Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы "триазолиевые соединения, их физиологическая активность и роль в растениеводстве"
1.1. Ретарданты и их механизм действия в растениях 10
1.2. Триазолы в регуляции роста и развития растений 11
1.3. Роль триазолов в гормональном балансе растений 29
1.3.1. Влияние триазолов на биосинтез гиббереллинов, стеролов и брассиностероидов 29
1.3.2. Влияние триазолов на содержание АБК 37
1.3.3. Взаимодействие триазолов с гормонами растений 41
1.4. Антистрессовые свойства триазолов 47
1.4.1. Роль триазолов в адаптации растений к высоким и низким температурам и действию ксенобиотиков 47
1.4.2. Действие триазолов в условиях водного стресса 52
1.5. Триазолы как фактор повышения устойчивости к полеганию и продуктивности растений 57
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований
2.1. Характеристика объектов исследований 64
2.2. Физико-химические свойства регуляторов роста 65
2.3. Методы исследований 67
ГЛАВА 3. Результаты исследований
3.1. Влияние ретардантов триазолиевого ряда на рост и развитие растений ячменя разных сортов 78
3.1.1. Установление оптимальных концентраций ретардантной активности триазолов 78
3.1.2. Влияние триазолов на формирование проростков ярового ячменя 80
3.1.3. Влияние триазолов на динамику роста, морфофизиологические параметры и урожай ярового ячменя, при разных способах их введения в растения 85
3.2. Влияние триазолов на индукцию активности а-амилазы 99
3.2.1. Влияние триазолов на активность а-амилазы, индуцированную экзогенной ГАз в эндосперме ячменя, лишенном зародыша, у разных сортов ячменя
3.2.2. Использование а-амилазного биотеста для сравнительного определения ретардантной активности триазолов
3.3. Влияние триазолов на содержание АБК в надземных органах проростков, стеблях и
листьях растений ярового ячменя в онтогенезе 115
3.3.1. Содержание АБК в надземных органах 7-дневных проростков ярового ячменя под действием триазолов
3.3.2. Динамика изменения содержания АБК в стеблях и листьях ячменя при разных способах введения триазолов
3.3.3. Зависимость между ростом стебля ярового ячменя и содержанием АБК под влиянием триазолов
Заключение 132
Выводы 135
Литература 137
- Влияние триазолов на биосинтез гиббереллинов, стеролов и брассиностероидов
- Роль триазолов в адаптации растений к высоким и низким температурам и действию ксенобиотиков
- Влияние триазолов на динамику роста, морфофизиологические параметры и урожай ярового ячменя, при разных способах их введения в растения
- Содержание АБК в надземных органах 7-дневных проростков ярового ячменя под действием триазолов
Введение к работе
Современные представления о гормональной регуляции роста и развития растений являются основой для поиска новых биологически активных природных и синтетических т соединений. Гормоны растений выполняют роль медиаторов эндогенных программ развития и служат для интеграции внеклеточных сигналов для регуляции и оптимизации роста и реализации физиологических функций растений [Davies H.J., 1995]. В настоящее время заметный прогресс наблюдается в понимании механизма действия компонентов системы гормональной регуляции, во взаимодействии генетической и гормональной
Щ регуляции развития растений [Hooley, 1994; Sponsel, 1994; Ross, 1994; Swain and Olszewski, 1996; Leung, Giraudat, 1998; Grill and Himmelbach, 1998]. Появление новых инструментов, таких как синтетические регуляторы роста, прерывающие биосинтез отдельных гормонов, в сочетании с использованием растений, несущих мутацию в пути биосинтеза гормона или передаче гормонального сигнала, определило стратегические w достижения в области генетического контроля развития растений [Kende and Zeevaart,
1997; Шевелуха, 2001].
Синтетические регуляторы роста контролируют онтогенез растений и являются факторами повышения урожайности, устойчивости к полеганию, засухе и другим стрессам. Открытие на протяжении 50-ых годов ретардантов послужило основанием для изучения этого класса соединений, сочетающего в себе способность укорачивать и утолщать стебель, стимулировать рост корневой системы и обеспечивать лучшее развитие репродуктивных органов. По химическому строению ретарданты относятся к широкому спектру групп соединений. Наиболее широкое распространение из них получили четвертичные аммониевые основания, в частности, хлорхолинхлорид и триазолиевые
ЩJ соединения, такие как паклобутразол и униконазол. Специфическое свойство ретардантов - ингибирование роста стебля основано на их способности к подавлению биосинтеза гиббереллинов на разных этапах образования. Наиболее изученным является подавление
5 биосинтеза гиббереллинов с помощью хлорхолинхлорида на ранних стадиях его образования путем торможения включения мевалоновой кислоты в молекулу каурена [Ninnemann, Zeevaart, Kend, Lang, 1964; Barnes, Light, Lany, 1969] при одновременном ^ подавлении физиологического действия гиббереллинов [Paleg et al., 1965, Иванова,
Чайлахан, 1969; 1988].
В настоящее время существует ряд перспективных направлений, в которых ведется активный поиск новых регуляторов роста растений. Большинство из них повышает продуктивность или качество растений за счет изменения развития растений,
Ш' взаимодействуя с гормональной системой как путем блокирования синтеза или действия гормонов, так и путем регуляции их поступления в данный момент времени в определенные ткани и органы растения. Существует также возможность прямого влияния регуляторов роста на метаболизм растения и увеличение урожая путем модификации ключевых физиологических процессов, таких как фотосинтез, фиксация азота, изменение ионного баланса, транспорт ассимилятов и регуляция старения [Gianfagna, 1995; Никелл, 1984].
Несмотря на значительный прогресс в области изучения базовых физиологических процессов, влияющих на рост и развитие растений, и идентификацию потенциально полезных экспериментальных соединений, в течение последних десяти лет только небольшое количество новых регуляторов роста нашло применение в сельском хозяйстве, одной из таких групп соединений являются триазолиевые ретарданты [Gianfagna, 1995; Rademacher, 1991; Jung, 1984; Davis and Steffens, 1988]. Особенностью этих соединений является высокая эффективность ретардантного действия в малых концентрациях и отсутствие негативных побочных эффектов, что позволяет оценивать их как биорациональные, экологически безопасные биорегуляторы. Обладая низкой токсичностью, триазолиевые соединения в отличие от среднетоксичных, к которым относится хлорхолинхлорид, блокируют биосинтез гиббереллина в трех биологических звеньях, эффективно снижая его уровень, начиная с ранних стадий развития растений, что обуславливает их высокую ретардантную активность [Rademacher and Jung, 1986; Rademacher et al., 1987; Kende and Zeevaart, 1997]. " Наряду с блокированием биосинтеза гиббереллинов, триазолиевые соединения изменяют гормональный баланс растения в целом, что объясняет разнообразие вызываемых ими физиологических эффектов. Спектр действия триазолов колеблется от таких сильно выраженных эффектов, как изменение формы, размера и скорости роста до более тонких, которые являются результатом влияния на метаболизм, приводящих к w изменению количественных и качественных показателей получаемого продукта. Основой применения триазолиевых регуляторов роста на зерновых культурах является получение коротко- и толстостебельных растений, характеризующихся высокой продуктивностью, что является одним из главных критериев повышения устойчивости растений к полеганию [Прусакова, Чижова, 1990, 1998].
Новой актуальной областью применения триазолов является реализация максимально возможной потенциальной устойчивости растений при неблагоприятных воздействиях окружающей среды, что в настоящее время является одним из ведущих направлений повышения урожайности. В частности, триазолы эффективно изучаются в связи с борьбой с полеганием растений, что остается основной проблемой при выращивании зерновых культур, вызывающей значительные потери урожая [Прусакова, 1989; Прусакова, Чижова, Панова, 1988; Rademacher, 1991; Gianfagna, 1995].
Кроме того, установленное в последнее время влияние триазолов на такие основные функции растений как индукция корнеобразования, стимуляция утолщения главного корня, инициация цветения, влияние на органогенез в сочетании с экзогенными гормонами, открывают перспективы для появления, новых областей применения триазолиевых регуляторов роста.
7 Ингибирование триазолами биосинтеза гиббереллина вызывает многофакторный ответ организма, который выражается в изменении многих физиологических реакций организма, и в который вовлечены другие гормоны растений. Влияние триазолов на " биосинтез и метаболизм этилена и брассиностероидов, а также изменение уровня цитокининов и АБК под действием триазолов, установленное в последние годы, вносит значительный вклад в изучение сложного механизма взаимодействия гормонов в процессе роста и развития.
Ингибирующее действие триазолов на рост стебля не ограничивается, по- W' видимому, подавлением биосинтеза гиббереллинов, а вызывает одновременно стимуляцию образования гормонов противоположного действия - АБК. В связи с антистрессовым действием триазолов, а также стимуляцией закрытия устьиц, сокращением потребления воды и другими особенностями ростовых и физиологических реакций растений в ответ на триазолы вопрос о влиянии этих ретардантов на уровень АБК приобретает особую актуальность. Однако данные повышения уровня АБК под действием триазолов имеются в единичных работах [Asare-Boamah, 1986; Kojima, Goto, 1996] и не дают однозначного ответа об изменении содержания АБК под действием триазолов в различных тканях и органах растений. Кроме того, механизм действия триазолов на содержание АБК как в стрессовых, так и в нестрессовых условиях еще предстоит изучить. Таким образом, изучение влияния триазолов на уровень АБК является необходимым звеном для создания целостной картины гормонального ответа растения на различные изменения, вызванные факторами окружающей среды, что является неотъемлемым компонентом при разработке интенсивных технологий возделывания сельскохозяйственных культур с целью управления продуктивностью, качеством и устойчивостью растений [Никелл, 1984; Чайлахян, 1988; Муромцев, Чкаников, Кулаева, Гамбург, 1987; Кефели, 1987; Прусакова, Чижова, 1990; Gianfagna, 1995; Sponsel, 1995]. В задачу наших исследований входило:
8 1.Изучение закономерностей роста и развития 7-дневных проростков ярового ячменя различных сортов под действием триазолиевых соединений - паклобутразола, униконазола и азовита. "' 2.Исследование особенностей действия триазолиевых соединений на морфофизиологические показатели растений ярового ячменя трех сортов - Московский 2, Зазерский 85 и Носовский 9 в ходе онтогенеза и в зависимости от способа внесения и дозы триазолов.
3.Изучение направленности действия триазолиевых соединений на
Ш> ферментативную активность а-амилазы эндосперма ячменя разных сортов и описание сравнительной характеристики антигиббереллинового действия триазолов -паклобутразола, азовита и униконазола с использованием а-амилазного биотеста.
4.Установление влияния триазолов на содержание абсцизовой кислоты в растениях ярового ячменя на различных этапах онтогенеза. Сравнение динамики изменения эндогенного содержания АБК под действием триазолов в зависимости от химической природы ретарданта и от способа его внесения в растение, а также в связи с особенностями ретардантной (морфофизиологической) активности триазолов.
5.Оценка влияния триазолов на элементы продуктивности ярового ячменя. ^ Разработка способа применения триазолов как средства предупреждения полегания ярового ячменя.
Целью настоящей работы явилось изучение направленности действия ретардантов триазолиевого ряда на компоненты гормональной системы, характера изменений содержания АБК, уровня гиббереллиновой активности и морфофизиологических параметров ярового ячменя разных генотипов под влиянием триазолов для повышения устойчивости к полеганию и продуктивности ярового ячменя. Изучение связи роста и развития растений ячменя с количеством АБК в тканях и индукцией активности а- амилазы для установления механизма действия триазолов на растениях ячменя с целью изучения эффективности и экологической безопасности применения разных форм триазолов в растениеводстве в сравнении с другими ретардантами.
Влияние триазолов на биосинтез гиббереллинов, стеролов и брассиностероидов
Многочисленными исследованиями установлено, что триазолы являются эффективными ингибиторами биосинтеза гиббереллинов (первичным эффектом ретардантов триазолиевого ряда является подавление ферментативного биосинтеза гиббереллинов) путем ингибирования активности цитохром Р-450 зависимой монооксигеназы, катализирующей три стадии окислительного превращения энт-каурена в энт-кауреновую кислоту [Rademacher, Fritsch, Graebe, Sauter and Jung, 1987; Rademacher, 1991] (Рис. 3).
Действительно, все опубликованные данные о действии триазолов на содержание гиббереллинов в растении указывают на снижение уровня этих гормонов [Izumi et al.,1984; Rademacher et al.,1984; Jung et al.,1987; Grossmann et al.,1987]. Так, установлено, что при внесении ингибитора биосинтеза гиббереллина - паклобутразола, сокращение эндогенного уровня гормона в проростках пшеницы пропорционально концентрации ингибитора, при этом высота проростков изменяется линейно логарифму концентрации гибберелловой кислоты [Lenton and Hedden 1987; Lurfsen, 1987; Lenton, 1994]. В алейроновом слое эндосперма ячменя, лишенного зародыша, триазолы подавляют активность сс-амилазы, индуцированную экзогенной гибберелловой кислотой, и их ингибирующее действие возрастает с увеличением концентрации ретарданта [Прусакова, Кефели и др., 1991; Чижова, 1989; Pavlova, Chizhova, 1990]. Показано, что триазолы в относительно низких дозах (ЮцМ) почти полностью (на 96%) блокируют биосинтез гиббереллинов [Zeevaart, 1985].
Кроме того, триазолы наряду с ингибированием фермента окисления энт-каурена в энт-кауреновую кислоту в цепи биосинтеза гиббереллинов могут влиять на другие цитохром Р-450 монооксигеназы, хотя, в большинстве случаев, их активность снижается в значительно меньшей степени. В частности, триазолы ингибируют биосинтез стеролов, блокируя стадию 14-а-деметилирования, катализируемую ферментом группы монооксигеназ [Burden, Clark et al., 1986] (Рис. 4). Существуют многочисленные доказательства того, что некоторые изомеры триазолов могут изменять или ингибировать биосинтез стеролов в высших растениях. Так использование техники анализа взаимодействия триазолиевого ретарданта триапентанола с экзогенной гибберелловой кислотой на проростках ячменя и соевых бобов позволило установить, что индуцированное этим ретардантом ингибиррвание роста не полностью компенсируется добавлением гибберелловой кислоты [Lurssen and Reiser, 1987]. Показано, что в зависимости от концентрации триазолов, существуют другие сайты их действия, которые оказывают дополнительное влияние на ингибирование роста растения. При этом один энантиомер триапентанола вызывал торможение роста только за счет ингибирования биосинтеза гиббереллинов, в то время как рацемат, благодаря присутствию другого энантиомера, влиял также на метаболизм стеролов, что могло быть причиной дополнительного эффекта на рост растения. Аналогичные данные получены на проростках пшеницы, у которых подавление роста, индуцированное 2S.3S паклобутразолом, полностью предотвращается добавлением гибберелловой кислоты; в противоположность этому, торможение роста стебля, вызванное 2К.,311-паклобутразолом, не восстановливалось при её добавлении. При этом установлено, что сокращение роста стебля и корня у обработанных паклобутразолом растений пшеницы зависит не только от природной способности данного энантиомера в определенной концентрации ингибировать биосинтез гиббереллинов и стеролов, но и от относительной зависимости различных тканей от гиббереллинов и стеролов, необходимых для роста [Lenton et al., 1987]. Показано влияние некоторых ретардантов роста на состав стеролов в растениях, а также его видоспецифичность. Например, проростки ячменя, обработанные триадимефоном или триадименолом, содержали более низкие количества С-4,4 деметилстеролов, чем необработанные проростки [Buchenauer and Rohner, 1981]. Кроме индукции накопления аномальных стеролов (14-а-метилстеролов) обработка триазолиевыми фунгицидами вызывала изменение соотношения кампестеролов к стигмастеролам и цитостеролам, что приводит к изменениям в структуре и функциях мембран, и это может способствовать сокращению роста растений [Burden, Clark, Holloway, 1987; Rademacher, Fritsch, Graebe, 1987]. При этом установлено, что триазолы снижают рост клетки удлинением в низких дозах, эффективно блокируя биосинтез гиббереллина, в то время как в более высоких концентрациях они ингибируют деление клеток, блокируя биосинтез стеролов [Hayghan et al, 1988; Grossvan et al., 1985]. Фунгициды, в частности триадимефон, а также изомеры с фунгицидной активностью других ретардантов группы триазолов, в значительной степени вызывают торможение роста растений по данному механизму.
Таким образом, триазолы в низких дозах являются специфическими ингибиторами гиббереллина. В более высоких концентрациях эти ретарданты могут также ингибировать другие метаболические реакции, катализируемые другими цитохром Р-450 монооксигеназами, менее чувствительными к действию триазолов. Кроме ингибирования биосинтеза стеролов, триазолы также ингибируют окислительную инактивацию АБК, взаимодействуя с ферментами, катализирующими эту реакцию. Кроме того, цитохром Р-450 монооксигеназы вовлечены в биосинтез фенолов лигнина, стеролов мембран, фитоалексинов, монотерпеноидов и индольных алколоидов [Donaldson, Luster, 1991], а также они катализируют детоксификацию многих гербицидов. Есть данные о том, что триазолы ингибируют окислительный метаболизм некоторых ксенобиотиков [Rademacher, 1991].
Роль триазолов в адаптации растений к высоким и низким температурам и действию ксенобиотиков
В процессе роста и развития растения неизбежно подвергаются различным видам стресса, таким как засуха, высокие и низкие температуры, загрязнение и UV-B радиация, засоление, присутствие озона. Все эти стрессовые условия генерируют различные виды активного кислорода (AOS) - высокореакционные соединения, способные повреждать мембранные липиды, протеины, хлорофилл и нуклеиновые кислоты, таким образом, нарушая гомеостаз организма [Shaaltiel and Grossel, 1986; Scandalios, 1993; Allen, 1993; Anderson et al., 1995; Rao et al., 1996]. Различные механизмы, вырабатываемые растениями для предотвращения или смягчения повреждений, вызываемых AOS, включают удаление AOS природными антиоксидантами, такими как аскорбат и а-токоферол, а также активацию ферментативной антиоксидантной системы растения [Scandalios, 1993; Foyer et al.,1994; Allen,1995; Anderson et al.,1995; Rao et al.,1996]. [Bowler et al., 1991; McKersie et al., 1993; Sen Gupta et al., 1993; Pitcher and Zilinskas, 1996; Bueno, Piqueras, Kupera et al., 1998]. Во многих работах показано, что триазолы индуцируют устойчивость к различным формам стрессов путем повышения активности антиоксидантных ферментов [Upadhyaya, 1989, Kraus and Fletcher, 1994; Lurie et al., 1994; Paliyath and Fletcher, 1995, Senaratna et., 1988; Pinhero et al., 1997]. Известно, что устойчивость к стрессовым факторам достигается за счет различных адаптивных механизмов, и модуляция уровней антиоксидантных ферментов является только частью целого механизма. Уменьшение чувствительности к низкотемпературным стрессам под действием триазолов было выявлено в различных растениях и органах растений [Asare-Boamah and Fletcher, 1986; Borochov and Shahar 1989; Fletcher and Hofstra,1985; Wang,1985; Whitaker and Wang 1987; Lurie et al.,1994; Senaratna et al.,1988].
Известно, что многие зерновые культуры умеренных регионов подвергаются холодовым стрессам на ранних стадиях онтогенеза, особенно в период прорастания и начальной стадии роста проростков. При этом могут возникать повреждения клеточных структур, вызванные образованием различных видов активного кислорода: радикалов супероксида, синглетного кислорода, перекиси кислорода и гидроксильных радикалов [Wise and Naylor,1987]. В ряде работ установлено, что триазолы частично предотвращают такие повреждения холодом, как понижение интенсивности фотосинтеза, фотоингибирование, повреждения мембран, проявляющиеся в сокращении транспорта через плазмалемму, ослаблении функций митохондриального дыхания и ингибировании реакций Хилла в хлоропластах, вызванные в некоторых аспектах холодового стресса специфически активированными видами кислорода.
Так, в условиях низкотемпературного стресса (5С в течении 6 дней) обработка паклобутразолом приводит к снижению вызванных холодом повреждений клеточных мембран в листьях проростков огурца, ослабляет деградацию мембранных липидов. В листьях растений, обработанных паклобутразолом, наблюдалось значительно меньшее падение сырого веса листьев, содержания фосфолипидов и глюкозидов стеролов, чем в контрольных растениях [Whitaker and Wang, 1987]. В плодах зеленого перца защитный эффект паклобутразола от повреждений р низкими температурами, является результатом как его влияния на морфологию плодов, так и защиты липидов мембран от окислительного стресса (окислительной деградации), индуцированного холодом, за счет повышения ферментативной антиоксидантной активности в плазматической мембране [Lurie 1994]. В микросомальных мембранах содержится больше природных антиоксидантов, чем в плазматических, что является одной из причин их лучшей защищенности от повреждений холодом. Униконазол, увеличивал общее количество липидо-растворимых антиоксидантов, также как и аскорбиновой кислоты, в обработанных листьях растений [Upadhyaya et al., 1989]. Под действием триазолов обнаружено увеличение соотношения цитостеролов к стигмастеролам в плодах перца и в холодо-устойчивых растениях бобов [Lurie and Ronen, Р 1993; Guye, 1988]. В плодах томатов паклобутразол в значительной степени предотвращал такие изменения, индуцированные низкотемпературным стрессом, как уменьшение содержания липидов, увеличение соотношения стеролов к фосфолипидам и увеличение содержания насыщенных жирных кислот [Whitaker, 1993]. Обработка униконазолом проростков томата индуцирует определенную степень устойчивости растений к низкотемпературному стрессу, оказывая влияние на ряд физиолого-биохимических процессов в мембранах [Senaratna et al., 1988]. Хотя униконазол не предотвращает вызываемое стрессом кратковременное падение флуоресценции хлорофилла (ингибирование фотосинтетического транспорта электронов) т.е. активности переноса энергии, он защищает фотосинтетическую систему от необратимых изменений и позволяет ей быстро восстановиться. Кроме того, обработка униконазолом предотвращает усиление утечки электролитов в мембранах листьев томатов, что связано с защитным действием ретарданта на мембраны, повышение уровня свободных жирных кислот в микросомальной мембранной фракции, а также количественно увеличивает различные системы, удаляющие свободные радикалы, а именно, концентрацию липидорастворимых антиоксидантов, а-токоферола и аскорбиновой кислоты. Таким образом, возросшая устойчивость проростков томатов под действием униконазола позволяет им восстановить функционирование фотосинтетических процессов при возвращении к нестрессовым температурам, в отличие от контроля, и связана с возросшей активностью антиоксидантов, устраняющих свободные радикалы в клетках. Обработка паклобутразолом проростков маиса холодоустойчивой инбридной линии С0328 не приводила к повышению его устойчивости к низким температурам, но в то же время защищала от повреждений проростки маиса чувствительной к холоду линии С0316 [Pinhero, Rao et al., 1997]. Было установлено, что механизм устойчивости к холоду у генетически холодоустойчивого С0328 и чувствительного к холоду С0316 сортов маиса включает использование сходных систем ферментов-антиоксидантов, но в различных количественных соотношениях. При этом триазолы вызывают дифференциальную модуляцию антиоксидантных изоферментов и их активности у различных генетических форм растений, что является важной чертой повышения устойчивости к холоду. Так паклобутразол вызывал повышение активности антиоксидантов - супероксиддисмутазы в листьях и глутатионредуктазы в корнях маиса холодоустойчивой линии, и в то же время у маиса чувствительной к холоду линии повышал активность супероксиддисмутазы и аскорбатпероксидазы в листьях и корнях.
Влияние триазолов на динамику роста, морфофизиологические параметры и урожай ярового ячменя, при разных способах их введения в растения
Стимулирующее действие азовита, паклобутразола и униконазола на рост корневой системы ячменя проявлялось в зависимости от сорта ячменя и формы соединения (рис.2) Так паклобутразол и униконазол в отличие от азовита на всех исследуемых нами сортах увеличивал длину корня относительно контроля. В то же время азовит не оказывал стимулирующего действия на рост корней у ячменя Московский 2, при этом усиливая рост корня у ячменя Зазерский 85 и Носовский 9. По литературным данным, наблюдалось усиление роста корневой системы под действием азовита у отрезков гипокотелей бобов, которое выражалось в стимуляции корнеобразования и увеличении общей массы корней [Fletcher et al., 1988], а также под действием паклобутразола - у отрезков манговых бобов [Wiesman and Riov, 1994]. Стимуляция роста корней при внесении униконазола была также установлена у 8-дневных проростков пшеницы и соевых бобов [Kraus et al., 1991; Fletcher and Hofstra, 1988], кроме того, азовит также стимулировал рост корней у редиса, но ингибировал у ячменя [Fletcher and Nath, 1984; Buchenauer and Rohner, 1981]. Полученные нами данные свидетельствуют о сортоспецифичности действия триазолов на рост надземной части и корня проростков ячменя. Так, ячмень Зазерский 85, контрольные проростки которого имели надземную часть меньшей длины и более короткие корни, чем проростки двух других сортов, характеризовался более слабым торможением роста побега под действием триазолов, но значительно более сильной стимуляцией роста корня, чем ячмень Носовский 2 и Московский 85 (рис.2). Данные таблицы (Табл.1) подтверждают, что введение азовита, паклобутразола и униконазола методом полусухой обработки семян изменяет морфотип растений ячменя в направлении снижения длины надземных органов и усиления роста корня, приводя к увеличению отношения корни-стебли. Показатель отношения корни-стебли для ячменя Носовский 9 при обработке азовитом, паклобутразолом и униконазолом составил 0,67; 1,87; 1,55, соответственно, при контроле 0,38; для ячменя Московский 2 и Зазерский 85 0,54, 1,74; 1,60 при контроле 0,35 и 0,72; 2,11; 1,57 при контроле 0,36, соответственно (Табл. 1). Это согласуется с данными увеличения отношения корни-стебли под влиянием триазолов у пшеницы и маиса [Davis et al., 1988; Fletcher and Hofstra, 1988], и является показателем повышения устойчивости растений к полеганию и многим неблагоприятным факторам окружающей среды. Сравнение динамики влияния триазолов на рост побега и корня выявляет резкое торможение роста стебля под влиянием низких доз триазолов, в то время как торможение корня вызывается более высокими дозами и описывается более пологой концентрационной кривой. При этом, действие триазолов на корневую систему ячменя значительно сильнее подвержено влиянию химической природы триазола, выбранной дозы внесения ретарданта, способа и времени обработки и сортовой специфичности растений, по сравнению с побегом. Аналогичные результаты получены на томатах при испытании разных концентраций триазолов, у которых увеличение дозы триазолов сопровождалось сначала усилением роста корня, а затем дальнейшее повышение дозы приводило к торможению его роста [Tanimoto, 1995]. Полученные нами результаты свидетельствуют о более низкой чувствительности корней проростков ячменя к азовиту, паклобутразолу и униконазолу, по сравнению с надземными органами. В соответствие с анигиббереллиновым характером действия триазолов, полученная динамика подтверждает, что для роста удлинением корневым органам требуется меньшее количество гиббереллинов, чем надземным органам, что может быть связано с разным объемом зоны удлинения в корнях и стеблях молодых проростков растений [Tanimoto, 1995]. Показано, что снижение уровня гиббереллинов триазолами и сдвиг гормонального баланса в сторону увеличения соотношения ... приводит к усилению корнеобразования и повышению массы корней за счет развития боковых корней [...]. Кроме того, установленное нами усиление роста корня под влиянием триазолов, а также близкая корреляция торможения роста надземных органов и стимуляции роста корня уже на ранних стадиях онтогенеза могут быть связаны с перераспределением ассимилятов и частичным оттоком их к корневой системе. Так для ячменя Носовский 9, Московский 2 и Зазерский 85 при сравнении интенсивности роста надземных органов и проростков были получены коэффициенты корреляции Ri=-0,9082; R2=-0,6117, R3 = -0,9593, соответственно, что свидетельствует об обратной зависимости действия триазолов на рост надземных органов и корней у 7-дневных проростков разных сортов ячменя.
Таким образом, у 7-дневных проростков ячменя сорта Носовский 9, Московский 2 и Зазерский 85 при предпосевной полусухой обработке семян триазолами наблюдались изменения в интенсивности роста надземных органов и корневой системы. При этом отмечалось стабильное торможение триазолами роста надземных органов и стимуляция корневой системы, за исключением варианта с азовитом у сорта Московский 2.
Содержание АБК в надземных органах 7-дневных проростков ярового ячменя под действием триазолов
В связи с тем, что синтетические регуляторы роста оказывают непосредственное влияние на систему гормональной регуляции роста и развития растений [Гамбург и др., 1979; Муромцев и др., 1987; Чайлахян, 1982], представляло интерес установление связи ингибирующего действия ретардантов триазолиевого ряда на рост стебля ярового ячменя {Hordeum vulgar L.) сортов Носовский 9, Московский 2 и Зазерский 85 с их влиянием на уровень и активность эндогенных гормонов, в первую очередь, гиббереллинов и АБК. С этой целью нами проведено сравнительное изучение влияния паклобутразола, униконазола и азовита на рост стебля, содержание АБК в надземных органах растения и индукцию активности а-амилазы ярового ячменя.
Учитывая направленность действия триазолиевых соединений, заключающуюся в прерывании биосинтеза гиббереллинов, и широкий спектр их физиологического действия, включающий, прежде всего, эффективное торможение роста стебля удлинением, нами проведено испытание влияния различных форм триазолиевых соединений на индукцию а-амилазы эндосперма ячменя, стимулированную экзогенной гибберелловой кислотой, с целью изучения особенностей их антигиббереллиновой активности.
Биотест, основанный на индукции активности а-амилазы эндосперма пшеницы, лишенного зародыша, экзогенной гибберелловой кислотой, был модифицирован для ярового ячменя Л. Д. Прусаковой и С. И. Чижовой для выявления торможения ретардантами процесса индукции активности гидролитического фермента экзогенной гибберелловой кислотой [Чижова, 1989; Прусакова, Кефели, Чижова, Васильева, Павлова, 1991].
Ключевые физиологические и биохимические процессы лежат в основе моделей, которые используются для разработки новых методов оценки гормональной активности регуляторов роста и расширения границ уже имеющихся методов. Установлено, что в изолированном алейроновом слое семян зерновых культур ГКз стимулирует, а АБК подавляет транскрипцию генов гидролитического фермента а-амилазы [Fincher, 1989; Jones and Jacobsen, 1991, Grill and Himmelbach, 1998]. Было также предположено, что синтез ос-амилазы в эндосперме ячменя может ингибироваться регуляторами отличными от АБК [Skadsen, 1993]. Высоко специализированные секреторные клетки алейронового слоя эндосперма зерновых культур являются широко используемой экспериментальной системой для изучения клеточной и молекулярной биологии действия гиббереллинов [Jacobsen et al., 1995; Hooley, 1994; Lenton, Appleford and Croker, 1994; Grosselindemann et al., 1991]. Кроме того, было показано, что в семенах, лишенных зародыша, экзогенная ГКз способна замещать синтезируемый зародышем гормон и стимулировать в алейроновых клетках секрецию а-амилазы, которая расщепляет крахмал эндосперма ячменя [Chandler et al., 1984; Nolan and Ho, 1988] и пшеницы [Baulcombe et al., 1984], что послужило основой для разработки биотеста на гиббереллиновую активность [Sarita Lall, 1988; Nagy, 1985]. Исходя из имеющихся данных об антигиббереллиновом действии триазолиевых ретардантов нами было сделано предположение о возможности использования а-амилазной системы изолированного эндосперма ячменя для тестирования ингибиторной активности новых регуляторов роста, при этом снижение ими активности а-амилазы, индуцированной экзогенной ГКз в эндосперме семян лишенных зародыша, могло свидетельствовать об их ретардантной активности [Pavlova and Chizova, 1990; Чижова и др., 1992]. В то же время обработка целых прорастающих зерен пшеницы паклобутразолом значительно уменьшала общее содержание биоактивных гиббереллинов ГКі + ГКз как в щитке, так и в эндосперме семян, а также пул а-амилазных мРНК транскриптов в алейроновом слое, в отличие от щитка, что подтверждало, что биоактивные гиббереллины, синтезируемые de novo в щитке зародыша, регулируют экспрессию а 101 амилазных генов в алейроне интактных семян при прорастании [Lenton, Appleford and Croker, 1994]. Это объясняет, от части, что в интактных семенах в отличие от эндосперма семян, лишенных зародыша, несмотря на сокращение пула а-амилазных мРНК в алейроне при обработке паклобутразолом, не наблюдалось изменений а-амилазной активности в эндосперме ячменя [Grosselindemann et al., 1991] и пшеницы [Lenton et al., 1994]. Эти данные подтверждают невозможность использования целых семян в нашей тест-системе, а также свидетельствуют, что триазолиевые ингибиторы не оказывают негативного эффекта на активность а-амилазы при прорастании семян ячменя и пшеницы. Таким образом, схема биотеста заключается в использовании половинок семян ячменя, лишенных зародыша, для изучения антигиббереллинового действия триазолов, измеряемого по снижению активности гидролитического фермента а-амилазы. В проведенной нами серии опытов с использованием описанного биотеста подтвердилось предположение о снижении триазолами - азовитом, паклобутразолом и униконазолом биологической активности гиббереллинов в эндосперме ячменя и ингибировании индукции а-амилазы.
В модельных опытах индукции активности а-амилазы эндосперма ячменя, согласно нашей модификации, оптимальное действие ГКз, проявляющееся в концентрации 10"5М, испытывалось в смеси с униконазолом, паклобутразолом или азовитом в диапазоне концентраций 10"8 - 10 3 М на эндосперме ячменя, лишенном зародыша и сравнивалось с концентрационной кривой ГКз в том же диапазоне концентраций.
А Установлен разный характер ретардантного действия триазолов на активность а амилазы при подавлении индукции активности фермента экзогенной гибберелловои кислотой - влияние ретардантов проявлялось в зависимости от их структуры, концентрации и сорта ячменя (рис. 9а, б, в).
