Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Общее сведения, эпидемиология 8
1.2. Этиология и патогенез псориаза 9
1.3 Иммунологические изменения при псориазе 17
1.4 Клиника 26
1.5 Лечение 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
2.1. Общая характеристика пациентов, включенных в исследование 37
2.2 Методы исследования 44
2.3 Лабораторные и инструментальные методы исследования 52
2.3.1. Общий клинический анализ крови 52
2.3.2 Биохимический анализ сыворотки крови 52
2.4 Метилирование 53
2.5 Метод статистической обработки данных 56
ГЛАВА 3. Собственное исследование 57
3.1 Метилирование 57
3.2 Биоинформационный подход к выбору лекарственного препарата 62
3.3 Результаты лабораторных исследований 66
3.4 Результаты клинического и психо-эмоционального исследований 74
3.4.1 Изменение индекса PASI 74
3.4.2 Измерение ДИКЖ
3.4.3 Изменение психо-эмоционального статуса 79
3.4.4 Отдаленные результаты терапии 79
Заключение 81
Выводы 87
Список использованных источников 89
- Этиология и патогенез псориаза
- Лабораторные и инструментальные методы исследования
- Метод статистической обработки данных
- Результаты клинического и психо-эмоционального исследований
Этиология и патогенез псориаза
Несмотря на долгую историю изучения псориаза, истинная его причина остается невыясненной до сих пор. При псориазе происходят следующие патологические процессы: «гиперплазия эпидермиса с нарушением дифференцировки корнеоцитов, что сопровождается выраженной воспалительной реакцией в дерме». При этом начинается ускоренный рост клеток дермы и их апаптоз; у здорового человека это происходит медленнее. Данный процесс в свою очередь приводит к утолщению эпидермиса и образованию большого количества чешуек. В эпидермисе возникают пролиферативные и воспалительные изменения. Однако при псориазе поражается не только кожный покров, как считалось ранее, но и внутренние органы, что позволяет говорить о системном поражении псориатическим процессом. Существует множество теорий этиологии псориаза, но ни одна из них полностью не доказана. К основным теориям этиологии псориаза относятся: 1. генетическая (генетические механизмы способности клеток к размножению), 2. вирусная теория (вирусразрешающий фактор), 3. нейрогенная (нейрогуморальный механизм предрасположенности), 4. нарушения обмена липидов, 5. иммунная (антиген-специфический ответ), и другие. Ранее большую популярность приобрела нейрогенная теория, защитниками которой выступали основатели российской дерматологии. В качестве обоснования данной теории приводилось достаточное количество фактов, подтверждающих, что псориаз «впервые возникал у лиц вскоре после психологической травмы». Специальные функциональный неврологические исследования показали значительные нарушения функций центральной и периферической частей нервной системы больных псориазом. Но не смотря на это данную теорию нельзя признать доказанной [10, 51, 77, 88].
Считается, что триггерами псориатического процесса являются эмоциональные стрессы (у 23% пациентов); лекарственные препараты (у 16%); физические травмы (у 43% больных). «Стрессовые реакции способствуют повышению устойчивости организма при любом воздействии и носят защитно-приспособительный характер». В рамках общего адаптационного синдрома, главная роль в течение стрессовых реакций играет активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и возбуждение симпатического отдела нервной системы [2, 92, 93, 94, 95]. Гиперсекреция гормонов, относящихся к медиаторам симпатоадреналовой системы и глюкокортикостероидам, является проявлением общего адаптационного синдрома, что оказывает влияние на энергетическое обеспечение адаптативных реакций [89, 138].
Исследования симпатико-адреналовой системы у пациентов с псориазом выявили значительное снижение ее функциональной активности. Согласно полученным данным, у больных с генерализованными формами, особенно в период обострения, наблюдалось «резкое снижение эскреции адреналина, норадреналина и дофамина с мочой», а также снижение концентрации катехоламинов в крови и коже [13, 26, 89].
Гистохимический анализ показал практически полное отсутствие адреноэргических медиаторов в сосочковом слое дермы у больных псориазом [26, 89]. Ряд исследователей, основываясь на фактах снижения экскреции с мочой 17-кетостероидов, 17-оксикортикостероидов и изменения экскреции стероидных гормонов под влиянием адренокортикотопного гормона, выдвинул гипотезу о постепенном развитии гипокортицизма у пациентов с псориазом [36, 64]. Резервная способность коры надпочечников у больных псориазом сохраняется в начале заболевания, однако вскоре их функционирование снижается. Но необходимо отметить, что стадия истощения общего адаптационного синдрома возникает лишь при действии стрессорных факторов большой интенсивности или длительности, превышающей ресурсы нейроэндокринной системы [80, 154, 155]
Важную роль в понимании механизмов физиологического выхода из состояния стресса играет открытие эндогенных лигандов опиатных рецепторов: эндорфиновых, энкефалиновых и динорфиновых пептидов и установка их связи с гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системой [51, 54, 92]. Основное значение стимуляторов позитивных эмоций, «гормонов удовольствия», проявляющихся в результате успешного прекращения стрессовой ситуации, сводится к тому, что они запускают программы компенсации негативных последствий стрессовой реакции и выхода из нее [83, 96]. Хроническое течение заболевания обусловлено нарушением дифференцировки клеток эпидермиса и способствует постоянному воспалительному процессу, что приводит к распространению процесса на коже и провоцирует висцеральную патологию [13, 138]. Продолжительное наличие клинических проявлений на коже погружает больного в состояние фрустрации, которая относится к самым опасным видам стресса [14, 72, 82, 88]. При клинико-лабораторных исследованиях обнаружено, что низкая дифференциация кератиноцитов в дерме, постоянный воспалительный процесс и поступление из псориатического очага цитокинов IL-1, IL-2, IL-6, TNF- на фоне истощения гипофизарно-надпочечниковой системы позволяет этим интлейкинам провоцировать системные [13, 60, 80, 88]. Параллельно, отмечается, что при начальных стадиях развития псориатического процесса эти цитокины в крови играют саногенную роль, благодаря активации гипофизарно-надпочечниковой системы [64, 94, 98, 108].
Лабораторные и инструментальные методы исследования
В историях болезни регистрировались триггеры, имеющие патогенетическое значение, (то есть, возможные причины дебюта и обострения псориаза, продолжительность заболевания; начало и последующая динамика заболевания; условия труда и быта; пищевой фактор; вредные привычки; связь с наследственностью; перенесенные заболевания и сопутствующие патологии; предыдущая терапия по поводу псориаза и соматической отягощенности; состояние здоровья в момент обращения и в процессе терапии) и результаты клинической и лабораторной диагностики. Подавляющее большинство пациентов поступало с распространенным псориазом в прогрессирующей стадии, что клинически характеризовалось наличием многожественных папулезных элементов (от 5 мм в диаметре), склонных к росту и слиянию эффлоресценций с образованием крупных эритематозно-сквамозных и инфильтративных бляшек. У большинства больных в этой стадии отмечалось наличие резко выраженной изоморфной реакции и периферического венчика роста. Было отмечено, что среди пациентов мужского пола, больше 50% (58 человек) страдали распространенным экссудативным псориазом, в то время как большинство женщин 79 (52,67%) – сочетанной формой распространенного экссудативного псориаза и псориатического артрита. У 37 (35,92%) мужчин выявлен артропатический псориаз, сочетанный с распространенным экссудативным псориазом и у 34 (22,6 7%) женщин распространенный экссудативный псориаз , у 7 (6,8 %) мужчин и 15 (10%) женщин – псориатическая эритродермия, сочетанная с артропатическим псориазом, у 0,97% мужчин и 6,67 % женщин ладонно-подошвенный псориаз; и у 8% женщин – псориатическая эритродермия (рисунок 4). Гендерное распределение форм псориаза При сборе анамнеза и в ходе обследования больных мужчин с псориазом были выявлены наиболее часто диагностируемых сопутствующие заболевания: патологии желудочно-кишечного тракта и гепатобилиарной системы (язвенная болезнь, гастрит, энтероколит, холецистит, гепатиты различной этиологии) диагностированы у 63%; сердечно-сосудистая патология (ИБС, гипертоническая болезнь) диагностирована у 47,6%, заболевания эндокринной системы (сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит, гипотиреоз) выявлены у 8,7%, заболевания дыхательной системы и ЛОР-органов (хронический тонзиллит, бронхиальная астма и др.) отмечены у 7,8 % .
Гендерное распределении соматической отягощенности В то время как среди женщин доля патологии желудочно-кишечного тракта и гепатобилиарной системы, сердечно-сосудистые заболевания составляли 26,0% и 26,7% соответственно. У 10% женщин наблюдалась патология эндокринной системы, у 8%- заболевания органов дыхания (рисунок 5).
В качестве предшествующей терапии 57% пациентов получали метатрексат с разным количеством туров, на фоне которого появились изменения в биохимическом анализе крови. 32% ранее получали ПУВА-терапию, что также отразилось на биохимических показателях. У остальных пациентов (мужчин) изменения данных показателей произошло из-за злоупотребления алкогольными напитками.
Все пациенты были разделены на две группы. Первая группа из 145 человек помимо стандартной терапии (физ. раствор, 10% глюконат кальция, наружная терапия), в качестве гепатопротектора был выбран адеметионин. Вторая группа из 108 человек получала аналогичную стандартную терапию, в качестве гепатопротектора применялся Эссенциале-Н-Форте (фосфолипиды).
Первичное обследование пациентов включало в себя общеклиническое исследование, дерматологический осмотр и оценку PASI, определении биохимических параметров крови, клинических лабораторных показателей крови, общеклиническом исследовании мочи, рентгенологическое исследование. Оценка PASI производилась до и после проведения терапии В клиническое обследование входили сбор жалоб, предъявляемых пациентами, изучение анамнеза с учетом факторов риска развития псориаза (семейная предрасположенность, вредные привычки, характер и особенности питания, прием лекарственных препаратов по поводу терапии сопутствующих заболеваний), длительность течения псориаза и эффективность ранее проводимого лечения, а также продолжительность ремиссии.
Метод статистической обработки данных
На следующем этапе осуществляли ферментативную фрагментацию образцов ДНК. Для этого к каждому образцу БКД добавляли 50 l буфера FMS и встряхивали в течение 1 минуты и центрифугировали в режиме 280g для осаждения раствора на дно плашки. После чего образцы инкубировали в течение 1 часа при температуре 37C.
После этого образцы фрагментированной ДНК подвергали переосаждению, для чего добавляли 100 l буфера PM1, встряхивали в течение 1 минуты, а затем центрифугировали при ускорении 280g для осаждения раствора на дно плашки. Для осаждения ДНК к раствору добавляли 300 l 100% изопропанола, пробы перемешивали и инкубировали при температуре +4C в течение 30 минут, после чего образцы центрифугировали при температуре +4C в режиме 3 000g в течение 30 минут. ДНК растворяли в 46 l буфера RA1. Образцы инкубировали в Illumina Hybridization Oven в течение 1 часа при температуре 48C.
На следующем этапе образцы ДНК гибридизовали с BeadChips. Для этого образцы ДНК денатурировали при температуре 95C в течение 20 минут, а после этого охлаждали при комнатной температуре в течение 30 минут. 400 l буфера PB2 добавляли в BeadChip Hyb Chamber, а затем используя многоканальную пипетку добавляли 15 l ДНК к BeadChip BeadChip Hyb Chamber с образцом ДНК помещали в Illumina Hybridization Oven и инкубировали при температуре 48C в течение 16 часов (но не более 24 часов). После гибридизации чип промывали в XC4 реагенте (предварительно смешивали 330 мл этанола и 20 мл XC4 буфера) и высушивали при комнатной температуре.
После гибридизации проводили окрашивание микрочипов. Для этого чипы погружали в 200 мл буфера PB1 в течение 1 минуты. После этого нагревали Chamber Rack до температуры 44С и помещали в него чип, а затем последовательно добавляли 150 l буфера РА1 – выдерживали в течение 30 секунд и повторяли 5 раз, 450 l буфера XC1 и инкубировали в течение 10 минут, 450 l буфера XC2 и инкубировали в течение 10 минут, 200 l буфера TEM и инкубировали в течение 15 минут, 450 l 95% формамида /1 мМ ЭДТА и инкубировали в течение 1 минуты, 450 l буфера XC3 и инкубировали в течение 1 минуты. Для завершения окрашивания в резервуар с чипом последовательно добавляли 250 l буфера STM и инкубировали в течение 10 минут, 450 l буфера XC3 и инкубировали в течение 1 минуты, 250 l буфера ATM и инкубировали в течение 10 минут, 450 l буфера XC3 и инкубировали в течение 1 минуты, 250 l буфера STM и инкубировали в течение 10 минут, 450 l буфера XC3 и инкубировали в течение 1 минуты, 250 l буфера ATM и инкубировали в течение 10 минут, 450 l буфера XC3 и инкубировали в течение 1 минуты, 250 l буфера STM и инкубировали в течение 10 минут, 450 l буфера XC3 и инкубировали в течение 1 минуты. После завершения окрашивания чипы промывали в 310 ml буфера PB1 и 310 ml раствора XC4. Чип высушивали при пониженном давлении 675 мм. рт. ст. в течение 50–55 минут.
На заключительном этапе чипы сканировали при помощи HiScanSQ System (Illumina, USA). Полученные изображения анализировали с помощью биоинформатических методов. Для выделения сигналов метилирования ДНК из сканированных чипов использовали программное обеспечение GenomeStudio (версия 2011.1; модель метилирования версия 1.9.0, Illumina Inc.).
Данные метилирования были получены из сырых сигналов без выделения фона или нормализации данных. Наблюдаемые значения – это уровень метилирования для каждого CpG, которые варьируются от 0 (неметилированные, U) до 1 (полное метилирование, М) на непрерывной шкале и рассчитывали интенсивность аллелей со значениями М и U как показатель сигнала флюоресценции по формуле:
Результаты клинического и психо-эмоционального исследований
В своей работе мы провели анализ статуса метилирования генов Т-лимфоцитов у здоровых индивидуумов и больных псориазом до начала терапии. C помощью микрочипов Illumina был проведен анализ статуса метилирования в геномах Т-клеток полученных от 10 больных псориазом и 11 здоровых волонтеров.
В результате были выявлены локусы, дифференциально метилированные в CD3+ клетках больных псориазом и здоровых индивидуумах. Четкое разделение образцов на две группы – больных псориазом и здоровых людей, позволяет предположить, что по уровню метилирования генов FRK, JAK1, AKAP7, DYRK1A, PRKCA, RPS6KA2 в CD3+ клетках можно определять предрасположенность к псориазу и, вероятно, проводить раннюю диагностику псориаза.
Проведя сравнительный анализ изучаемых генов по уровню их метилирования можно отметить, что в CD3+ клетках больных псориазом людей многие из них метилированны в большей степени сравнению со здоровыми индивидуумами. Однако у гена FRK уровень метилирования, почти в два раза, выше в CD3+ клетках здоровых индивидуумах по сравнению с больными псориазом до лечения, т.е. у больных он наиболее деметилирован и, возможно, наиболее активно транскрибируется. Данный ген относится к группе киназ типа TYR и играет роль в подавлении роста и во время G1 S фаз клеточного цикла и активная его транскрипция во время псориатического процесса вполне логична, так как при псориазе происходит гиперпролиферация кератиноцитов.
С учетом полученных результатов анализа метилирования ДНК, подбор патогенетической терапии требовал выбора безопасного эффективного препарата, регулирующего процессы метилирования. С этой целью нами был проанализирован список малых молекул, которые достоверно регулируют процесс метилировани при псориазе. Было выявлено 437 малых молекул достоверно регулирующих процесс метилирования при псориазе. Среди полученных результатов также были отобраны молекулы с наибольшим количеством ссылок и ранее не используемые в терапии псориаза. Предъявляемым условиям соответствовали только три малые молекулы, это NNK (4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone), Cd2+ (Cadmium, isotope of mass 115) и S-adenosylmethionine (Heptral). Однако безопасным из них являлся лишь S-adenosylmethionine, в связи с чем было принято решение провести изучение его терапевтического действия на псориаз.
Пациенты, принимавшие участие в исследовании были разделены на две группы. Основной группе проводилась терапия препаратом Гептрал (S-adenosylmethionine), контрольная группа получала терапию препаратом Эссенциале-Н-Форте, также относящимся к гепатопротекторам. В обеих группах проводилось измерение уровня АЛТ, АСТ и общего билирубина до и после терапии. У пациентов, получавших Гептрал, уровень АЛТ снизился на 36% по сравнению с первоначальными повышенными значениями, в то время как в группе пациентов, получавших гепатопротекторную терапию Эссенциале Н Форте, значения АЛТ снизились лишь на 22%. Содержание АСТ у пациентов, принимавших Гептрал, уменьшилось на 11%, приблизившись к верхней границе нормы, у пациентов, получавших Эссенциале Н Форте, уровень АСТ снизился лишь на 5%. Содержание общего билирубина в крови в обеих группах снизилось до нормальных значений. Оценка клинических показателей крови показала, что до начала терапии гематологические показатели были в пределах нормы, за исключением единичных пациентов, у которых наблюдалось снижение содержания гемоглобина, количества эритроцитов, небольшой лейкоцитоз и повышение СОЭ.
Необходимо отметить, что в результате проведенной гепатопротекторной терапии улучшились не только биохимические показатели крови, но и наблюдался значительный положительный эффект в отношении кожного процесса. Оценка степени поражения кожных покровов проводилась измерением индекса PASI. Средний балл индекса PASI до начала терапии в группе, принимавшей Гептрал, составлял 29,6 балла, а в группе пациентов, получавших Эссенциале Н Форте- 30,5 балла. После проведенной терапии индекс PASI в обеих группах снизился до 7,1 и 10,1 балла, соответственно.
Таким образом, в группе пациентов, получавших Гептрал, индекс PASI уменьшился в 4,2 раза, в то время как у пациентов, принимавших Эссенциале Н Форте, - лишь в 3 раза.
Также нами была проведена оценка психо-эмоционального статуса пациентов с псориазом до и после проведенной терапии с использованием дерматологического индекса качества жизни и теста Спилберга. Средний балл качества жизни до начала терапии в группе, принимавшей Гептрал, составлял 25,6 балла, а в группе пациентов, получавших Эссенциале Н Форте- 26,1 балла. После проведенной терапии ДИКЖ в обеих группах снизился до 7,2 и 12,8 балла, соответственно.
Проведенное исследование по тесту Спилберга для определения личностной тревоги пациентов показало высокий уровень тревожности у пациентов обеих групп. После применение курса адеметионина отмечается значительное снижения уровня тревожности, улучшение общего эмоционального состояния и самочувствия, тогда как в группе получавших Эссенциале изменения были незначительными.
Динамическое наблюдение за пациентами обеих групп в течение года показало, что 18,6% пациентов в первой группе вообще не имело обострений, у 66,9% пациентов обострение наступило через 6 и более месяцев после окончания терапии, тогда как во второй группе 67,6% пациентов обратились с рецидивом через 6 и более месяцев.