Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. История трансплантации костного мозга и изучения реакции «трансплантат против хозяина» 12
1.2. Патогенез реакции «трансплантат против хозяина»
1.2.1. Условия и факторы риска возникновения реакции «трансплантат против хозяина» 14
1.2.2. Иммунология и патофизиология реакции «трансплантат против хозяина» 16
1.2.3. Роль вирусных инфекций в развитии реакции «трансплантат против хозяина» 21
1.2.4. Иммунопатологические процессы в коже при реакции «трансплантат против хозяина»
1.3. Клиническая картина острой реакции «трансплантат против хозяина» 24
1.4. Морфологическая диагностика кожной формы реакции «трансплантат против хозяина» 26
Глава 2. Материал и методы исследования 32
2.1. Материал исследования 32
2.2. Методы клинического исследования 33
2.3. Гистологические методы исследования 33
2.4. Иммуногистохимические методы исследования 34
2.5. Молекулярно-биологические методы исследования 39
2.6. Статистический анализ 41
Глава 3. Результаты собственных исследований 42
3.1. Клиническая характеристика исследуемых групп больных 42
3.2. Результаты морфологической оценки биопсий кожи пациентов групп исследования .48
3.3. Результаты оценки популяционного состава воспалительного инфильтрата в биопсиях кожи пациентов групп исследования 54
3.4. Результаты молекулярно-биологического исследования биоптатов кожи пациентов группы РТПХ 64
Заключение 66
Перспективы дальнейшей разработки темы 76
Выводы 77
Рекомендации 78
Список условных сокращений 79
Список литературы
- Патогенез реакции «трансплантат против хозяина»
- Иммунопатологические процессы в коже при реакции «трансплантат против хозяина»
- Иммуногистохимические методы исследования
- Результаты молекулярно-биологического исследования биоптатов кожи пациентов группы РТПХ
Введение к работе
Актуальность исследования. Трансплантация костного мозга (ТКМ) — современный высокотехнологичный метод лечения гематологических и онкологических заболеваний. По данным Всемирной ассоциации доноров костного мозга ежегодно в мире осуществляется до 150 000 ТКМ, значительная часть которых является аллогенными. Из 50 417 трансплантаций, выполненных в 71 стране мира за один календарный год, 48% были произведены в Европе, 36% в Америке, 14% в странах Азии; 28 901 (57%) ТКМ были аутологичными и 21 516 (43%) — аллогенными. Среди аллогенных ТКМ 11 928 были выполнены от родственных доноров и 9588 — от неродственных. Основными показаниями к ТКМ были лимфомы (55%), лейкозы (34%), солидные опухоли (6%). По имеющимся отчетным данным за период с 2006 по 2014 год, суммарное число проведенных трансплантаций костного мозга составило 1 миллион [Gratwohl A., Baldomero H., Aljurf M., 2010].
Применение метода ТКМ ограничено возможными осложнениями, возникновение которых имеет высокое предиктивное значение. Среди этих осложнений половину случаев составляет реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [Jacobsohn D.A., Vogelsang G., 2007]. Под термином «реакция “трансплантат против хозяина”» понимают патологический процесс в организме реципиента после трансплантации иммунокомпетентных тканей, обусловленный иммунологической реакцией донорской ткани против тканей реципиента. Смертность, связанная с РТПХ, достигает 80% [Marra D.E., Mckee P. H., Nqhiem P., 2007]. РТПХ протекает с поражением кожи и слизистых оболочек, ряда внутренних органов (легких, желудочно-кишечного тракта, печени) [Афанасьев Б.В., Зубаровская Л. С., 2002]. Характерное поражение кожи после ТКМ является одним из первых признаков РТПХ. Диагностика кожной формы РТПХ, а также своевременное лечение данного осложнения ТКМ являются крайне актуальными задачами для специалистов в области дерматовенерологии, патологической анатомии, гематологии.
В послеоперационном периоде пациенты, перенесшие аллоТКМ, получают цитостатические, антибактериальные, противовирусные и антимикотиче ские препараты, что связано с высоким риском развития токсикодермии [Byun H.J.,
Yang J. I., Kim B. K., 2011]. Клинически высыпания токсико-аллергической природы трудно дифференцировать с острой РТПХ, поэтому при появлении сыпи у посттрансплантационных больных выполняется диагностическая биопсия кожи. При патоморфологическом исследовании оценивают изменения эпидермиса, степень повреждения дермо-эпидермального соединения, характер, расположение и клеточный состав воспалительного инфильтрата в дерме. Данные исследований, посвященных изучению специфических па-томорфологических признаков кожной формы РТПХ, нередко неоднозначны [Zhou Y., Barnett M. J., Rivers J. K., 2000; Ziemer M., Janin A., 2014]. В мировой клинической практике гистологическое исследование кожных биоптатов при подозрении на РТПХ считается необходимым и является наиболее информативным методом верификации диагноза.
Стертая клиническая картина кожной формы острой РТПХ и одновременное влияние фармакологических препаратов на организм реципиента усложняют дифференциальную диагностику кожных высыпаний в раннем посттрансплантационном периоде. Отсутствие высокочувствительных и специфичных морфологических маркеров РТПХ затрудняет верификацию на начальном этапе и может приводить к увеличению частоты летальных исходов у пациентов, перенесших аллогенную ТКМ.
Существуют сведения о значительной роли посттрансплантационной реактивации герпес-вирусных инфекций в патогенезе РТПХ, что обусловливает необходимость дифференциальной диагностики кожных высыпаний у пациентов, перенесших аллоТКМ не только с токсико-аллергическими реакциями, но и с вирусными поражениями кожи [Appleton A.L., Peiris J. S., Taylor C. E., 1995; de Pagter P. J., Visscher H., de Vo s M., Bierings M., 2013].
Степень разработанности темы
Вопросам изучения дифференциальной диагностики и патогенеза кожной формы реакции «трансплантат против хозяина» посвящены исследования, начало которым было положено в конце XX — начале XXI в. Среди этих исследований наиболее известны работы зарубежных авторов J. Ferrara, P. J. de Pagter, D. E. Marra, D. A. Jacobson.
Исследования морфологических изменений в коже при острой РТПХ позволили с большей достоверностью проводить дифференциальную диагностику РТПХ с воспалительными дерматозами, имеющими сходные клинические проявления. Иммуногистохимическое исследование клеточных популяций в биоптатах кожи больных РТПХ также способствовало более точной диагностике заболевания.
Вместе с тем, рутинные методы исследований, применяемые в практике дерматовенеролога и патологоанатома, не всегда достаточны для дифференциальной диагностики кожной формы острой РТПХ и токсико-аллергических реакций. Это определяет актуальность дальнейшего поиска высокоинформативных дифференциально-диагностических подходов, что соответствует задачам современной дерматологии, патологической анатомии. Согласно GLP («Good laboratory practice» — принципы надлежащей лабораторной практики), наибольшей информативностью при оценке дифференциально-диагностических подходов обладают показатели чувствительности и специфичности метода и отдельных маркеров, в частности.
Цель исследования: изучить клинико-морфологические проявления кожной формы острой реакции «трансплантат против хозяина» для проведения дифференциальной диагностики.
Задачи исследования:
-
Изучить клинические проявления кожной формы острой реакции «трансплантат против хозяина».
-
Определить факторы риска развития острой формы реакции «трансплантат против хозяина» с поражением кожи.
-
Оценить диагностическую информативность патоморфологических изменений в биоптатах кожи у больных с кожной формой острой реакции «трансплантат против хозяина».
-
Провести сравнительный анализ клеточных популяций в структуре воспалительного инфильтрата в коже больных с острой реакцией «трансплантат против хозяина».
-
Исследовать прогностическую значимость инфицирования бета-гер-песвирусами у пациентов с кожной формой острой реакции «трансплантат против хозяина».
Научная новизна
Установлено, что информативными клиническими признаками, на основании которых можно дифференцировать больных кожной формой острой РТПХ, явились распространенность высыпаний и температурная реакция, которую в 3,4 раза чаще наблюдали у пациентов группы РТПХ.
Выявлено, что морфологическими маркерами дифференциальной диагностики между кожной формой РТПХ и токсикодермией, обладающими наибольшей чувствительностью, являются наличие некротизированных кератиноцитов с сателлитными клетками, вакуольная дистрофия эпидермо-
– 6 –
цитов. Наибольшей чувствительностью обладают такие признаки, как наличие апоптоза кератиноцитов в придатках кожи и отсутствие эозинофильных гранулоцитов в воспалительном дермальном инфильтрате.
Показано, что количество CD1a, FOXP3 и CD8-позитивных клеток снижено в биоптатах кожи пациентов с острой РТПХ по сравнению с биоптатами пациентов группы токсикодермии.
Продемонстрировано прогностическое значение HHV6 инфекции у пациентов с РТПХ. Установлено, что летальность, не связанная с рецидивом основного заболевания, в 2,7 раза больше среди пациентов с HHV6-позитив-ным статусом.
Теоретическая и практическая значимость
В ходе патологоанатомического исследования биоптатов кожи установлены закономерности распределения лимфоцитов, клеток макрофагального ряда в эпидермисе и дерме больных острой РТПХ и токсико-аллергическими реакциями, а также информативность признаков типовых патологических процессов в коже пациентов с острой РТПХ.
При оценке клинических данных выявлено, что для пациентов с РТПХ характерны распространенные кожные высыпания, сопровождающиеся температурной реакцией. Установлено, что неродственная ТКМ является фактором риска развития острой РТПХ.
Оценка наличия вакуольной дистрофии кератиноцитов, наличия апоптоза, наличия эозинофильных гранулоцитов при патоморфологическом исследовании биоптатов кожи позволяет провести дифференциальную диагностику острой РТПХ. Научно обоснована необходимость выявления клеточных популяций с использованием иммуногистохимического метода исследования для диагностики острой РТПХ. Установлено, что количество CD1a+, CD8+ клеток и отношение количества Т-регуляторных лимфоцитов к общему числу Т-лимфоцитов необходимо учитывать в дифференциальной диагностике кожной формы острой РТПХ и токсико-аллергических реакций.
Высокая прогностическая значимость HHV-6 инфекции позволяет рекомендовать выполнение молекулярно-генетического исследования для выявления вирусной ДНК в биоптатах кожи пациентов с острой РТПХ.
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого клинического исследования. Использо-
вали клинические, морфологические, статистические методы исследования. Теоретической основой послужили публикации отечественных и зарубежных авторов. Работа выполнена в соответствии с принципами доказательной медицины (согласно критериям GLP) с использованием современных методов исследования и обработки данных.
Положения, выносимые на защиту
-
В клинической картине больных с острой реакцией «трансплантат против хозяина» с поражением кожи доминируют распространенные высыпания, сопровождающиеся температурной реакцией. Ведущим фактором риска развития острой реакции «трансплантат против хозяина» является неродственная трансплантация костного мозга.
-
Для острой реакции «трансплантат против хозяина» характерны такие морфологические изменения в биопсийном материале кожи, как вакуольная дистрофия, апоптоз кератиноцитов в эпителии придатков кожи, отсутствие эозинофильных лейкоцитов в воспалительном инфильтрате, некроз эпидер-моцитов с сателлитными клетками, абсолютное и относительное снижение количества FOXP3-позитивных клеток, количества клеток Лангерганса, увеличение количества CD8-позитивных клеток.
-
Значимым прогностическим признаком в течении посттрансплантационного периода является обнаружение ДНК вируса герпеса человека 6-го типа в биоптатах кожи пациентов с острой реакцией «трансплантат против хозяина».
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов обусловлена репрезентативностью и достаточностью выборки пациентов, включенных в исследование, объемом проанализированного материала, высокой информативностью методик, адекватностью методов исследования, высокой валидностью результатов. Методические подходы, использованные в исследовании, корректны и современны. Для морфологического исследования биопсийного материала использовали сертифицированное, проверенное оборудование.
Результаты и материалы исследования доложены и обсуждены на 21-м, 22-м международных конгрессах Европейской ассоциации дерматологии и венерологии (г. Прага, 2012, г. Стамбул, 2013), 10-м международном симпозиуме Европейской ассоциации дерматологии и венерологии (г. Краков, 2013), XV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2012),
– 8 –
Всероссийской конференции «Студенческая наука — 2013» (Санкт-Петербург, 2013), заседании городского общества патологоанатомов Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2015).
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Полученные результаты и рекомендации успешно использованы в лечебно-диагностической и учебной работе кафедры и клиники научно-исследовательского Института детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» Минздрава РФ.
Личное участие автора в получении результатов
В диссертации представлены результаты исследований, выполненных самим автором или под его непосредственным руководством. Личный вклад автора состоит в постановке задач исследования, в сборе материала, участии в подготовке и проведении морфологического исследования на всех этапах, в обработке, анализе, обобщении полученных результатов и формулировке выводов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 94 страницах, содержит 28 рисунков и 4 таблицы. Библиографический список включает 112 литературных источников, из которых 19 отечественных и 93 иностранных авторов.
Патогенез реакции «трансплантат против хозяина»
Как острая, так и хроническая РТПХ при аллогенной и сингенной (значительно реже аутологичной) ТКМ происходят в результате активации донорских Т-лимфоцитов в ответ на присутствие чужеродных для клеток донора тканей хозяина. Иммунологический механизм развития РТПХ при различных видах ТКМ неодинаков. Иммунный ответ при острой РТПХ является результатом активации зрелых донорских аллореактивных Т-лимфоцитов в организме реципиента, в то время как сингенная РТПХ происходит в результате активации аутореактивных донорских Т-лимфоцитов: лимфоциты проходят процесс созревания в организме реципиента, избегая необходимый этап негативной селекции в тимусе [17]. Хроническая РТПХ обеспечивается обоими описанными механизмами [64].
Сегодня патофизиология острой РТПХ рассматривается как трёхфазный феномен [44]. Первая фаза — активация антиген-представляющих клеток (АПК) реципиента. АПК в норме постоянно презентируют на своей поверхности все антигены, характерные для данного вида тканей [1]. Однако в результате значительного повреждения тканей в ходе предшествующей химиотерапии, лучевой терапии, инфекционных процессов и кондиционирования АПК начинают представлять ненормальные, частично разрушенные и перестроенные антигены. Кроме того, вследствие повреждения клетки реципиента продуцируют «сигналы опасности» — такие как фактор некроза опухоли альфа (TNF) и другие цитокины, которые ещё более стимулируют АПК к презентации перестроенных антигенов. Показано, что рост количества рецепторов к TNF в первую неделю после ТКМ значительно повышает риск развития РТПХ.
Вторая фаза развития острой РТПХ заключается в активации Т-клеток донора. АПК донора и реципиента, а также цитокины «опасности» запускают дифференцировку и последующую активацию донорских Т-лимфоцитов — как CD4+, так и CD8+. Активация Т-лимфоцитов обеспечивает запуск каскада провоспалительных цитокинов, в частности интерлейкина-2 (IL-2). Под влиянием IL-2 аллореактивные донорские Т-лимфоциты дифференцируются в эффекторные клетки. Т-лимфоциты, находящиеся под влиянием соответствующей костимуляции и необходимых провоспалительных сигналов (IL-1,2 и IF-), приобретают фенотип T-хелперов 1-го типа (Th1). Ранее существовало мнение, что именно они играют основную роль в патогенезе острой РТПХ [24].
Открытие в 2007 году Th17 клеток (продуцирующих IL-17) изменило взгляд на патогенез РТПХ. По новым данным, основную роль играет не изолированная функция Th1 или Th17 клеток, а дисбаланс в системе Th1/Th17 (относительно большое количество Th1 и малое — Th17). Этот дисбаланс прямо связан с риском развития РТПХ, а также коррелирует с тяжестью клинических проявлений [99]. Обращает на себя внимание, что при развитии изолированной кожной формы оРТПХ соотношение Th1 и Th17 клеток достоверно не изменяется [34].
Помимо Th1 лимфоцитов, существуют также Th2 антиген-специфические супрессорные клетки: ими становятся Т-лимфоциты, которые отвечают на стимуляцию интерлейкинами 4, 5, 10, 13. Th2-подобные клетки могут вызывать активацию поликлональных В-лимфоцитов, которая более характерна для хронической РТПХ [85].
В целом, направление и механизмы активации донорских Т-лимфоцитов регулируются генами комплекса гистосовместимости (MHC) [24]. У человека MHC представляет собой совокупность генов, расположенных на коротком плече 6-й хромосомы, которая иначе обозначается как HLA (человеческие лейкоцитарные антигены). Различают 3 класса HLA. При наличии антигенного несоответствия донора и реципиента в системах HLA I класса происходит преимущественная дифференцировка донорских лимфоцитов в CD8+ T-клетки, при несоответствии в HLA II класса — в CD4+ T-клетки. Гены так называемых HLA III класса расположены между участками, занятыми генами HLA I и II классов. Соответствующие им белки кодируют компоненты комплемента и цитокины семейства TNF. В отличие от HLA I и II классов, эти продукты не являются мембраносвязанными, не участвуют в презентации антигенов, но играют важную роль в цитокиновых реакциях. При HLA идентичной трансплантации реакция несоответствия может произойти в системе минорных HLA и также запустить процесс активации и дифференцировки лимфоцитов [12]. Активация Т-лимфоцитов инициирует «цитокиновый шторм», включающий продукцию интерлейкинов 2, 3, 4, IF-, TNF и др. Эти медиаторы активируют рецепторы лимфоцитов и макрофагов, которые, в свою очередь, атакуют ткани и хозяина, и донора [62]. Третья фаза развития острой РТПХ — эффекторная и представляет собой повреждение тканей хозяина посредством гуморальных факторов — IF-, TNF, IL-2, а также цитотоксических натуральных киллеров (NK) и CD8+ клеток. Антигены реципиента, представленные молекулами MHC, являются иммуногенными для донорских лимфоцитов, но наиболее сильная иммунная реакция развивается в отношении только некоторых из них — клеток базального слоя эпидермиса, волосяных луковиц, крипт тонкой кишки и гепатоцитов. Именно они становятся мишенями для NK-клеток. Отмечено, что NK-клетки повреждают ткани тонкой кишки и кожи с помощью цитотоксических молекул (перфорины, гранзим Б и др.), в то время как разрушительное действие, оказываемое на гепатоциты/эпителий протоков, осуществляется путем Fas-Fas лигандного взаимодействия. NK поражают только те клетки-мишени, которые не экспрессируют нормальные антигены на своей поверхности — поврежденные собственные и чужеродные антигены уничтожаются NK клетками вне зависимости от совпадения по системе MHC.
Помимо клеточного эффекторного звена, существует и цитокиновое звено, представленное IF-, TNF, IL-2, а также липополисахаридами (молекулярные составляющие бактериальных клеток, ещё более стимулируют выработку провоспалительных цитокинов) [14]. Известно, что IF- повышает экспрессию хемокиновых рецепторов, а также усиливает чувствительность макрофагов и моноцитов к липополисахаридам [61]. Важно отметить, что ткани реципиента не только стимулируют донорские лимфоциты, но и активно способствуют их пролиферации: в процессе приживления трансплантата донорские Т-лимфоциты взаимодействуют с дендритными клетками реципиента, что на фоне ко-стимуляции через toll-подобные рецепторы продуктами бактериального и тканевого распада приводит к формированию клонов аллореактивных Т-цитотоксических лимфоцитов [60]. В последние годы выявлена особая роль Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ CD25+ FOXP3, которые являются регуляторными Т-лимфоцитами (Тreg) и вырабатывают иммуносупрессивные цитокины, такие как IL-10, трансформирующий фактор роста [8, 9, 18]. После обнаружения FOXP3-позитивных клеток в коже больных с острой и хронической РТПХ появилась гипотеза о связи количества этих клеток с риском возникновения и прогнозом РТПХ [109]. Имеются данные о том, что в биоптатах кожи у пациентов с РТПХ, в сравнении с нормальной кожей, регистрируется значимое снижение Тreg лимфоцитов, и чем это количество меньше, тем тяжелее течение РТПХ. В то же время, пациенты с большим количеством Тreg значительно лучше поддаются терапии, направленной на купирование РТПХ [109].
Следует отметить, что продуцируемый Th1-клетками IL-2 не только оказывает провоспалительное действие при РТПХ и является мишенью терапии при профилактике РТПХ (такролимус, циклоспорин), но и оказывает решающее активирующее влияние на функцию Тreg (кластер дифференцировки CD25 соответствует рецептору IL-2) [4, 5]. В настоящее время проводятся исследования по использованию IL-2 в качестве препарата для подавления развития и лечения РТПХ [56, 69].
Иммунопатологические процессы в коже при реакции «трансплантат против хозяина»
Объектами морфологического исследования были пораженные участки кожи, иссеченные с диагностической целью (биопсии). Биопсийный материал поступал в лабораторию в виде парафиновых блоков. Срезы приготовляли толщиной 3–4 мкм, используя микротом ротационный Thermo Scientific Microm HM 355S (США, регистрационное удостоверение № РОСС DE.MH08.H16336). С каждого парафинового блока делали 3–4 препарата для гистологических окрасок, на каждом препарате размещали 2–3 среза. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином в лаборатории иммуногистохимических исследований ГУЗ «Ленинградское областное патологоанатомическое бюро».
В гистологических препаратах кожных биоптатов, окрашенных гематоксилином и эозином, оценивали наличие или отсутствие вакуольной дистрофии клеток покровного эпителия, спонгиоза, паракератоза, эозинофильных гранулоцитов в клеточном инфильтрате в дерме, апоптоз клеток эпителия придатков, а также наличие и количество некротизированных кератиноцитов с сателлитными клетками (Satellite cell necrosis [SCN]) — групп клеток, состоящих из апоптотически измененного кератиноцита в окружении не менее чем двух интраэпидермальных лимфоцитов, — в эпидермисе в 10 полях зрения (об. 40 ок. 10 20 мм).
В лаборатории иммуногистохимических исследований ГУЗ «Ленинградское областное патологоанатомическое бюро» приготовленные гистологические срезы толщиной 4 мкм наносили на чистые предметные стекла. Для предотвращения отслаивания и повреждения срезов во время тепловой обработки и серии промываний поверхность вымытых предметных стекол обрабатывали L-полилизином (молекулярная масса 150 кДа, 1 мг/мл дистиллированной воды) и высушивали. Препараты высушивали при 37 С в течение 18 часов или при 56-60 С в течение 30 мин. Во избежание повреждения антигенов срезы держали при повышенной температуре не более указанного времени.
Иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов ткани состояло из следующих этапов:
Эта стадия обеспечивала специфичность гистохимической реакции с хромогеном, используемым для выявления меченного пероксидазой комплекса антител в месте локализации антигена. Использовался раствор перекиси водорода в метаноле, истощающий активность эндогенных тканевых пероксидаз и каталаз, чтобы реакция с хромогеном выявляла только пероксидазную метку комплекса антител. 2. Демаскирование антигенов
Тепловую обработку срезов проводили в бытовой кастрюле-скороварке в течение 4 мин при температуре 105 С в буферах с pH 6 и pH 9, в зависимости от применяемого антитела.
Неспецифическое окрашивание уменьшали предварительной обработкой срезов неиммунной сывороткой животного. Сыворотка блокировала большинство участков неспецифического связывания, не мешая специфическому взаимодействию первичных антител с антигеном. Перед нанесением первичных антител избыток сыворотки удаляли, срезы не промывали.
Для получения оптимального окрашивания и предотвращения неспецифического связывания с тканевыми структурами первичных антител использовали концентрации антител, выбранные при предварительном титровании. Рабочие оптимальные разведения, при которых достигалось сильное специфическое окрашивание при минимальном окрашивании фона, определяли для каждого антитела отдельно в серии пробных титрований.
Для предотвращения испарения антител экспозицию проводили в атмосфере влажной камеры. Инкубацию с первичными антителами проводили при температуре 4 С в течение 18 часов.
Для предотвращения образования комплексов антиген-антитело, усиливающих фоновое окрашивание, перед инкубацией в новом иммунном слое удаляли все следы не связавшихся антител. Это достигалось тщательным промыванием срезов между инкубациями в буферных растворах с помощью лабораторного шейкера. 7. Визуализация результатов реакции с помощью хромогена
Комплекс антиген-антитело выявлялся гистохимической реакцией, включающей хромоген, которым в исследовании служил 3,3 -диаминобен зидинтетрахлорид (ДАБ). Во время инкубации срезов с комплексом стрептавидин/биотин/пероксидаза хрена (sABC) молекулы пероксидазы связывались с комплексом антиген-антитело посредством биотинилированных вторичных антител, после чего срезы инкубировали в свежеприготовленном растворе ДАБ и перекиси водорода в буфере. При этом молекулы пероксидазы катализировали разложение перекиси водорода до воды и кислорода. Кислород окислял ДАБ, который осаждался в местах локализации антигена в виде гранул коричневого цвета.
Иммуногистохимические методы исследования
На момент проведения аллоТКМ 52% больных находились в клинико-гематологической ремиссии, 48% пациентов — в рецидиве основного заболевания. Аблативный режим кондиционирования был использован в 48% случаев, в 52% случаев режим трансплантации был неаблативным. У 30% пациентов аллоТКМ была родственной, 70% больных имели неродственного донора, что послужило фактором риска развития острой РТПХ.
У 46% больных острая РТПХ развилась в течение первых 30 дней посттрансплантационного периода и считалась ранней, у 54% — в период с +31 по +100 день. У 52% больных развилась острая РТПХ 1–2-й степени, 48% пациентов страдали РТПХ 3–4-й степени тяжести.
Из всех пациентов 72% больных имели изолированное поражение кожи и у 28% пациентов было выявлено поражение внутренних органов, связанное с РТПХ: 18% страдали острой РТПХ с поражением желудочно-кишечного тракта и 10% — острой РТПХ с поражением печени (Рисунок 7).
По результатам оценки исхода заболевания были получены следующие данные: по окончании госпитализации 48% пациентов продолжали болеть, 32% выписаны с улучшением и 20% умерли (Рисунок 8).
При исследовании гистологических препаратов кожи пациентов обеих групп были выявлены следующие патологические изменения. В эпидермисе обнаруживались явления межклеточного отека (спонгиоза). Преимущественно базальный слой кератиноцитов был подвержен вакуольной дистрофии. В роговом слое были заметны явления паракератоза. Дермо-эпидермальная линия была сглажена, в верхних слоях дермы определялся воспалительный лимфогистиоцитарный инфильтрат, имеющий признаки эпидермотропизма. Среди клеток инфильтрата встречались эозинофильные гранулоциты. Воспалительный инфильтрат мог также располагаться перифолликулярно. В эпидермисе и эпителии фолликулов встречались ярко-эозинофильные апоптотические тельца кератиноцитов, иногда в окружении интраэпидермальных лимфоцитов (SCN).
В группе РТПХ достоверно чаще обнаруживался апоптоз кератиноцитов в эпителии придатков кожи (66% и 10% соответственно, p 0,002) — Рисунок 9.
Эозинофильные гранулоциты были обнаружены в дермальном инфильтрате всех пациентов группы сравнения (100%) и в дермальном инфильтрате только 6 пациентов группы РТПХ (12%), p 0,001. Вакуольная дистрофия эпидермоцитов наблюдалась чаще в группе РТПХ (72%), чем в группе токсикодермии (40%), р = 0,05 (Рисунок 10). Рисунок 10 — Морфологические проявления вакуольной дистрофии при РТПХ (об. 40х ок. 10х, окраска гематоксилином и эозином)
SCN обнаруживали во всех препаратах группы РТПХ и в 70% препаратов группы токсикодермии (p 0,05) — Рисунок 11. Спонгиоз в эпидермисе пациентов с РТПХ обнаруживался реже, чем среди больных токсикодермией — 64% и 80% соответственно, однако настоящая тенденция не продемонстрировала должной достоверности (р 0,05). Явления паракератоза встречались чаще у пациентов группы токсикодермии (30%), чем среди пациентов с РТПХ (12%), однако при статистическом анализе данная тенденция также не показала должной достоверности (p 0,05) — Рисунок 12.
Сводные данные, полученные при оценке встречаемости морфологических признаков в биоптатах кожи пациентов группы РТПХ и группы токсикодермии, представлены в Таблице 2.
Для качественных патоморфологических критериев были подсчитаны значения чувствительности (Se) и специфичности (Sp) в группе РТПХ (Таблица 3). По результатам анализа было выявлено, что для признака вакуольной дистрофии Se = 0,72, Sp = 0,6, для апоптоза кератиноцитов в придатках кожи Se = 0,66, Sp = 0,9, отсутствие эозинофильных гранулоцитов в воспалительном инфильтрате обладает чувствительностью, равной 0,88, и специфичностью 1,0. Для признака SCN была определена максимальная чувствительность (Se = 1,0) и специфичность 0,3.
В настоящем исследовании выявлено, что морфологическими маркерами дифференциальной диагностики между кожной формой РТПХ и токсикодермией, обладающими наибольшей чувствительностью, являются SCN, вакуольная дистрофия эпидермоцитов. Наибольшей чувствительностью обладают такие признаки как наличие апоптоза кератиноцитов в придатках кожи и отсутствие эозинофильных гранулоцитов в воспалительном дермальном инфильтрате. 3.3. Результаты оценки популяционного состава воспалительного инфильтрата в биопсиях кожи пациентов групп исследования
При оценке популяционного состава инфильтрата были получены данные, представленные в Таблице 4.
По результатам иммуногистохимического исследования клеток воспалительного инфильтрата выявлено, что количество CD3+ клеток в группе токсикодермии достоверно превышает данный показатель в группе РТПХ (805,0 ± 400,0 и 160,8 ± 86,7 соответственно), p 0,001. Среднее количество CD1а+ клеток в эпидермисе у пациентов с РТПХ соответствовало 41,4 ± 32,2 — Рисунок 13. Рисунок 13 — CDla+ клетки при РТПХ (об. 20х ок. 10х, иммуногистохимическая реакция)
Среди пациентов, больных токсикодермией, количество CD1a+ клеток было достоверно больше и составило 217,5 ± 178,6 — данный показатель достоверно превышал аналогичное значение в группе РТПХ (р 0,001).
Распределение CDla+ клеток в биоптатах кожи исследуемых групп больных имело характерные особенности. При оценке CDla+ клеток у пациентов группы токсикодермии обращало на себя внимание значительное количество данных клеток не только в пределах эпидермиса, но и в верхних слоях сосочкового слоя дермы — Рисунок 14. Среди пациентов группы РТПХ CDla+ клетки располагались преимущественно в эпидермисе. Рисунок 14 — CDla+ при токсикодермии (об. 20х ок. 10х, иммуногистохимическая реакция)
Среднее количество CD8+ клеток в дермальном инфильтрате пациентов с РТПХ составило 33,5 ± 33,3, что оказалось значимо ниже количества CD8+ клеток в группе токсикодермии (262,0 ± 159,3), р 0,001 — Рисунки 15, 16.
Результаты молекулярно-биологического исследования биоптатов кожи пациентов группы РТПХ
Есть основания полагать, что одновременная пролиферация и активация Т-регуляторных клеток могла бы контролировать избыточную активацию Т-эффекторов и ограничивать клинически неблагоприятные последствия этого процесса — массивный выброс провоспалительных цитокинов [88].
В ходе настоящего исследования было выявлено, что количество CD3+ и CD8+ клеток в инфильтрате у больных с РТПХ было меньшим, чем в группе токсикодермии (160,8 ± 86,7 и 805,0 ± 400,0; 33,5 ± 33,3 и 262,0 ± 159,3, соответственно). Однако индивидуальные колебания этих показателей были очень велики. Известно, что различные типы несоответствия в системе главного комплекса гистосовместимости пары донор-реципиент ведут к разным вариантам непропорционального восстановления гемопоэза [61]. Это обстоятельство ограничивает диагностическую значимость обнаруженных различий, несмотря на удовлетворительную математическую достоверность. Индукция РТПХ происходит при участии не только CD4+, но и цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов (при несовпадении генотипа донора и реципиента по МНС II и I классов соответственно), а также натуральных киллеров [70, 92]. По данным литературы, у пациентов с большей степенью несовпадения по системе HLA плотность инфильтрации кожи СD8+ клетками достоверно выше [102]. В последних исследованиях выявлено, что CD8+ клетки играют значительную роль в индукции острой РТПХ через каскад интерлейкина-17 — обнаружена обратная корреляция между Т-регуляторными лимфоцитами и CD8+ клетками в периферической крови пациентов с РТПХ [81]. Дальнейшее изучение CD8+ лимфоцитов в контексте РТПХ может открыть новое направление в терапии посттрансплантационного периода, так как помимо значительной роли в развитии РТПХ, цитотоксические CD8+ клетки не влияют на развитие реакции «трансплантат против опухоли» [47].
Очевидное значение в развитии РТПХ как иммунного процесса должны иметь антиген-представляющие клетки Лангерганса, однако их роль в патогенезе РТПХ не уточнена. В настоящем исследовании количество CD1a+ клеток было достоверно больше в эпидермисе у пациентов с токсикодермией (217,5 ± 178,6), чем в группе РТПХ (41,4 ± 32,2). До настоящего времени не известно, какое значение в патогенезе РТПХ имеют количество и происхождение СD1a+ клеток (клетки донора или реципиента), также остается неясным, можно ли использовать данные показатели при дифференциальной диагностике РТПХ. Большинство исследователей полагает, что антиген-представляющие клетки донора играют значительно меньшую роль в патогенезе РТПХ, чем клетки Лангерганса реципиента, последние, кроме того, активно участвуют в реакции «трансплантат против опухоли» [37]. Существуют основания считать, что наибольшее значение в инициации РТПХ имеет презентация клетками Лангерганса не столько нормальных антигенов, сколько антигенов, поврежденных в ходе химиолучевой терапии. Подобная активность может сопровождаться увеличением количества CDla+ клеток в целом. Последние исследования выявили, что в условиях значительного дефицита дендритных клеток снижается выработка Т-клеток в общем и Т-регуляторных клеток в частности [107]. В то же время в ряде исследований не выявлено количественных и качественных различий антиген-представляющих клеток у больных с РТПХ в сравнении с контрольной группой [22, 76].
Сведения о роли инфекционных процессов в патогенезе РТПХ [66] обосновывают необходимость дифференциальной диагностики кожных высыпаний у пациентов, перенесших аллоТКМ, не только с токсико-аллергическими реакциями, но и с вирусными поражениями кожи [90]. При морфологическом исследовании биоптатов кожи не определялись признаки цитопатических эффектов, свойственных ДНК-содержащим вирусам семейства герпеса. Иммуногистохимическое исследование ни в одном наблюдении не обнаружило клеток с экспрессией ядерных белков ЦМВ, в том числе в наблюдениях с положительным результатом ПЦР. По данным литературы, иммуногистохимическое обнаружение ЦМВ в биоптатах кожи больных РТПХ также не дает убедительных результатов: по данным Horn ни у одного из 21 больного с РТПХ с доказанной реактивацией ЦМВ инфекции не было выявлено позитивное окрашивание антителами к ЦМВ в парафиновых срезах [58].
При анализе клинических данных выявлено, что у пациентов группы ЦМВ(+) течение РТПХ было более легким, а прогноз — благоприятным, но из-за недостаточной численности этой группы (трое больных из 50) результаты оказались статистически незначимыми. При несомненной важности реактивации ЦМВ в посттрансплантационном периоде, обнаружение вирусной ДНК в органах-мишенях РТПХ, включая кожу, не обладает достаточной чувствительностью: по данным Appleton только у 1 из 56 больных с подтвержденной ЦМВ инфекцией (ПЦР анализ образцов периферической крови) были выявлены фрагменты вирусной ДНК в биоптатах кожи [25].