Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биохимические и физиологические аспекты влияния ионов никеля на прорастание семян, рост и развитие растений 12
1.1. Общие представления о ТМ 12
1.2. Физиологическая роль никеля 15
1.3. Поглощение ионов никеля растениями 18
1.4. Действие ионов никеля на рост и морфогенез растений 21
Влияние ионов никеля на водный баланс растений
Влияние ионов никеля на фотосинтез Влияние ионов никеля на активность ферментов
1.5. Активные формы кислорода, как показатели стресса 32
1.6. Компоненты антиоксидантных систем растений, как элементы подержания гомеостаза 34
Глава 2. Объекты и методы исследования 41
2.1 Объект исследования 41
2.2. Методы исследования 41
2.2.1. Подготовка и проращивание семян 41
2.2.2. Определение параметров проростков 42
2.2.3. Определение никеля в проростках вики атомно-абсорбционным методом 42
2.2.4. Определение показателей водного обмена растительных тканей (интенсивности транспирации, содержания воды) 43
2.2.5. Определение перекиси водорода 44
2.2.6. Определение перекисного окисления липидов 45
2.2.7 Определение содержания свободного пролина 45
2.2.8. Методы определения низкомолекулярных веществ АОС 46
Определение содержания фотосинтетических пигментов Определение содержания аскорбиновой кислоты Определение содержания флавоноидов
2.2.9. Методы определение активности ферментов 48
Определение активности амилазы
Определение активности уреазы
Определение активности каталазы
Определение активности гваяколовой пероксидазы
2.2.10. Статистическая обработка данных и достоверность результатов исследования 50
Глава 3. Результаты и обсуждение. Физиолого-биохимические особенности прорастания семян и формирования проростков вики в присутствии ионов никеля 51
3.1. Исследование прорастания семян вики 51
3.1.1. Исследование всхожести семян 51
3.1.2. Изучение ферментативной активности в прорастающих семенах вики 53
3.1.2.1. Определение амилазной активности
3.1.2.2. Определение активности уреазы
3.2. Исследование морфогенеза проростков вики и особенностей водного обмена на ранних этапах онтогенеза при различных концентрациях ионов никеля 57
3.2.1. Влияние различных солей никеля на формирование проростков вики 57
3.2.2. Влияние хлорида никеля на величину и массу формирующейся корневой системы 68
3.2.3. Влияние хлорида никеля на величину и массу формирующегося побега 71
3.2.4. Изменение водного баланса
3.3. Содержание ионов никеля в проростках вики 84
3.4. Определение показателей стрессового воздействия ионов никеля при прорастании семян вики 90
3.4.1. Накопление перекиси водорода в формирующихся проростках вики 92
3.4.2. Определение перекисного окисления липидов 92
3.4.3. Содержание основных пигментов фотосинтеза 93
3.5. Исследование элементов антиоксидантной защиты 96
3.5.1. Определение содержания низкомолекулярных компонентов АОС 96
Содержание аскорбиновой кислоты
Содержание флавоноидов
Содержание пролина
3.5.2. Определение содержания высокомолекулярных компонентов антиоксидантной защиты 101
Определение каталазы
Определение гваяколовой пероксидазы
3.6. Использование подходов кластерного анализа к
результатам исследования 104
Заключение 111
Выводы 114
Список использованной литературы
- Влияние ионов никеля на фотосинтез Влияние ионов никеля на активность ферментов
- Определение никеля в проростках вики атомно-абсорбционным методом
- Исследование морфогенеза проростков вики и особенностей водного обмена на ранних этапах онтогенеза при различных концентрациях ионов никеля
- Определение содержания высокомолекулярных компонентов антиоксидантной защиты
Введение к работе
Актуальность исследования. Проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами (ТМ) является одной из важнейших в этом столетии и с каждым годом приобретает все большую значимость. Токсическому действию их высоких концентраций подвержены многие физиологические процессы, такие как рост, развитие, водный режим, фотосинтез и другие. Одним из основных механизмов токсического влияния на растения является способность тяжёлых металлов замещать в активных и/или аллостерических центрах ионы физиологически значимых металлов и взаимодействовать с функциональными группами других макромолекул и метаболитов. Нарушая физиологические процессы в растениях, ТМ оказывают не только прямое отрицательное воздействие, но и сужают пределы толерантности организмов к естественным факторам среды (Mittler, 2002; Серегин, Иванов, 2006; Gajewska, 2006; Kumar et al., 2007; Кожевникова и др., 2009; Pandey, Gopal, 2010; Кошкин, 2010).
Другим важнейшим механизмом негативного влияния ТМ на живой организм является опосредованное повреждающее действие активных форм кислорода (АФК), повышенную генерацию которых они стимулируют (Mittler, 2002; Smeets et al., 2005; Hao et al., 2006; Серегин, Кожевникова, 2006; Гарифзянов и др., 2011). В связи с этим изучение стрессовых реакций, вызванных присутствием в среде ТМ, является важным для развития представлений об ответных реакциях растений на воздействие неблагоприятных факторов и выяснения механизмов адаптации растений к экстремальным условиям. Оно необходимо также для разработки эффективных методов оценки возрастающего промышленного загрязнения окружающей среды и выявления способов преодоления негативных последствий, вызванных влиянием тяжелых металлов.
В этом аспекте большое внимание необходимо уделять сельскохозяйственным растениям, роль которых важна не столько в геохимическом круговороте элементов, сколько в поступлении поллютантов в пищевые цепи, включающие человека, что во многом отражается на его здоровье. Особый интерес представляют мало- или почти не изученные сельскохозяйственные культуры, имеющие существенное практическое значение в разных регионах мира (Pandey, Gopal, 2010). При этом важно использовать виды, у которых конкретные ТМ включаются в биохимические процессы жизнедеятельности. Вика – удобный в этом отношении объект исследования, являющийся значимой кормовой культурой в России.
Целая группа тяжёлых металлов обладает высокой и даже абсолютной физиологической значимостью. Одним из них является никель. Согласно литературным источникам этот важный микроэлемент высших растений
включён в активный центр фермента уреазы, обеспечивающего метаболизм азотсодержащих соединений. Недостаток никеля в растениях приводит к снижению их возможности формировать нормальные зародыши жизнеспособных семян. Также показано, что Ni является элементом, в отсутствие которого растение не может завершить свой жизненный цикл (Brownetal, 1987; Иванов и др., 2003; Серегин, Кожевникова, 2006). Отличительной чертой этого металла является высокая способность проникновения в организм, сравнимая с таковой для основных биогенных элементов (Pandey, Gopal, 2010; Кошкин, 2010).
В литературе недостаточно сведений об особенностях роста и развития растений при действии ионов никеля, а также об индукции окислительного стресса, вызываемого его ионами. Более того, до сих пор остаются неизвестными границы концентраций ионов тяжёлых металлов в среде, при которых физиологическая значимость сменяется токсичностью элемента для формирующегося организма. Поэтому исследование влияния ионов никеля (удобного в этом аспекте тяжёлого металла) представляет научно-практический интерес.
Таким образом, актуальность исследования определяется фундаментальным и прикладным значением ожидаемых результатов для понимания роли физиологически важных тяжелых металлов в широком диапазоне их концентраций в окружающей среде.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение физиологических и биохимических особенностей прорастания семян и формирования проростков вики в присутствие различных концентраций ионов никеля в среде для выявления пределов физиологически необходимых и токсичных концентраций металла. В связи с заявленной целью были поставлены следующие задачи:
-
Изучить прорастание семян вики и активность в них основных ферментов метаболизма (амилазы и уреазы) в присутствии ионов никеля в среде выращивания.
-
Исследовать особенности роста, накопления биомассы и водного режима проростков вики в присутствии различных концентраций ионов никеля.
-
Изучить накопление металла в побегах и корнях вики.
-
Определить ключевые показатели стрессового воздействия ионов никеля в формирующихся проростках вики.
-
Изучить особенности функционирования компонентов антиоксидантной защиты в формирующихся проростках вики в присутствие ионов никеля в среде.
-
Выявить границы (пределы) концентраций хлорида никеля, при которых его физиологическая необходимость для формирующегося растения сменяется токсическими эффектами.
Научная новизна
Впервые изучено формирование проростков вики в присутствии в среде ионов никеля в широком диапазоне концентраций. Показано, что накопление ионов никеля в побегах находится на одинаковом уровне до концентрации 50 мкМ ионов никеля в среде, в то время как в корне концентрация ионов никеля существенно возрастает при концентрации 10 мкМ в среде. При этом индекс устойчивости проростков достоверно снижается при концентрации 100 мкМ.
Показано, что даже минимальные физиологически необходимые концентрации ионов никеля вызывают образование пероксида водорода – высоко активной и наиболее стабильной во времени активной формы кислорода. Также показана определяющая роль аскорбиновой кислоты в защите формирующихся проростков от образования АФК вплоть до полного исчерпания её пула.
Установлено, что при низких концентрациях ионов никеля в среде (вплоть до 100 мкМ) формирование проростков вики на ранних стадиях онтогенеза определяется состоянием водного баланса.
Определены концентрационные границы ионов никеля в среде, при которых физиологическая значимость металла сменяется его токсическими эффектами.
Теоретическая и научно-практическая значимость работы
Результаты исследования вносят новые представления о влиянии физиологически необходимых тяжелых металлов на процессы формирования проростков. Прежде всего, они состоят в том, что даже физиологически значимые концентрации никеля вызывают образование повышенных количеств такой активной формы кислорода как перекись водорода, в ликвидации которой ключевая роль отведена пулу аскорбиновой кислоты и ферменту каталазе. Поэтому понятие «токсической концентрации» в отношении тяжёлых металлов следует использовать только в конкретном приложении к выживаемости организмов, когда их биохимические возможности находятся на пределе или почти исчерпаны.
Показана ведущая роль водного обмена в обеспечении эндогенных условий роста и развития проростков в условиях повышения концентрации никеля в среде. Для поддержания гомеостаза формирующихся проростков не меньшее значение имеют свойства анионов, причём, если ионы хлорида оказывают положительное влияние на водный баланс формирующихся проростков, то органические ионы ацетата играют негативную роль в этом процессе, нейтрализуя положительное влияние ионов физиологически значимого тяжелого металла – никеля.
Результаты имеют фундаментальное значение, так как они могут служить основой для прогнозирования процессов прорастания семян на территориях с разной степенью загрязнения при учёте аналогичного содержания ионов никеля в подвижной фазе конкретных почвенных условий.
Методология и методы диссертационного исследования
Исследования проводили в течение 2006-2015 гг. Объектом исследования служили семена и проростки вики (Vicia sativaL.) сорта Орловская-84. Растения выращивали в виде водной культуры, используя дистиллированную воду в контрольном варианте и с добавлением NiCl2 в опытных пробах (0-10000 мкМ).
Определение всхожести семян проводили по ГОСТ 12038-84. Показатели водного обмена определяли согласно рекомендациям, предложенным ранее (Грязнов, 2006).
Содержание никеля в побегах и корнях проростков вики определяли на атомно-абсорбционном спектрометре с электротермической атомизацией МГА-915М (Метод …, 2009). Определение пигментов проводили после экстракции 96% этиловым спиртом с последующим колориметрированием экстрактов при длинах волн 665; 654; 649 нм (Гавриленко, Жигалова, 2003). Аскорбиновую кислоту определяли по методу, описанному в работе (Иванищев, 2002). Определение флавоноидов проводили по стандартной методике с 2%-ным спиртовым раствором хлористого алюминия (Запрометов, 1971). Содержание перекиси водорода определяли, как описано в работе (Kumar, Knowles, 1993). Определение интенсивности перекисного окисления липидов проводили в соответствии с методикой (Heath, Packer, 1968). Содержание пролина определяли методом L.S. Bates et al. (1973).
Активность амилазы определяли в экстракте из проросших семян по убыли крахмала в реакционной среде (Иванищев, 2002). Определение активности уреазы проводили по количеству образовавшего аммиака при расщеплении мочевины (Плешков, 1968). Определение активности каталазы осуществляли по методу (Goth, 1991). Определение активности пероксидазы проводили спектрофотометрическим методом по скорости окисления пирогаллола (Иванищев, 2002).
Положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Возрастание концентрации хлорида никеля в среде в пределах 10-6 – 10-2 М приводит к дисбалансу между активностью ключевых ферментов метаболизма углерода (амилазы) и азота (уреазы) в семенах, в результате чего нарушается процесс их прорастания.
-
При низких концентрациях (до 50 мкМ) хлорид никеля оказывает активирующее, а при высоких (более 100 мкМ) – ингибирующее действие на формирование побега и корня проростков вики.
-
Характеристики водного режима, показатели роста и накопления биомассы формирующихся побегов и корневой системы проростков вики ухудшаются при высоких концентрациях солей никеля в среде.
-
При высоких концентрациях хлорида никеля в среде в проростках вики проявляются следующие показатели окислительного стресса: возрастает
концентрация перекиси водорода, снижается содержание хлорофиллов и каротиноидов, аскорбиновой кислоты, возрастает активность каталазы и гваякол-зависимой пероксидазы. 5. Ключевыми компонентами антиоксидантной защиты в проростках вики на ранних этапах онтогенеза в присутствие ионов никеля являются аскорбиновая кислота и каталаза.
Степень достоверности и апробация результатов
Эксперименты проведены в трех-пяти биологических повторностях по три-четыре аналитические повторности в каждой. Результаты экспериментов обработаны статистически с использованием программы Excel. Уровень значимости результатов (ос=0,05) соответствует вероятности событий Р = 0,95.
Результаты работы были представлены и обсуждены на Всероссийской конференции студентов и молодых ученых с элементами научной школы (Астрахань 2009); V региональной научно-практической конференции аспирантов, соискателей и молодых ученых «Исследовательский потенциал молодых ученых: взгляд в будущее» (Тула 2009); Научной конференции профессорско-преподавательского состава, аспирантов, магистрантов и соискателей ТГПУ им. Л.Н. Толстого «Университет XXI. Научное измерение» (Тула, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Интеллектуальный потенциал ученых России» (Барнаул, 2010); Международной научно-практической конференции «Экологическое образование для устойчивого развития в условиях реализации федеральных государственных образовательных стандартов» (Ульяновск 2011); Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и биологии» (Пущино 2012); VIII Международной научно-практической конференции «Современное состояние естественных и технических наук» (Москва 2012); Всероссийская научная конференция с международным участием «Актуальность идей В.Н. Хитрово в исследовании биоразнообразия России» и Круглый стол «Продукционный процесс растений и его регуляция» (Орел, 2014).
Публикации результатов исследования
По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 6 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы
Влияние ионов никеля на фотосинтез Влияние ионов никеля на активность ферментов
Среди загрязняющих веществ по масштабам загрязнения и воздействия на биологические объекты особое место занимают тяжелые металлы. Источником их являются минеральные удобрения, известковые материалы, орошение сточными водами. Накапливаясь в почве в опасных концентрациях, они негативно влияют на жизнедеятельность почвенной биоты, загрязняют сельскохозяйственную продукцию (Черненькова, 1986; Clemens, 2002; Memon et al., 2001; Hall, 2002; Казнина и др., 2005; Титов и др., 2007; Головко и др., 2008)
К тяжёлым металлам условно относят ряд химических элементов, обладающих атомной массой свыше 50, и относимых к группе металлов и металлоидов. (Добровольский, 1980; Ягодин и др., 1990; Авцын и др., 1991; Панин, 2000; Давыдова, 2002). Среди загрязнителей окружающей среды их считают наиболее опасными, поскольку избыток металлов в экосистемах, появляющийся в результате антропогенного воздействия, часто вызывает необратимые изменения и нарушения жизненно важных функций у большинства организмов. К общим особенностям, характерным для токсического действия большинства тяжелых металлов, также относится нарушение минерального питания, водного режима, фотосинтеза и морфогенеза (Rao, Sresty, 2000; Baccouch et al., 2001; Parida et al., 2004).
Тяжёлые металлы неравномерно распределены в природных средах. В районах рудных месторождений концентрации таких тяжёлых металлов как Cu, Pb, Zn, Mo, Ni и др. могут в сотни раз превышать фоновые значения. При этом в среднем их содержание в окружающей среде часто невысоко. В то же время интенсивное развитие современной промышленности и сельского хозяйства обусловливает постоянное увеличение их содержания в окружающей среде (Авцын и др., 1991; Ильин, Сысо, 2001; Орлов и др. 2002; Добровольский, 2004). Среди тяжёлых металлов токсичными для растений являются Hg, Cu, Ni, Pb, Co, Cd, Ag, Bi и Sn. Фитотоксичное влияние тяжёлых металлов обычно проявляется в условиях высокого загрязнения ими почв, причём такое воздействие во многом обусловлено свойствами и особенностями конкретного металла. Это связано, во-первых, с химическими особенностями металлов (Christofaki, 2011), во-вторых, с отношением организмов к ним и, в-третьих, условиями среды (физико-химическими особенностями почвы, температурного и водного режима и т.д.). Исследования последнего десятилетия все сильнее подтверждают важную биологическую роль многих металлов (Christofaki, 2011).
В результате многочисленных исследований установлено, что влияние металлов проявляется разнообразно и зависит от их содержания в окружающей среде, а также необходимости для физиолого-биохимических процессов в растениях, животных и человеке (Алексеев, 1987; Ильин, 1991; Ильин, Сысо, 2001). В связи с этим можно проследить некоторые черты специфического действия Ni, обусловленные своеобразием его физико-химических свойств.
Накопленные экспериментальные результаты позволили сформулировать теоретические представления о физиологических последствиях влияния тяжелых металлов на растения (Prasad, 2010). В соответствии с этой концепцией тяжелые металлы делят на две группы. Для первой (физиологически значимой) группы различают пять зон концентраций, которые соответствуют: (1) пределу концентраций, при которых нехватка металла не позволяет развиваться растению; (2) участку дефицитных концентраций металла, при которых рост и развитие растения ограничены; (3) – зоне оптимальных концентраций металла, обеспечивающих реализацию оптимальных физиологических процессов и биохимических реакций; (4) – токсическим концентрациям металла, приводящим к ограничению роста и развития растений; и (5) – летальным концентрациям металла, вызывающим необратимые повреждения, приводящие к невозможности развития растений и их гибели.
Для другой группы металлов различают три зоны концентраций металлов: (1) – в которой жизнеспособность растений обеспечивается механизмами видовой устойчивости; (2) – зона токсических концентраций, при которых растение достоверно меняет свои морфологические и физиолого-биохимические параметры, но еще сохраняет жизнеспособность и может давать потомство; и (3) – зона летальных концентраций металлов, приводящих к невозможности роста и развития растений и их гибели.
Особый интерес подобные исследования представляют для растений, имеющих важное сельскохозяйственное значение, как источников кормов для животных и пищевых продуктов для человека. При этом часто не известен даже порядок концентраций такого металла, при котором его положительное необходимое присутствие сменяется негативным и даже губительным воздействием на растения.
Несмотря на большой экспериментальный материал, накопленный в этой области, до сих пор отсутствовали какие-либо исследования, позволяющие оценить концентрационные пределы для описанных выше зон влияния тяжелых металлов на жизнеспособность растений. Часто исследователи изучают влияние 2-4 близких (в пределах одного порядка) концентраций металла на физиологию и биохимию растений (Nasibi et al., 2013; Pandey, Gopal, 2010; Черемисина, 2014). При этом исследователи обычно не объясняют причины выбора концентраций тяжелых металлов для эксперимента.
Определение никеля в проростках вики атомно-абсорбционным методом
На процессы ПОЛ существенно влияют низкомолекулярные антиоксиданты. К ним относятся разнообразные соединения - глутатион, аскорбат, токоферолы, каротиноиды, полиамины, некоторые аминокислоты и др. В целом все эти вещества можно подразделить на две группы: водорастворимые антиоксиданты (гидрофильные) и антиоксиданты липидной фазы (гидрофобные) (Кошкин, 2010).
Аскорбиновая кислота присутствует в хлоропластах, митохондриях и других структурах, а также в межмебранном пространстве клеточных органелл (Smirnoff, 1996). Аскорбиновая кислота способна напрямую реагировать с супероксид- и гидроксильным радикалами. В процессе перекисного окисления липидов она осуществляет регенерацию токофероксильного радикала с последующими образованиями монодегидроаскорбата и дегидроаскорбата, которые восстанавливаются в ферментативных реакциях соответствующими редуктазами (Меньщикова, 1993). Удаление АФК у растений может осуществляться при помощи каротиноидов, которые являются эффективными антиоксидантами. Их роль проявляется, в основном, в ингибировании синглетного кислорода, но они могут обезвреживать и пероксирадикалы (Стржалка и др., 2003). Показано, что каротиноиды тушат 1О2 главным образом по физическому механизму. Антиокислительная функция этих веществ состоит также в том, что они – тушители триплетного состояния хлорофилла, являющегося одним из источников образования 1О2.
Особое внимание среди низкомолекулярных антиоксидантов занимает пролин, т.к. его концентрация в растительных клетках возрастает при действии многих известных стрессовых факторах, таких как холод (Синькевич и др., 2009), засуха (Tyagi et al., 1999), присутствие в среде тяжелых металлов (Шевякова и др., 2003; Холодова и др., 2005), воздействие ультрафиолета (Радюкина и др., 2008). Известно, что накопление пролина, вызванное стрессом, в растительных клетках вызывает многообразное действие на весь метаболизм клетки, благодаря чему растения адаптируются к неблагоприятным условиям. Оно проявляется в защите белков, ферментов, ДНК и клеточных компонентов от инактивации (Кузнецов, 2005).
Считается также, что среди химических свойств пролина, важная роль принадлежит его способности «тушить» синглетный кислород ( O ) и гидроксил радикал (OH), в результате чего его относят к группе низкомолекулярных антиоксидантов (Smirnoff, 1993; Matysik et al., 2002).
Фенольные соединения чрезвычайно широко распространены в растительном мире и представлены постоянной группой органических соединений, характерных не только для каждого растения, но и каждой растительной клетки. Они участвуют в процессах фотосинтеза и дыхания, являясь компонентами электрон-транспортных цепей митохондрий и хлоропластов, обеспечивают прочность растительных тканей и клеток, за счет отложения в клеточных стенках полимера фенольной природы – лигнина, а также выступают в роли антиоксидантов, защищая растение от действия некоторых стрессовых факторов (Артемкина, 2010). Благодаря активному участию в окислительно-восстановительных процессах, эта группа веществ также играет роль поглотителей ультрафиолетовых лучей, предохраняя тем самым молекулы пигментов от фотоокисления. В связи с этим накопление фенолов у растений является одним из механизмов защиты от окислительного повреждения, в первую очередь, главного поставщика энергии и метаболитов – фотосинтетического аппарата в неблагоприятных условиях. При этом негативные внешние факторы вызывают усиление синтеза всех фенольных соединений, в том числе их наиболее обширной группы – флавоноидов (Loponen, 2001). Флавоноиды характеризуются способностью оказывать влияние на ход самых разнообразных физиологических процессов с помощью различных механизмов (Запрометов, 1993). Антиоксидантная активность фенольных соединений в отношении тяжелых металлов объясняется тем, что они связывают ионы в устойчивые комплексы, снижая тем самым вредное влияние таких элементов на физиологические процессы.
Таким образом, проблема прямого и опосредованного влияния тяжелых металлов на процессы, протекающие в живом организме, является многоплановой. При этом, несмотря на общий значительный вал информации, до сих пор многие моменты остаются неясными. Особенно это касается вопросов формирования жизнеспособных организмов в условиях техногенного или природного загрязнения среды. Часто не известно, как происходит прорастание семян растений (особенно важных сельскохозяйственных культур) в таких условиях, как меняются физиолого-биохимические показатели формирующихся проростков. В этом аспекте пристальный интерес привлекает исследование влияния функционально и метаболически значимых для организма тяжелых металлов. При этом часто не известен даже порядок концентраций такого металла, при котором его положительное необходимое присутствие сменяется негативным и даже губительным воздействием. Всё это определило постановку цели и задач настоящего исследования.
Исследование морфогенеза проростков вики и особенностей водного обмена на ранних этапах онтогенеза при различных концентрациях ионов никеля
При выращивании растений с добавлением ацетата никеля сырая масса корневой системы при концентрациях 1-100 мкМ находилась на уровне контроля, а дальнейшее повышение концентрации соли приводило к резкому уменьшению исследуемого показателя (рис. 9). Нитрат никеля оказывал наименьшее ингибирующее воздействие на развитие корневой системы вики, которая до концентрации 1000 мкМ находилась выше уровня контроля. Концентрации солей никеля 5000 и 10000 мкМ, как было отмечено выше, оказались летальными для растений.
Зависимости накопления сухой биомассы корневой системы были в целом похожими для всех исследованных солей никеля (рис. 10). Вариации в присутствии нитрата никеля при концентрации 100 мкМ могут быть объяснены стимулирующим влиянием ионов нитрата.
Анализируя полученные результаты, можно придти к выводу о том, что разные анионы существенно влияли на зависимости, отражающие формирование биомассы корневой системы. Такая картина чрезвычайно затрудняет интерпретацию результатов в отношении ионов никеля. Полученные данные позволяют говорить о том, что на формирование корневой системы чрезвычайно (если не более) существенное влияние оказывают именно анионы. По-видимому, они влияют на перераспределение веществ, образующихся в ходе прорастания семян вики и используемых для анаболических и энергетических процессов в формирующихся тканях стебля и корня. При этом положительное влияние хлорида никеля, скорее, обеспечивается влиянием ионов хлора на водный баланс. Аналогичное действие показывал и нитрат никеля. При этом известная сигнальная роль ионов нитрата также могла вносить свой вклад в наблюдаемые процессы.
Анионы ацетата негативно влияли на сырую массу формирующейся корневой системы, по-видимому, из-за нарушения ионного баланса, что существенно отражается на состоянии водного баланса, который обычно формируется и поддерживается не только за счёт неорганических катионов, но и анионов. С другой стороны, такая картина, напротив, почти не отражается на величине сухой массы корневой системы, и даже способствует стабилизации этого показателя. Однако дальнейшие исследования в прояснении описанной картины выходят за рамки настоящего исследования.
В завершение работы анализировали картину отношения сырой массы стебля к сырой массе корневой системы, а также соотношения показателей сухой биомассы указанных органов проростков вики в условиях эксперимента. Было установлено, что присутствие ионов ацетата в сравнении с другими солями в большей степени способствовало формированию сырой массы стебля, чем корневой системы. Для хлорида и нитрата никеля зависимости имели сходный характер. Необычное увеличение сухой биомассы в присутствии хлорида никеля, обнаруженное ранее (Абрамова, Иванищев, 2012, б), в более слабой форме повторилось в присутствии других исследованных солей. Полученные результаты позволяют говорить о том, что при возрастании концентрации солей ионы никеля способствовали вначале предпочтительному формированию корневой системы, и далее – формированию стебля. Снижение отношения при существенном росте концентрации солей можно объяснить возрастанием их ингибирующего влияния в большей степени на процессы формирования стебля.
Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать следующие выводы: активирующее влияние невысоких концентраций ионов никеля может нивелироваться влиянием неорганических или органических анионов; влияние высоких концентраций хлорида никеля на водоудерживающую способность проростков вики можно объяснить, присутствием ионов хлора; негативное влияние высоких концентраций солей никеля на показатели роста и развития растений связаны, с действием ионов металла, а не неорганических анионов.
Следует отметить, что до концентрации примерно 50-100 мкМ наблюдали более высокие, чем в контроле, или близкие к нему показатели роста и развития корневой системы. Возможно, что это связано с активацией уреазы, обеспечивающей метаболизм токсичных соединений азота, образующихся при метаболизме запасных белков семян вики. При этом стимуляцию наблюдали в течение всего периода эксперимента – на третий, седьмой и двенадцатый дни прорастания. Кроме увеличения длины главного корня происходило нормальное развитие боковых корней и их ветвление. Боковые корни у проростков, инкубированных в присутствии NiCl2 в нелетальных концентрациях, спустя первые трое суток эксперимента появлялись в то же время, что и у корней в контрольных пробах.
Дальнейшее увеличение концентрации ионов никеля приводило к снижению исследуемого показателя, что связано с токсическим действием металла. При концентрации соли никеля выше, чем 50 мкМ, корни останавливали свой рост в течение первых 7 суток. В то же время его ветвление не замедлялось, несмотря на ингибирование роста главного корня. Наибольшее ингибирование роста главного корня наблюдали при концентрациях соли никеля, близких к летальным. При этом на растворах с концентрациями NiCl2 5000 и 10000 мкМ зародышевый корень растений развивался очень плохо или совсем не развивался. На седьмой день при этих концентрациях соли никеля корни растений теряли тургор и часто были окрашены в бурый цвет, что указывает на гибель клеток данного органа. Корневые волоски были не различимы. Боковые корни практически не развивались.
Наряду с влиянием на рост и развитие корня, никель способен оказывать тормозящее действие на рост и развитие побегов (Серегин, Кожевникова, 2006). Как показали наши исследования, реакция побегов Vicia sativa L. на действие хлорида никеля, так же как и корня, зависела от концентрации и продолжительности воздействия раствора соли (рис. 14-16).
Определение содержания высокомолекулярных компонентов антиоксидантной защиты
Проведенное исследование показало, что при концентрациях хлорида никеля в диапазоне концентраций 1-1000 мкМ происходило вначале уменьшение содержания флавоноидов в проростках вики в сравнении с контролем, а при наибольшей концентрации в 1000 мкМ наблюдали увеличение исследуемого параметра (рис. 36).
Меньшее содержание веществ этой группы при концентрациях хлорида никеля в 1-10 мкМ можно объяснить более высокими скоростями морфогенеза растений, чем синтеза исследуемой группы веществ, а также, возможно, слабым проявлением окислительного стресса в проростках вики (п. 3.3) и, следовательно, невостребованностью флавоноидов в качестве элементов антиоксидантной защиты. При начальных концентрациях хлорида никеля, по-видимому, включаются другие низкомолекулярные элементы защиты – аскорбиновая кислота, каротиноиды (Абрамова, Иванищев, 2012, г), а также каталаза (п. 3.4.2.). Далее (выше, чем 100 мкМ хлорида никеля) скорость образования флавоноидов была более высокой, что, отчасти, помогало проросткам сохранять свою жизнеспособность. При концентрации хлорида никеля в 10000 мкМ растения в абсолютном большинстве погибали (Абрамова, Иванищев, 2012, б). Относительно более высокое содержание флавоноидов отмечено для побега, как в контрольном варианте, так и в большинстве опытных образцов (рис. 37).
Содержание флавоноидов в побеге и корне вики в присутствии ионов никеля (К – контроль) Такие результаты вполне объяснимы, поскольку основные биосинтетические процессы этой группы веществ протекают именно в надземной части растений (Запрометов, 1996). Сравнивая полученные результаты с имеющимися литературными данными можно отметить, что синтез фенольных соединений в присутствии хлорида никеля относят к неспецифической ответной реакции растений, поскольку аналогичные изменения характерны для разнообразных видов стрессов растений (Артемкина, 2010; Немерешина, Гусев, 2004).
Обсуждая полученные результаты в свете значимости низкомолекулярных компонентов системы антиоксидантной защиты формирующихся проростков вики, можно придти к заключению о том, что первоначально в антиоксидантную защиту включаются, по-видимому, аскорбиновая кислота и каротиноиды. При этом роль фенольных соединений в этом аспекте возрастает при более высоких концентрациях хлорида никеля. Содержание пролина Пролин образуется при ряде видов стрессов и его защитная роль объясняется его способностью действовать как осмопротектор, стабилизатор мембран и уничтожитель активных форм кислорода (2001-2002). При действии ТМ происходит накопление свободного пролина в растении (2002). Пролин синтезируется при стрессе и помогает избегать цитоплазматический ацидоз и повышает соотношение НАД+/НАДФН до величин совместимых с метаболизмом (1997)
Показано, что содержание пролина в побегах возрастало примерно в 2,5 раза в сравнении с контролем при концентрации хлорида никеля, равной 10 мкМ, после чего показатель снижался, но всё равно вдвое превышал контроль при концентрации 1000 мкМ (рис. 38). (К – контроль) По литературным данным содержание пролина в растениях может существенно различаться. Так, содержание пролина в растениях пшеницы составляло 0,7-1,6 мг/г сырой массы (Muslu, Ergun, 2013), в проростках тритикале – 0,15-0,45 мг/г (Жуков, 2013), в листьях табака – 1,38-4,6 мг/г (Christofaki, 2011). Другие авторы обнаруживают гораздо меньшие количества этой аминокислоты. Например, в растениях конопли оно составляло 0,065 мг/г (Солдатова, Хрянин, 2008), а в сорняке – черная белена – всего 0,017 мг/г (Nasibi et al., 2013).
Присутствие тяжелых металлов в корнеобитаемой среде приводит к увеличению содержания пролина в 1,3-2 раза (Солдатова, Хрянин, 2008; Christofaki, 2011; Khatamipour et al., 2011; Rastgoo, Alemzadeh, 2011; Singh et al., 2012; Nasibi et al., 2013). Результаты исследования (рис.38) показывают, что широкий спектр концентраций хлорида никеля в среде приводил к колебаниям величины содержания пролина, которая однако менялась в тех же пределах, что и в исследованиях других авторов, использовавших всего 2-3 мало различающиеся концентрации тяжёлых металлов.
Наложение этой картины изменений содержания пролина на данные физиолого-биохимических изменений проростков вики (Абрамова, Иванищев, 2013б) показало, что в целом подобные изменения вполне согласуются. Они касаются того, что уже при концентрации 10 мкМ хлорида никеля в среде можно говорить о потенциально повышенном количестве соли никеля, приводящей к увеличению содержания пролина примерно в 2,5 раза. По-видимому, такое возрастание позволяло поддерживать мембраны в удовлетворительном состоянии, о чём свидетельствует минимальная величина перекисного окисления липидов при этой концентрации соли никеля (Абрамова, Иванищев, 2013б). Эти же данные косвенно подтверждают значение пролина для поддержания структуры и функции мембран (Sharma, Dietz, 2006; Mohammadi et al., 2013).
Дальнейшее увеличение соли никеля в среде приводило к некоторому снижению содержания пролина вследствие, активной работы иных компенсаторных механизмов (Абрамова, Иванищев, 2013).
Таким образом, показано, что изменения содержания пролина в побегах вики в условиях возрастающих концентраций ионов хлорида никеля в среде в целом согласовывается с изменениями морфологии, физиологических процессов и биохимических реакций проростков вики (Абрамова, Иванищев, 2013).
Для регулирования уровня АФК и избегания окислительных повреждений у растений присутствует комплекс антиоксидантных защитников, включающих не только низкомолекулярные вещества, но и специфические ферменты. Одним из ключевых ферментов является каталаза. Исследование показало, что в тканях формирующихся листьев проростков присутствует весьма значительная активность фермента (рис. 39).
Максимум активности каталазы соответствовал 1 мкМ содержания никеля в среде. При концентрациях 10 мкМ и далее активность каталазы находилась на уровне контроля с тенденцией к уменьшению (рис. 39). Считается, что каталаза является незаменимой при детоксикации АФК, образующихся при стрессе, когда уровни АФК достаточно высоки (Mittler, 2002). Анализируя полученные результаты в свете таких представлений, кажется, что уже при минимально изученной концентрации хлорида никеля в исследуемом нами объекте образуются избыточные количества перекиси, нейтрализуемые каталазой до уровня контроля. Дальнейшее возрастание образующейся перекиси водорода сопряжено со снижением активности каталазы (рис. 39), используемой для нейтрализации указанной АФК. Последующее снижение активности фермента свидетельствует об исчерпании имеющегося пула фермента, активность которого всё же достаточна, чтобы не позволить перекиси водорода накапливаться более чем вдвое против контроля (рис. 30).
Помимо каталазы, локализованной в пероксисомах, в детоксикации перекиси водорода важную роль играют пероксидазы, присутствующие во многих компартментах клеток (Mittler, 2002). В связи с этим, пероксидаза также защищает растительный организм от окислительной деструкции. При определении активности гваяколовой пероксидазы было установлено, что ее активность в формирующихся проростках вики, выращенных при исследованных концентрациях хлорида никеля, не существенно возрастала в сравнении с контрольным вариантом (рис. 40).