродермией и хронической реакцией "трансплантанта против хозяина" (GVHD), и были обнаружены аллогенные клетки в периферической крови и в биоптатах кожи, полученных от пациентов со склеродермией. Однако точных доказательств, что эти клетки участвуют в патогенезе склеродермии, в настоящее время недостаточно [55, 81, 84, 143].

Ограниченную и системную склеродермию рассматривают с точки зрения единого аутоиммунного патологического процесса [86, 124, 186]. Это подтверждается однонаправленностью метаболических, патогистологических и иммуногистохимических изменений в коже, а также известными случаями трансформации локализованного процесса в системный [14, 28, 32, 41, 157].

В настоящее время в патогенезе склеродермии можно выделить 3 взаимосвязанных патологических процесса: поражение мелких артериол и капилляров, мононуклеарная инфильтрация и избыточная продукция коллагена фибробластами [8, 38, 74, 79, 86, 116, 125, 131, 186].

Сосудистые повреждения представлены вакуолизацией цитоплазмы эндотелиальных клеток, утолщением базальной мембраны, гиперплазией интимы, облитерацией капилляров, периваскулярной инфильтрацией мононуклеарными клетками. Утолщение сосудистой стенки происходит за счет активной пролиферации гладкомышечных клеток и перицитов, тогда как эндотелиальные клетки подвергаются апоптозу. Перициты способны дифференцироваться в сосудистые гладкомышечные клетки, фибробласты и миофибробласты. Перициты экспрессируют несколько цитокиновых рецепторов, включая рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF). Несмотря на прогрессивную потерю кровеносных сосудов и высокий уровень сосудистого эндотелиального фактора роста в плазме крови, вызванный адаптивным ответом на гипоксию, васкулогенез недостаточен. Молекулярный механизм, лежащий в основе этого парадокса неизвестен: обнаружены как факторы, способствующие ангиогенезу, так и ангиостатические. В особенности воспалительные цитокины (в частности, фактор некроза опухоли альфа) могут стимулировать или ингибировать ангиогенез в зависимости от продолжительности стимула. Кроме того, вызванная гипоксия приводит к активации фибробластов и повышенному синтезу цитокинов (PDGF, трансформирующего фактора роста бета-1(ТGF-бета-1)) [26, 71, 116, 142, 186, 190]. Клеточный инфильтрат на ранних стадиях заболевания состоит, главным образом, из Т-клеток, макрофагов, В-клеток. По данным ряда авторов Т-клетки представлены преимущественно CD4+ клетками, демонстрирующими олигоклональную пролиферацию в основном T-хелперных клеток 2 типа (Th2). Это подтверждается повышенным уровнем цитокинов, синтезируемых Th2 клетками. Также были обнаружены СD20+ клетки, для активации которых необходимы цитокины (ИЛ-6, TGF-бета), вырабатываемые Т-клетками [2, 13, 26, 75, 116, 148, 167]. В-клетки участвуют в иммунопатогенезе заболевания посредством синтеза аутоантител. Многие аутоантитела являются важными диагностическими маркерами. Анализы на аутоантитела к топоизомеразе-1 (Scl-70), центромерным белкам, антинуклеарным антителам могут быть полезными в установлении диагноза и прогноза. При ОС наиболее часто встречается повышение титра антинукеарных антител, антител к одноцепочечной ДНК, антигистоновых антител. Хотя уровень повышения аутоантител коррелирует с тяжестью течения заболевания, их патогенетическая взаимосвязь не ясна [9, 34, 104, 127, 157, 186, 187].

Изучение участков транскрипции генома экземпляров биопсии кожи пациентов со склеродермией напрямую доказало участие цитокинов в активации фибробластов. Полученные данные указывают на системные изменения в транскрипции генов в эндотелиальных клетках, фибробластах, Т- и В-лимфоцитах, причем данные изменения присутствуют как в клинически измененной, так и не пораженной коже [84, 116, 121, 188]. TGF-бета является мощным профиброзным цитокином. Микроматричный анализ ДНК в экземплярах биопсии пораженной кожи указывает на экспрессию TGF-бета зависимых генов. TGF-бета активизирует фактор роста соединительной ткани (CTGF) в фибробластах. TGF-бета совместно с эндотелином-1 инициирует преобразование фибробластов в миофибробласты [121, 124, 128, 138, 160]. PDGF также играет роль в патогенезе склеродермии. Обнаружено присутствие высокого уровня PDGF и его бета-рецептора в пораженных кожных покровах, а также наличие антител к рецепторам PDGF в сыворотке крови у таких пациентов [85, 116].

Цитокины, продуцируемые Т-лимфоцитами, осуществляют контроль функции фибробластов. ИЛ-4 и ТGF-бета вызывают избыточную продукцию коллагена (I, II, III типов). ИЛ-4 продуцируется Т-хелперными клетками 2 типа и может напрямую усиливать продукцию ТGF-бета Т-клетками [13, 65, 83].

Таким образом, можно сделать вывод о патологической активности Т- и В-лимфоцитов [2, 8, 9, 23, 76, 80, 180]. Однако в настоящее время не имеется достаточно данных, позволяющих связать уровни и деятельность всех цитокинов в единую цепочку патогенеза.

Современные методы лечения ограниченной склеродермии

Под нашим наблюдением находилось 50 больных ОС, которые были разделены на 2 группы. В I (основную) группу были включены 25 пациентов, получавших комплексное лечение с применением ЭФХТ и стандартной терапии (пенициллин, препараты гиалуронидазы (лидаза, лонгидаза), сосудистые препараты (ксантиноланикотинат, трентал), наружно троксевазин и димексид). II (контрольную) группу составили 25 пациентов, которые получали только стандартную терапию.

Процедуру ЭФХТ все больные перенесли удовлетворительно, осложнений и побочных эффектов отмечено не было. Уже первые дни наблюдения в процессе проводимой терапии позволили получить положительные изменения в общем состоянии и кожном статусе пациентов, получавших комплексную терапию в сочетании с ЭФХТ.

В I группе положительный терапевтический эффект различной степени выраженности был отмечен у каждого из 25 пациентов уже после первого сеанса лечения. У всех пациентов отмечалось значительное уменьшение зуда и ощущения стягивания кожи. Интенсивность эритемы уменьшилась с 2,76+0,38 до 2,23+0,31баллов (р 0,01). Интенсивность индурации cнизилась с 2,95+0,13 до 2,73+0,12 (р 0,01). В незначительной степени уменьшилась площадь индурации (исходная площадь – 39,84+9,68 см в кв.). Также, если до лечения индекс mRODNAN Skin Score составлял 15,2+4,14 баллов, то после лечения за счет снижения плотности очагов - 14,26+3,79 баллов (р 0,01).

На 5-6 день (после 2 сеансов ЭФХТ) у 18 пациентов зуд и ощущение стягивания кожи разрешились полностью. Интенсивность эритемы снизилась до 1,54+0,28 баллов, интенсивность индурации - до 2,48+0,13, площадь индурации – до 37,08+9,97 см в кв. (р 0,01). Индекс mRODNAN Skin Score составил 13,18 +3,39 баллов (р 0,01). На 10-11 день (после 3 сеансов ЭФХТ) венчики гиперемии значительно побледнели: интенсивность эритемы уменьшилась до 0,86+0,2 балла (р 0,01). Интенсивность индурации снизилась до 2,28+0,14 баллов, площадь поражения -до 35,32+9,98 см в кв. (р 0,01). Индекс mRODNAN Skin Score составил 12,18 +3,21 баллов (р 0,01).

На 15-16 день (после 4 сеансов ЭФХТ) венчики гиперемии у 10 пациентов разрешились полностью, у остальных 15 - слабо выраженная гиперемия, интенсивность эритемы составила 0,22+0,2 балла (р 0,01). Бляшки значительно размягчились, интенсивность индурации – 2,01+0,15 балла (р 0,01). Площадь поражения уменьшилась на 15,73+3,47% по сравнению с исходным уровнем (р 0,01). Индекс mRODNAN Skin Score уменьшился до 11+2,92 баллов (р 0,01), что составляет 27,4+4,88% по сравнению с исходным уровнем.

Во II группе положительная клиническая динамика отмечалась в значительно меньшей степени. На 2-3 день лечения клиническая картина осталась практически без изменений, отмечалось едва заметное побледнение венчика гиперемии.

На 5-6 день лечения интенсивность эритемы снизилась до 2,32+0,33 баллов (исходное значение – 2,8+0,35) (р 0,01). При оценке интенсивности индурации, индекса mRODNAN Skin Score была отмечена незначительная положительная динамика. Площадь поражения у большинства (76%) пациентов сохранялась на исходном уровне, у остальных – в незначительной степени уменьшилась.

На 10-11 день лечения интенсивность эритемы снизилась только до 1,62+0,27 баллов (р 0,01). Интенсивность индурации уменьшилась до 2,46+0,33 (исходное значение - 2,74+0,38) (р 0,01). Площадь поражения изменилась в незначительной степени. Индекс mRODNAN Skin Score снизился до 12,78 +2,93баллов (исходное значение - 14,16+3,25 баллов) (р 0,01).

И на 15-16 день лечения интенсивность эритемы составила 1,16 +0,28 балла, интенсивность индурации 2,28+0,31 балла (р 0,01). Площадь поражения снизилась на 5,3+1,64% по сравнению с исходным уровнем (р 0,01). Индекс mRODNAN Skin Score снизился до 11,96+2,92 баллов (р 0,01). Динамика основных клинических показателей в основной и контрольной группах представлена на рис.3.1, 3.2, 3.3.

Рис. 3.1. Динамика уменьшения интенсивности эритемы и индурации в процессе лечения в основной и контрольной группах.

Как видно из рис. 3.1, 3.2, 3.3, положительная динамика клинической картины в основной группе развивалась значительно быстрее, чем в контрольной группе. После проводимой терапии в основной группе был достигнут значительно более выраженный клинический эффект, чем в контрольной группе (табл.3.1.). Таблица 3.1 Сравнительная оценка результатов клинической эффективности в основной и контрольной группах после проводимой терапии (M+m), p 0, Индексы снижения Основная группа (в %) Контрольная группа (в %) Иэ (снижение интенсивности эритемы) 92,19+7,06 58,81+7,67 Ии (снижение интенсивности индурации) 31,74+4,06 16,84+4,93 Ип (снижение площади поражения) 15,73+3,47 5,3+1,64 Снижение mRODNAN Skin Score 27,4+4,88 15,8+2,41 Применяя полученные данные для расчета индекса относительного уменьшения поражения кожи (Ик), мы получили следующие результаты: среднее значение Ик (M+m) у пациентов I группы после комплексного лечения с применением ЭФХТ составило 57,96+4,38%. Среди них у 24 (96%) пациентов результаты трактовались как значительное улучшение (Ик 50%), у 1 (4%) пациентов – улучшение (25% Ик 50%).

В контрольной группе после курса стандартной терапии среднее значение Ик (M+m) составило 34,94+4,23%. Среди них у 24 (96%) пациентов наблюдали улучшение (25% Ик 50%) и у 1 (4%) пациентов не удалось добиться достаточно значимого клинического улучшения (Ик 25%). достигнут у пациентов, длительность заболевания которых составляла менее 3 лет. После комплексного лечения венчик гиперемии разрешился полностью у 47% пациентов, у остальных сохранялась легкая гиперемия, интенсивность эритемы снизилась на 95,46+5,66% (р 0,01). Интенсивность индурации снизилась на 32,62+3,66%, площадь индурации уменьшилась на 17,41+2,28% (р 0,01). Ик составил 60,24+2,71% (р 0,01). Индекс mRODNAN Skin Score снизился с 14,47+3,71 до 10,12+2,18 баллов (снижение на 29,5+4,12%) (р 0,01).

У пациентов с течением заболевания от 4 до 7 лет клинический эффект был выражен в несколько меньшей степени. После комплексного лечения у всех пациентов сохранялся венчик гиперемии, но значительно побледнел, интенсивность эритемы снизилась на 85,22+4,04% (р 0,01). Интенсивность индурации снизилась на 29,87+4,48%, площадь индурации уменьшилась на 12,16+2,83% (р 0,01). Ик составил 53,12+3,1% (р 0,01). Индекс mRODNAN Skin Score снизился с 16,75+4,83 до 12,88+3,52 баллов (р 0,01) (снижение на 22,93+3,03%).

Определение поверхностных дифференцировочных антигенов и адгезивных молекул на клетках периферической крови методом проточной цитофлюорометрии

Целью нашего исследования являлось повышение эффективности лечения больных с ОС на основе включения в комплексную терапию ЭФХТ. Под нашим наблюдением находились 50 пациентов с ОС, которые находились на стационарном лечении в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ имени М.Ф. Владимирского. Диагноз устанавливался на основании анамнеза, клинической картины заболевания, результатов лабораторного и гистологического исследования. Возраст больных варьировал от 14 до 68 (средний возраст 47,5+14,8). Среди больных было 4 мужчин и 46 женщин. При распределении больных ОС по клиническим вариантам у 38 (76%) пациентов был диагностирован бляшечный вариант склеродермии, у 3(6%) – генерализованный, у 6 (12%) – линейный, у 3 (6%) пациентов был установлен диагноз очень ранней системной склеродермии.

Для изучения эффективности комплексной терапии ОС с применением ЭФХТ все пациенты были разделены на 2 группы, сопоставимые по полу, возрасту, сопутствующей патологии, длительности течения и тяжести заболевания. I (oсновную) группу составили 25 больных, получавших комплексное лечение с применением ЭФХТ, из которых 17(68%) неоднократно получали курс стандартной терапии, 4(16%) получали также делагил, плаквенил, преднизолон. II (контрольная) группа включала 25 больных, получавших только курс стандартной терапии, ранее 16 (66%) из них также неоднократно получали курс стандартной терапии

При оценке эффективности лечения у каждого больного (по методике Волнухина В.А., 2004) [16] рассчитывались индексы относительного уменьшения клинических признаков в процентах: снижения выраженности эритемы, снижения интенсивности индурации и площади поражения. Далее по формуле выводился суммарный индекс уменьшения поражения кожи: Ик=(Иэ +(Ип+Ии):2)/2, где Ик - индекс относительного уменьшения поражения кожи, Иэ – индекс снижения интенсивности эритемы, Ип - индекс снижения площади поражения, Иr -индекс снижения интенсивности индурации. Результаты лечения, если Ик составлял 95% и более, трактовались как клиническое выздоровление, 51%-94% - значительное улучшение, 25-50% -улучшение, менее 25% - отсутствие эффекта.

Методика ЭФХТ заключалась в следующем: проводили выделение мононуклеарных клеток с помощью клеточного сепаратора «HAEMONETICS MCS+» по протоколу RBCP (выделение стволовых клеток). За одну процедуру выделяли от 40 до 70 мл. концентрата мононуклеарных клеток, которые ресуспендировали в 0,9% растворе хлористого натрия, доводя общий объем до 200,0 мл. Клеточную суспензию подвергали ультафиолетовому воздействию на аппарате УФО «ЮЛИЯ» при длине волны 320-380 нм. Общая доза экспозиции составляла 0,8-1,2 дж/см2. В качестве фотосенсибилизатора использовали отечественный препарат аммифурин в дозе 0,6 мг/кг, который пациент принимал за 2 часа до процедуры. После облучения клетки реинфузировали в течение 30 мин.

Курс лечения включал 4 сеанса, проводимых через 1-2 дня. В работе использовались как общепринятые, так и специальные методы исследования. Проводили многопараметровый (5-параметровый) проточно-цитофлюориметрический субпопуляционный анализ поверхностных антигенов с использованием коммерческих моноклональных антител к поверхностным антигенам CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD62L, CD19, CD16, CD56, фирмы BeckmanCoulter конъюгированных FITC, PE, ECD, PC5, и PC7. В качестве контроля применяли коммерческие сыворотки, содержащие изотипические антимышинные Ig, конъюгированные соответствующим флюорохромом.

Результаты, полученные в ходе исследования, обрабатывались методами статистического анализа с использованием пакета MSOffice 2007 для Windows 7 и программы Statistica v. 6.0. Процедуру ЭФХТ все больные перенесли удовлетворительно, осложнений и побочных эффектов отмечено не было. Уже с первых дней наблюдения в процессе проводимой терапии позволили отметить положительные изменения в общем состоянии и кожном статусе пациентов, получавших комплексную терапию в сочетании с ЭФХТ.

В I группе положительный терапевтический эффект различной степени выраженности был отмечен у каждого из 25 пациентов уже после первого сеанса лечения. У всех пациентов отмечалось значительное уменьшение зуда и ощущения стягивания кожи, интенсивность эритемы уменьшилась с 2,76+0,38 до 2,23+0,31баллов (р 0,01). Интенсивность индурации cнизилась с 2,95+0,13 до 2,73+0,12(р 0,01). В незначительной степени уменьшилась площадь индурации (исходная площадь – 39,84+9,68 см в кв.). Также, если до лечения индекс mRODNAN Skin Score составлял 15,2+4,14 баллов, то после лечения за счет снижения плотности очагов - 14,26+3,79 баллов (р 0,01).

На 5-6 день (после 2 сеансов ЭФХТ) у 18 пациентов зуд и ощущение стягивания кожи разрешились полностью. Интенсивность эритемы снизилась до 1,54+0,28 баллов, интенсивность индурации - до 2,48+0,13, площадь индурации – до 37,08+9,97 см в кв (р 0,01). Индекс mRODNAN Skin Score составил 13,18 +3,39 баллов (р 0,01).

На 10-11день (после 3 сеансов ЭФХТ) венчики гиперемии значительно побледнели: интенсивность эритемы уменьшилась до 0,86+0,2 балла (р 0,01). Интенсивность индурации снизилась до 2,28+0,14 баллов, площадь поражения -до 35,32+9,98 см в кв. (р 0,01). Индекс mRODNAN Skin Score составил 12,18 +3,21 баллов (р 0,01).

На 15-16 день (после 4 сеансов ЭФХТ) венчик гиперемии у 10 пациентов разрешился полностью, у остальных 15 - слабо выраженная гиперемия, интенсивность эритемы составила 0,22+0,2 балла (р 0,01). Бляшки значительно размягчились, интенсивность индурации – 2,01+0,15 балла (р 0,01). Площадь поражения уменьшилась на 15,73+3,47% по сравнению с исходным уровнем (р 0,01). Индекс mRODNAN Skin Score уменьшился до 11+2,92 баллов (р 0,01), что составляет 27,4+4,88% по сравнению с исходным уровнем. Во II группе положительная клиническая динамика отмечалась в значительно меньшей степени. На 2-3 день лечения клиническая картина осталась практически без изменений, отмечалось едва заметное побледнение венчика гиперемии. На 5-6 день лечения интенсивность эритемы снизилась до 2,32+0,33 баллов (исходное значение – 2,8+0,35 баллов) (р 0,01). При оценке интенсивности индурации, индекса mRODNAN Skin Score была отмечена незначительная положительная динамика. Площадь поражения у большинства (76%) пациентов сохранялась на исходном уровне, у остальных – в незначительной степени.

На 10-11 день лечения интенсивность эритемы снизилась только до 1,62+0,27 баллов (р 0,01). Интенсивность индурации уменьшилась до 2,46+0,33 (исходное значение - 2,74+0,38) (р 0,01). Площадь поражения изменилась в незначительной степени. Индекс mRODNAN Skin Score снизился до 12,78 +2,93 баллов (исходное значение - 14,16+3,25 баллов) (р 0,01).

И на 15-16 день лечения интенсивность эритемы составила 1,16 +0,28 балла, интенсивность индурации 2,28+0,31 балла (р 0,01). Площадь поражения снизилась на 5,3+1,64% по сравнению с исходным уровнем (р 0,01). Индекс mRODNAN Skin Score снизился до 11,96+2,92 баллов (р 0,01).

Клинический анализ применения экстракорпоральной фотохимиотерапии в комплексном лечении ограниченной склеродермии

Статистически значимое и значительное повышение экспрессии лимфоцитарной селектиновой молекулы адгезии CD62L на С04+-лимфоцитах у больных ОС, свидетельствовало об активации процессов трансэндотелиальной миграции этих лимфоцитов к клеткам мишеням.

Очевидно, что CD4+ Т-клетки с таким иммунофенотипом обеспечивают пролиферацию аутоагрессивных цитолитических CD8+ Т-лимфоцитов, а также способны трансформировать В-лимфоциты в плазматические клетки что обеспечивается присутствием на В-клетках лиганда для рецептора СD27 -молекулы CD70. В последующем плазматические клетки способны синтезировать в растворимой форме антигенспецифические аутоантитела.

При анализе иммунофенотипа косвенно отражающего степень негативной активации Т-лимфоцитов: СD3+CD8+CD62L+СD27-CD28- в плане обеспечения процессов анергии к презентируемым аутоантигенам было установлено увеличение относительного количества этих клеток у больных ОС, хотя и недостоверное (20,8±3,4% по сравнению с нормой 16,4±2,1%; р 0,05) (табл. 5.2). Из этого следует, что механизмы, ингибирующие Т-клеточную активацию и инициирующие процессы толерантности к презентируемым аутоантигенам при ОС, также повышены, однако они недостаточны для того, чтобы сдерживать процессы активации и дифференцировки.

Таким образом, эффекторные клетки иммунной системы у больных ОС характеризуются с одной стороны выраженным активационным иммунофенотипом, реализующимся через повышенную экспрессию CD27 и CD28 молекул на CD4+ Т-лимфоцитах, а с другой – присутствием антигенопосредованных клеток с толерогенным иммунофенотипом СD3+CD8+CD62L+СD27-CD28-. Выявленные особенности изучаемых биомаркеров иммунной системы при ОС послужили основанием для использования их в качестве мишеней патогенетического воздействия ЭФХТ.

В результате было выявлено, что после ЭФХТ происходит снижение экспрессии ко-активационных маркеров CD27 и CD28 на CD4+ Т-лимфоцитах, что приводит к индукции процессов негативной активации Т-клеточного рецептора и восстановлению механизмов иммунологической толерантности к собственным антигенным структурам (табл. 5.2)

Подтверждением этого служит уменьшение цитолитических свойств CD8 Т-лимфоцитов и увеличение их супрессорных функций за счет еще большего снижения коэкспрессии молекулы CD28 и CD27 на поверхности CD8+-клеток (до лечения ЭФХТ 20,8±3,4%, после лечения ЭФХТ 30,1±5,2%; р 0,05) (табл. 5.2). В результате эти клетки приобретают регуляторный иммунофенотип: СD3+CD8+CD62L+СD27-CD28-, обеспечивающий и поддерживающий периферическую иммунологическую толерантность путем делеции аутореактивных цитолитических лимфоцитов, индуцируя в них процессы апоптоза. Примечательно, что это увеличение не носило статистически значимый характер, тем не менее, различия между экспрессией супрессорных CD8+ Т-лимфоцитов после ЭФХТ и нормой, были статистически значимыми (30,1±5,2% при норме 16,4±2,1; р 0,05) (табл. 5.2).

Таким образом, в ходе исследования было установлено, что количественное определение основных линейных лимфоцитарных антигенов при ОС не имеет существенного прогностического и диагностического значения. Основное значение в формировании локального аутоиммунного процесса при ОС имеет изменение функциональных свойств иммунокомпетентных клеток, играющих центральную роль в поддержании иммунологического гомеостаза. У больных ОС на разных стадиях патологического процесса происходит дисбаланс функциональных свойств этих клеток с преобладанием активационных сигнальных путей за счет повышенной экспрессии ко-активационных молекул CD28, CD27 на CD4+ Т-клетках над сдерживающими – ингибирующими сигналами со стороны супрессорных CD8+-лимфоцитов, которые находятся в терминальной стадии дифференцировки благодаря лишению ко-активационных молекул в присутствии селективной молекулы адгезии CD62L. Это приводит к пролиферации аутореактивного клона цитолитических лимфоцитов и активации гуморальной составляющей адоптивного иммунного ответа.

Следовательно, метод ЭФХТ имеет выраженную патогенетическую направленность при ОС, воздействуя на избыточный синтез ко-активационных молекул, приводящий в последующем к снижению аутоиммунного воспаления и поддержанию длительной и стойкой ремиссии. В отличие от гормональной и иммуносупрессивной лекарственной терапии ЭФХТ не вызывает побочных реакций и осложнений.