Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 12
1.1 Фунгицидные препараты и их роль в сельском хозяйсте
1.1.1 Современное состояние рынка фунгицидных препаратов и некоторые исторические аспекты их создания
1.1.2 Классификация и характеристика основных групп фунгицидов
1.1.3. Природные серосодержащие соединения с фунгицидными и антибиотическими свойствами
1.1.4 Фунгицидные свойства синтетических серосодержащих органических соединений и их производных
1.1.5 Аминосульфидные соединения и их биологическая роль 27
1.1.6 Синтез 1,3-аминосульфидных соединений 28
1.1.7 Производные тиомочевины 30
118 Синтез производного бисамина и тиомочевины N,N бис(диметиламинометил)-тиомочевинощавелевокислый] сульфат меди пентагидрата
1.2. Влияние фунгицидных препаратов на мор- фометрические и физиологические процессы растений
1.3. Физиолого-биохимические механизмы устойчивости растений к фитопатогенам
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследований 52
2.1 Объекты исследований 52
2.2 Характеристика используемых препаратов 52
2.3.1 Условия проведения исследований по оценке биологической активности солей 1,3-аминосульфидов
2.3.2 Условия проведения исследований по оценке фунгицидной активности 1,3-аминосульфида, «Бисола», «Купробисана», «БТМ» и «Биодукса»
2.3.3 Условия проведения исследований по оценке влияния 1,3- аминосульфида, «Бисола», «Купробисана», «БТМ» и «Био-дукса» на антиоксидантную систему проростков пшеницы
2.3.4 Условия проведения исследований по оценке влияния 1,3- аминосульфида, «Бисола», «Купробисана», «БТМ» и «Био-дукса» на уровень содержания фитогормонов в проростках пшеницы
2.3.5 Условия проведения исследований по оценке биологиче- 57 ской эффективности 1,3-аминосульфида, «Бисола», «Купро-бисана», «БТМ» и «Биодукса», а также влияния предпосевной обработки на показатели продуктивности растений пшеницы в полевых условиях
2.4 Методы исследований 58
2.4.1 Определение лектиновой активности 58
2.4.2 Метод лазерной спектрофотометрии 59
2.4.3 Определение скорости образования супероксид-аниона 60
2.4.4 Определение активности супероксиддисмутазы 61
2.4.5 Определение малонового диальдегида в растениях 62
2.4.6 Определение активности пероксидазы и каталазы
2.4.6.1 Определение активности гваяколпероксидазы 63
2.4.6.2 Определение активности каталазы 64
2.4.7 Определение содержания перекиси водорода 64
2.4.8 Определение уровня содержания фитогормонов 65
2.4.8.1. Выделение, очистка и концентрирование гормонов 65
2.4.8.2 Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА) 66
2.4.9 Определение содержания микроэлементов 66
2.4.10 Определение содержания глюкозы 67
2.4.11 Статистическая обработка результатов 67
ГЛАВА 3 Результаты исследований и их обсуждение
3.1 Сравнительная оценка биологической активности 1,3- 68 аминосульфидов по отношению к возбудителям корневых гнилей зерновых культур
3.2 Оценка in vitro фунгицидной активности 1,3-аминосульфида 86 и N,N–бис(диметиламинометил)-тиомочевины по отношению фитопатогенным грибам Fusarium graminearum Schwabe и Bipolaris sorokiniana (Sacc.)
3.3 Влияние предпосевной обработки 1,3-аминосульфидом и 92 N,N–бис(диметиламинометил)-тиомочевиной на состояние антиоксидантной системы растений пшеницы
3.4 Изучение особенностей формирования ответной реакции 104 гормональной системы проростков пшеницы на предпосевную обработку семян 1,3-аминосульфидом и N,N– бис(диметиламинометил)-тиомочевиной
3.5 Влияние предпосевной обработки семян 1,3- 117 аминосульфидом и N,N–бис(диметиламинометил)-тиомочевиной на рост, развитие, продуктивность растений пшеницы в полевых условиях
Заключение 125
Выводы 129
Библиографический список
- Классификация и характеристика основных групп фунгицидов
- Влияние фунгицидных препаратов на мор- фометрические и физиологические процессы растений
- Условия проведения исследований по оценке биологической активности солей 1,3-аминосульфидов
- Изучение особенностей формирования ответной реакции 104 гормональной системы проростков пшеницы на предпосевную обработку семян 1,3-аминосульфидом и N,N– бис(диметиламинометил)-тиомочевиной
Введение к работе
Актуальность исследований. Вопросы защиты сельскохозяйственных растений являются актуальными, так как ежегодно от инфекционных болезней растений Россия теряет от 8.5 до 25 млн. т. зерна (Санин и др., 2002; Лысенко, Ефимов, 2007; Овсянкина, 2012). Наиболее опасными и распространенными болезнями зерновых, как известно, являются разные виды ржавчины, корневые гнили, септориозы, снежная плесень, мучнистая роса и др. На их долю приходится до 75% потерь урожая (Глинушкин, 2013). Известно, что через семена передается более половины всех болезней растений (Bastmeyer, et al., 2002; Duncan, Howard, 2010; Bostanova et al., 2014). Основная мера борьбы в современном растениеводстве против фузариозных корневых гнилей - предпосевная обработка семян фунгицидными препаратами. Однако, несмотря на существование большого количества фунгицидов, поиск и синтез новых препаратов с годами не теряет своего значения (Ганиев, Недорезков, 2006.). Это связано с тем, что длительное и широкомасштабное применение фунгицидов может приводить к появлению резистентных форм патогенных микроорганизмов и привести к снижению эффективности фунгицидных обработок (Тютерев, 2001; Шилкина, 2004, Fernandez-Ortuno et al., 2015; Hollomon, 2015).
Многолетние и разносторонние исследования, связанные с изучением устойчивости растений к фитопатогенам позволили прийти к заключению, что наиболее перспективными и экологически безопасными являются препараты, способные на активацию неспецифических систем устойчивости растений, стимулирование защитных реакций и управление иммунной системой растения (Шакирова, 2001). Снижение эффективности существующих средств защиты растений от болезней заставляет разрабатывать более совершенные соединения с широким спектром действия и новые технологии их применения.
В Институте нефтехимии и катализа РАН был осуществлен синтез серосодержащих аналогов препаратов «Бисол» и «Купробисан» и на их основе получены стабильные водорастворимые соли с щавелевой кислотой и медным купоросом (патент РФ № 2538601, 2015; № 2541532, 2015; № 2541535, 2015). 1,3-аминосульфиды были получены реакцией бисамина и дитиолов (Хайруллина и др. 2012; Акманов, 2014). Было получено также и производное бисамина и тио-мочевины (N,N–бис (диметиламинометил) - тиомочевина) (БТМ) (патент РФ № 2536404, 2014).
Согласно вышесказанному, оценка биологической активности синтезируемых соединений и изучение их влияния на активность физиолого-биохимических процессов сельскохозяйственных растений является важной и актуальной задачей.
Цель исследования: выявление особенностей влияния предпосевных обработок солями 1,3-аминосульфидов и N,N–бис (диметиламинометил) - тиомо-чевиной на физиолого-биохимические процессы растений пшеницы, а также определение их биологической и фунгицидной активности по отношению к возбудителям корневых гнилей пшеницы.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
провести сравнительную оценку биологической активности ряда синтезированных водорастворимых солей на основе 1,3-аминосульфидов по отношению к возбудителям корневых гнилей пшеницы;
исследовать in vitro фунгицидную активность 1,3-аминосульфида и N,N– бис (диметиламинометил) - тиомочевины по отношению фитопатогенным грибам Fusarium graminearum Schwabe и Bipolaris sorokiniana (Sacc.);
изучить влияние предпосевной обработки 1,3-аминосульфидом и N,N– бис (диметиламинометил)-тиомочевиной на состояние про/-антиоксидантной системы растений;
изучить особенности формирования ответной реакции гормональной системы проростков пшеницы на предпосевную обработку семян 1,3-аминосульфидом и N,N–бис (диметиламинометил)-тиомочевиной;
оценить характер влияния предпосевной обработки 1,3-аминосульфидом и N,N–бис (диметиламинометил)-тиомочевиной на морфометрические показатели растений, фитосанитарное состояние и урожайность посевов яровой пшеницы.
Научная новизна исследований. Установлена биологическая активность некоторых водорастворимых солей 1,3-аминосульфидов по отношению к возбудителям корневой гнили пшеницы. Впервые показано, в условиях in vitro, что соединение N,N–бис (диметиламинометил) - тиомочевина обладает фунгиста-тичной активностью по отношению к фитопатогенным грибам Bipolaris sorokiniana (Sacc.). Предпосевная обработка семян соединениями N,N–бис (диме-тиламинометил) - тиомочевина и 1,3-аминосульфид III приводила к генерации АФК и активации ферментов антиоксидантной системы, что способствует формированию устойчивости растений к фитопатогенным грибам. Обработка семян соединением N,N–бис (диметиламинометил) - тиомочевиной стимулировала рост уровня содержания АБК у проростков пшеницы, что также может способствовать формированию более высокой антифунгальной устойчивости растений.
Практическая значимость работы. В полевых условиях установлено
ростстимулирующее действие соединения 1,3-аминосульфид III, обнаружено
увеличение всхожести семян пшеницы под действием соединений N,N–бис
(диметиламинометил) - тиомочевина и 1,3-аминосульфид III. Улучшение
фитосанитарного состояния посевов и повышение биологической
урожайности пшеницы после предпосевной обработки соединением N,N–бис (диметиламинометил) - тиомочевина позволяют рассматривать возможность использования его в современных технологиях защиты растений от фитопатогенных грибных болезней.
Материалы исследований могут использоваться в качестве учебного материала при преподавании дисциплин: физиология растений, фитопатология и защита растений.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались: в материалах VII Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступбіології» (Львів, 2011), ІII Международной научно-практической конференции «Достижения и перспективы естественных и технических наук:
(Ставрополь, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы нано- и микроэлектроники» (Уфа, 2012), ІІ Міжнародної конференції, присвяченої 25-річчю біологічного факультету «Сучасні проблеми біології, екології та хімії» (Запоріжжя, 2012), международной научной конференции «Проблемы микологии и фитопатологии в ХХI веке» (СПб, 2013), конференции с международным участием «Современные проблемы биохимии и биотехнологии» (Уфа, 2013), III Международном микологическом форуме «Современная микология в России» (Москва, 2015).
Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Исследования проводились в рамках планов НИР кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВО БашГУ, госзадания № 01201456413 Министерства образования и науки РФ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ и 4 патента.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического списка, включающего 273 источника литературы. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков и 15 таблиц.
Классификация и характеристика основных групп фунгицидов
В 1755 году Тиллету была присуждена премии Королевской академии литературы, науки и искусства в Бордо за публикацию материала по этиологии твердой головни пшеницы и способам защиты. Тиллт описал лишь семенной механизм передачи болезни (Голышин, 1993). Превост впоследствии установил значение спороношения при первичной инфекции (Waxman,1998). Независимо друг от друга Шалтесом в 1761 году и Тессиром в 1783 году для протравливания семян пшеницы было предложено сульфат меди (Голышин, 1993; Попов, 2003).В 1807 г. Превостом были заложены основы лабораторных испытаний фунгицидов, результатом которых стала публикация данных о головневых болезнях пшеницы и борьбе с ними, а также о действии сульфата меди и температуры на прорастание хламидоспор головни (Waxman,1998).
Применение пестицидов в середине 20 века практически стало безальтернативным методом достижения высокой экономической эффективности в борьбе с вредителями и болезнями сельскохозяйственных культур. Большой вклад в развитие защиты растений внесли Р. Д. О Бриена, Дж. Г. Хорсфолла, Р. Л. Меткалфа (США), Э. Ю. Спенсера (Канада), Г. Мартина (Великобритания), Г. Унтерстенхёфера (ФРГ), Г. Д. Угрюмова, А. Н. Несмеянова, А. М. Ильинского и др. (СССР) (Усиченко, 2012). Применение любого химического вещества поднимает вопрос о его рисках и преимуществах. Большинство исследований пришли к выводу, что польза от фунгицидов перевешивают риски, если они тщательно используются в соответствии с рекомендациями на этикетке. Использование фунгицидов в сельском хозяйстве США позволила увеличить доходы фермерских хозяйств почти на 13 млрд. долларов в год (Gianessi, Reigner, 2006).
Таким образом, приведенная хронология показывает, что проблема защиты растений существует со времен окультуривания растений, возникновения земледелия и по сей день. Основное количество применяемых сейчас фунгицидов было синтезировано еще в XX веке. При помощи современных монокомпонентных и комбинированных препаратов удается добиться значительных успехов в защите растений от заболеваний. При разумном подходе пестициды могут служить орудием созидания, а не разрушения, и направлять функционирование системы «агроциноз» в сторону, благоприятную для урожая, при одновременном сохранении и даже повышении устойчивости системы (Шаповал, 2008).
В.М. Долженко с сотрудниками (2011), характеризуя химическую защиту растений в Российской Федерации с 1990-2010 года, отметили увеличение объемов их применения. Наибольшим спросом пользуются гербициды, на которые приходится около 66% спроса, второе место прочно удерживают фунгициды с долей в потреблении в 22%. В.А. Захаренко (2013) отмечает значительное обновление ассортимента средств химической защиты в период с 2001 по 2010 года. В 2001 году он включал 500 препаратов, в 2010 году их число достигло 890. Важно отметить, что модернизация ассортимента этой группы пестицидов превзошла по таким показателям, как снижение токсической нагрузки и нормативов расхода. Так, токсическая нагрузка с показателя 4100 в 1980 году к 2009 году уменьшилась до 620. Средняя норма расхода (л/га) за этот период снизилась в 8 раз: 1989 году – 4,8, 2009 году – 0,6 (Захаренко, 2014). Л.Н. Самойлов и Т.А. Яковлев (2011) отмечают увеличение числа фунгицидов с 1986 по 2010 года на 377 %. В условиях нестабильного рынка для страны с крайне неблагоприятным фитосанитарным состоянием важно располагать более устойчивой системой формирования рынка препаратов отечественного производства, гарантированным ассортиментом и объемом пестицидов для смягчения фитосанитарных чрезвычайных ситуации в стране (Захаренко, Захаренко, 1995)
В мировом земледелии объём применения химических средств защиты растений, используемых для борьбы с вредными организмами, постоянно растёт. Если в 1945 году ёмкость пестицидного рынка в стоимостном исчислении оценивалась в 0.2 млрд. долл., то к 2000 году эта цифра увеличилась до 27.8 млрд. долларов, а в 2010 году она перевалила за отметку 40.5 млрд. долларов. Планируемый объём производства пестицидов в 2017 году прогнозируется на уровне 68.5 млрд. долларов (Захаренко, 2014). По данным исследований «Глобального рынка по производству пестицидов», объем производства пестицидов на мировом рынке к 2019 году планируется довести до 3,2 млн. тонн, по сравнению с 2,3 миллиона тонн в 2013 году (Игнатов, Лазарева, 2013).
В настоящее время в России происходит продвижение возбудителей болезней в новые, более северные, районы. Например, фузариозы колоса (Fusarium spp.) в России ранее были вредоносными только в южных регионах России; сейчас они распространились вплоть до Ленинградской области. Фитофтороз картофеля никогда не наблюдался в Мурманской области, сейчас там эпифитотии повторяются почти ежегодно; то же самое происходит с желтой ржавчиной пшеницы и другими болезнями (Дьяков, 2015).
Известно, что в 2014 г. распространение и развитие вредных объектов отмечалось на среднемноголетнем уровне. Защитные мероприятия проводились на площади 79,5 млн. га. В 2014 году болезни зерновых культур были выявлены на площади 7281,2 тыс. га (в 2013 г. – 6783 тыс. га), с поражением выше уровня экономического порога вредоносности на 3541,4 тыс. га (в 2013 г. - 3483,6 тыс. га). Обработки средствами защиты растений проводились на 10501,9 тыс. га (в 2013 г. – 10227,1 тыс. га). В 2014 г. фузариоз колоса на озимых зерновых культурах (рис. 143) был выявлен на общей площади 816,48 тыс. га (в 2013 г. – 127,55 тыс. га). Площадь фунгицидных обработок озимых зерновых в целом по Российской Федерации составляла 413,33 тыс. га (в 2013 г. - 20,83 тыс. га) (Обзор фитосанитарного состояния посевов сельскохозяйственных культур в РФ в 2014 году и прогноз развития вредных объектов в 2015 г.).
Влияние фунгицидных препаратов на мор- фометрические и физиологические процессы растений
Рядом исследователей показано способность неорганических фосфатов в индуцировании устойчивости у растений (Reuveni et al, 2000). Устойчивость связана с накоплением свободной и гликозилированной салициловой кислоты под влиянием фосфатов и активацией типичных ферментов защиты – пероксидаз и полифенолоксидаз.
Под действием препарата Циркон (комплекс гидрооксикоричных кислот) формируется системная приобретенная устойчивость к болезням. Препарат стимулирует образование ауксинов, а также индуцирует несколько сигнальных систем защитных реакции в растениях в ответ на биогенные и абиогенные стрессы (Малеванная, Алексеева, 2006). Среди многих защитных реакции, индуцируемых цирконом – повышение активности пероксидазы и других ферментов окислительного цикла, приводящих к накоплению АФК, снижению активности каталазы, индуцирование образования фенольных кислот, фитоалексинов, повышение активности полифенолоксидазы, синтеза салициловой кислоты (Малеванная, Алексеева и др., 2006). За счет усиления цирконом фенилпропаноидного метаболизма происходит усиление образование лигнина, укрепление клеточных стенок растительной ткани, что препятствует проникновению патогенов в клетки (Малеванная, Алексеева и др., 2006).
Цитокининподобные антистрессовые препараты группы картолинов оказывают защитное действие на аппарат белкового синтеза, предотвращая деградацию полисом в клетках, повышая активность РНК-полимеразы, обеспечивают большую устойчивость фотосинтетического аппарата растений, подвергнутые действию засухи (Шакирова, 2001). Защитное действие одного из разработанных препаратов – «Картолин-2» в условиях засухи и пониженных температур было изучено в лабораторно-полевых опытах, на фитотроне и в мелкоделяночных полевых испытаниях (Тютерев, 2010). При применении в различных зонах страны «Картолин-2» в дозе 250-500 г/га повышал уро 47 жай зерновых культур: ячменя, пшеницы и ржи на 10-30 % в зависимости от интенсивности стресса (Баскаков, 1988). Изменение уровня АБК является возможным звеном в действии другого триазолового фунгицида - тетраконазола, который рассматривается в качестве активатора защитных реакции растений, как к биотическим, так и абиотическим стрессовым воздействиям (Ronchi et al., 1997). Исследованы молекулярные механизмы взаимоотношения хлопчатника и возбудителя вертициллезного вилта, установлена возможность искусственной стимуляции защитной сверхчувствительной реакции с помощью физиологически активных соединений, таких как «Бисол-1» и «Бисол-2». Проникая в ткань хлопчатника препараты индуцируют синтез фитоалексинов, которые являются природным химическим барьером на пути, вторгшегося патогенна (Толстиков и др., 1989). Это свойство препарата доказано путем проведения серии лабораторных, вегетационных и полевых опытов, на контрастных по вилтоустойчивости сортах хлопчатника и вирулентности рас гриба V. Dahlia (Толстиков и др., 1989). Показано, что препараты высокоэффективны в борьбе с вилтом хлопчатника, снижают степень заболеваемости вилтом в 2-3 раза, повышая урожайность на 2-3 ц/га по сравнению с контролем (Толстиков и др., 1989).
Развитие защитных реакции растений против фитопатогенных грибов во многом определяется запускающими их сигнальными молекулами. К одним из таких молекул относится хитоолигосахариды (ХОС), представляющие олигомерные фракции клеточных стенок хитинсодержащих грибов (Шакирова, 2001). В последние время ХОС широко изучаются в связи с их способностью индуцировать защитные реакции растений – активацию синтеза PR- белков, накопление фитоаллексинов, синтеза лигнина (Яруллина, 2008; Максимов, 2008). Также большой интерес исследователи проявляют к салициловой кислоте (СК) – стрессовому метаболиту, сочетающему свойства сигнального интермедиата и фитогормона (Нужная и др., 2015). Такое внимание к СК обусловлено тем, что она участвует в защитных реакциях при инфицировании растении патогенами (Яруллина, 2008; Максимов, 2008). Еще одной из ключевых молекул системной сигнализации, на активацию защитных механизмов при появлении стрессовых факторов, является жасмоновая кислота (ЖК). Исследователи показывают, что ЖК играет значительную роль в индуцировании системной экспрессии факторов защиты (Колупаев и др., 2013). Было установлено, что ЖК влияет на экспрессию генов липоксигеназы, которая включается в биосинтез октадеканоидов на ранних этапах и участвует в ответах растений на внедрение патогенов (Тарчевский, 2000).
Сафин с соавторами (2012) исследовали влияние индукторов устойчивости (СК, ЖК, ХОС, хитозана) на рост и развитие различных по агрессивности штаммов Septoria nodorum Berk в культуре in vitro. Агрессивные колонии, выросшие на ХОС и хитазане, не отличались от контроля, тогда как размеры слабоагрессивных колоний значительно был меньше. Авторы полагают, что известное свойство хитина и его производных повышать устойчивость растений к болезням, связано не только с активацией защитных реакции растений при их обработке хитоолигосахаридами, но и способностью олигомеров хитина ингибировать рост грибов S. Nodorum (Сафин и др., 2012).
Условия проведения исследований по оценке биологической активности солей 1,3-аминосульфидов
Использование новых химических соединений в качестве фунгицидных препаратов непосредственно затрагивает окислительно-восстановительную систему растений (Jacob, Anwar, 2008). Активные формы кислорода (АФК) занимают особое место среди стрессовых метаболитов (Колупаев, Карпец, 2009). К числу АФК относят производные кислорода радикальной природы -супероксид-радикал, гидропероксидный радикал, гидроксил-радикал, а также – перекись водорода, синглетный кислород и пероксинитрит (Minibayeva et al., 2001).
Усиление образования АФК является одной из наименее специфических реакций живых организмов на действие биотических и абиотических стрессоров (Колупаев, 2007). Химические средства защиты растений вызывают различное по продолжительности увеличение содержания АФК во многих компартментах растительных клеток (Miteva et al., 2003). Совокупность имеющихся данных позволяет считать, что роль АФК в условиях действия патогенов полифункциональна (Колупаев, 2007). Благодаря АФК растение может уничтожить патоген путем окислительного взрыва (Плотникова и др., 2016) и в результате реакции сверхчувствительности сформировать вокруг него зону из мертвых растительных клеток, насыщенных антимикробными соединениями (Максимов, Черепанова, 2006).
Целью данного этапа исследования было определение влияния потенциальных фунгицидов: соединения 1,3-аминосульфид III и «БТМ», а также известных препаратов «Бисол», «Купробисан», «Биодукс» на состояние про-/антиоксидантной системы здоровых растений, функционирование системы образования и разрушения некоторых АФК и эффективность её работы по накоплению продукта перекисного окисления липидов - малонового диальде-гида (МДА), а также их влияния на морфометрические показатели растений. Как известно, рост является интегральной характеристикой физиологического состояния растений (Медведев, 2013). В основе его изменений могут быть различные процессы: нарушение фотосинтеза, поглощения воды, минерального питания и др.
Проведенные исследования показали, что изменения в антиоксидантной системе яровой пшеницы под действием изучаемых веществ носили органос-пецифический характер, а изменения в системе морфофизиологических параметров растений пшеницы были разнонаправлены. Так определение длины побега и корней показало, что стимуляция роста побега в длину наблюдалась при использовании препаратов «Биодукс» и «Бисол» и соединения 1,3-аминосульфид III (таблица 7). При обработке соединением «БТМ» наблюдалось ингибирование роста побега и корней. Практически на уровне значений контроля, были ростовые данные полученные после обработки семян препаратом «Купробисан».
Увеличение сырой массы корней и побегов наблюдалось при действии препарата «Биодукс» и соединения 1,3-аминосульфид III (таблица 7). У растений, выросших после замачивания семян препаратом «Купробисан», «Би-сол» и соединением «БТМ», масса побега и корней были на уровне или ниже контрольных значений.
Таким образом, можно отметить, что в данной серии экспериментов, лучшими рострегулирующими свойствами обладают препарат «Биодукс» и соединение 1,3-аминосульфид III.
Основными антиоксидантными ферментами являются супероксиддис-мутаза (СОД), каталаза, пероксидазы, ферменты аскорбат-глутатионового цикла, некоторые трансферазы (Колупаев и др., 2011).
Проявление про-/антиоксидантных эффектов СОД и отдельных форм пероксидазы, вероятно, определяется конкретной ситуацией в клетке или в определенном её компартменте: содержанием восстановителей, сбалансированностью работы с другими ферментами и т.д. (Колупаев, Ястреб, 2015). Поэтому, для выводов о причастности изменений активности того или друго 94 го фермента к накоплению/разрушению АФК необходимо одновременное изучение по крайней мере нескольких компонентов про-/антиоксидантной системы (Колупаев, 2007). Считается, что взаимодействие АФК и антиокси-дантов (АО) является важной составляющей сигналинга, регулирующего экспрессию генов и обеспечивающего адаптивную гибкость организма (Gill, Tuteja, 2010). Известно, что супероксид-анион может иметь свои сенсоры, которые выполняют регуляторную роль (Колупаев, Карпец, 2008).
Контроль 5.2±0.2 3.6±0.1 43.3±0.6 38.Ш.2 "различия между опытом и контролем достоверны при Р 0,05 Наиболее высокая скорость образования супероксид-аниона была отмечена при предобработке семян соединением 1,3-аминосульфид III, при этом величина показателя была выше в побегах на 18.4 %, корнях - на 45.4 % по сравнению с контролем (рисунок 11). Близкие значения были установлены и при действии препаратов «Биодукс» и «Бисол» (рисунок 11). Обработка семян пшеницы препаратом «Купробисан» и соединением «БТМ», не приводила к активному образованию супероксид-аниона. Величина данного показателя была ниже контроля у растений, выросших при действии препаратов «Купробисан» в побегах на 23.9 %, в корнях на 9.2 % и на фоне «БТМ» на 34.5% и 23.3 % соответственно (рисунок 11).
Таким образом, можем предположить, что некоторые соединения стимулирует локальный синтез АФК. Скорость образования супероксид-аниона при использовании исследованных препаратов возрастала в ряду соединение 1,3-аминосульфид III Биодукс Бисол БТМ Купробисан.
В литературе есть доводы в пользу физиологической роли супероксид-аниона в процессах онтогенеза. Полагают, что он участвует в растяжении листовых пластинок растений (Колупаев, Карпец, 2008). Нами был проведен сравнительный анализ содержания супероксид-анионов и ростовых показателей корней и побегов растения (таблица 7, рисунок 11). Показано, что большое содержание супероксид-аниона в наших экспериментах совпадало с высокими морфометрическими показателями, что подтверждает ранее предложенное мнение Ю.Е. Колупаева о рострегуляторной роли супероксид-аниона при адаптации к стрессовым воздействиям, вызванным в нашем случае предпосевными обработками разными химическими веществами фунги-цидной природы (Колупаев, 2007).
Известно, что АФК участвуют в передаче сигналов, приводящих к активации ферментов-антиоксидантов и/или экспрессии их генов (Herbette et al., 2003). Очевидно, что окислительная реакция запускает механизмы защиты растения (Пожерукова и др., 2015). В детоксикации АФК принимают участие высокомолекулярные ферменты-антиоксиданты, среди которых важная роль играют супероксиддисмутаза, каталаза, группа пероксидаз, ферменты аскор-бат-глутатионового цикла. В дисмутации супероксидных радикалов участвуют три изоформы супероксиддисмутазы (Landis, Tower, 2005). В результате дисмутации супероксид-радикалов под действием разных изоформ СОД происходит образование перекиси водорода (Волыхина, Шафрановская, 2009).
Определение содержания супероксиддисмутазы (СОД) показало разный характер активности этого антиоксидантного фермента у проростков пшеницы после предпосевной обработки соединениями различной химической природы: так наибольшая активность фермента в побегах наблюдалась при использовании препаратов «Биодукс» «Бисол» соединения «БТМ», что было выше значения контроля на 20.9 % 30.2 % 12.8 % соответственно (рисунок 12). Предобработка препаратом «Купробисан» и соединением 1,3-аминосульфид III снижала активность СОД в побегах на 13.8 % и 22.5 % соответственно (рисунок 12). В то время как влияние препарата «Купробисан», соединений «БТМ» и 1,3-аминосульфид III привело к активации фермента в корнях проростков пшеницы на 5.2 %, 9.8 % и 12.5 % соответственно. Воздействие препарата «Бисол» отличалось от действия других препаратов, мы наблюдали снижение активности СОД в корнях на 8.4 % (рисунок 12).
Изучение особенностей формирования ответной реакции 104 гормональной системы проростков пшеницы на предпосевную обработку семян 1,3-аминосульфидом и N,N– бис(диметиламинометил)-тиомочевиной
Несмотря на то, что в России и в мире сложилась достаточно очевидная тендеция к расширению создания и применения бактериальных препаратов для защиты растений от фитопатогенов, рынок средств химической защиты растений (СХЗР) продолжает рост особенно в стоимостном выражении, хотя доля новых препаратов снижается. Это связано с большими трудностями создания полифункционального средства защиты растения, а самое главное подтверждения его «физиологичности» по отношению к сельскохозяйственным растениях. Дальнейшая интенсификация сельскохозяйственного производства будет приводить к одновременному росту благоприятных условий для развития и размножения вредных организмов. Химические средства защиты растений от насекомых-вредителей, грибковых болезней и сорняков на фоне роста напряженности абиотических условий будут оставаться ближайшие десятилетия жизненно важными компонентами в достижении продовольственной безопасности для всего мира.
Создание новых веществ требует от производителей химических средств защиты растений, помимо установления очевидной биологической эффективности препарата по отношению к фитопатогену, предоставления дополнительных данных по безопасности и самое главное установления физиологической роли соединения в формировании продуктивности. Такие «дополнительные» функции СХЗР как защита от абиотического стресса (засуха, засоление почв и др.), это необходимые компоненты для создания инновационных продуктов в отрасли защиты растений. Препараты, которые обеспечивают повышение урожайности и снижение заболеваемости растений более рентабельны. Новые препараты должны обладать по отношению фитопато-генам высокой избирательностью, быстродействием, иметь новые механизмы действия на фитопатоген и как следствие более позднее развитие резистентности к нему у возбудителей болезней растений. Кроме того, необходима быстрая деградация препарата в окружающей среде, отсутствие вымывания в грунтовые воды и низкие нормами расхода, важна также пригодность для приготовления баковых смесей, использование его в комплексной системе защиты посевов.
В связи с этим оценка биологической эффективности соединений 1,3-аминосульфидов и N,N–бис (диметиламинометил)-тиомочевины, а также установление их влияния на физиолого-биохимические процессы потекающие в растениях являлась важной компонентой в определении эффективности соединения как потенциального препарата. На примере скрининга 61 соединения водорастворимых солей 1,3-аминосульфидов видно как большая часть из них оказались «пустышками». 49 соединений не прошли биологический тест, они были либо фитотоксичны (подавляли всхожесть семян пшеницы) или не обладали должной биологической активностью по отношению к возбудителям корневых гнилей. Из 12 соединений в ходе исследований их влияния на ростовые показатели и сравнительной оценки биологической активности было выделены 3 соединения. Которые в свою очередь были оценены по их влиянию на физиолого-биохимические показатели проростков пшеницы. По окончании теста нами было выбрано вещество - ди-{ 4-[(тетрагидро-4н-1,4-оксазин-4-ил)-метилсульфанил]-фенилового} эфир щавелевокислый.
Следующий этап исследований это сравнительное изучение действия новых соединений совместно с известными препаратами, обладающими различными физиологическими, биохимическими, фунгицидными, иммуностимулирующими свойствами. Первоначально был проведен тест на фунгицид-ную активность в условиях in vitro, который позволил установить «чистую» противогрибную активность химических веществ. Как, показали исследования лучшим в исследуемой группе, оказался новичок - N,N–бис (диметила-минометил) –тиомочевина (БТМ), который лучше сдерживал развитие грибной инфекции в стерильных условиях, т.е. обладал свойствами фунгистатич-ности.
Затем было важно выяснить, как реагирует на предпосевную обработку исследуемыми веществами про-/антиоксидантная система растений. Её роль в растении активно изучается и нас она интересовала с одной стороны как антиоксидантная система, будет реагировать на внешнее воздействие химическими ксенобиотиками, а другой стороны как в этой системе будут формироваться механизмы защиты растения от фитопатогенов. Реакция разных её компонентов оказалась неоднозначной. Некоторые вещества («Бисол», «Био-дукс» и 1,3-аминосульфид) активировали синтез АФК (супероксид-анион), а «БТМ» не вызывал такой реакции. Определение содержания перекиси водорода показало на отсутствие на сколь-нибудь значимой активации её синтеза. В детоксикации АФК принимали участие, как показали результаты исследований, ферменты-антиоксиданты: супероксиддисмутаза, каталаза, пероксида-за. Предпосевная обработка семян соединением N,N–бис (диметиламиноме-тил)-тиомочевина приводила к активации пероксидазы в побегах, а каталазы в корнях. Соединение 1,3-аминосульфид III, наоборот, вызывало повышение активности пероксидазы в корнях, а каталазы в побеге. Наблюдаемый ответ антиоксидантной системы, может быть связан, с наличием разных мест активного синтеза АФК.
Роль гормональной системы хорошо известна в ответе растения на внедрение фитопатогенов и наш подход заключался в попытке найти связь между естественной гормональной реакцией на предпосевные обработки химическими веществами и ростовыми процессами растений пшеницы. Изучение уровня содержания фитогормонов (ИУК, цитокининов, АБК) показало на возможную регуляцию ростового процесса фитогормонами (ИУК и цитоки-нины) при обработке семян соединением 1,3-аминосульфид III. Высокий уровень содержания АБК в проростках, обработанных соединением «БТМ», мог быть, механизмом формирования биологической системы защиты в который, как известно из литературы, вовлечена абсцизовая кислота.
И наконец, заключительный этап это полевые испытания исследуемых соединений, которые показали на наличие большой биологической эффективности соединения «БТМ» и что не менее важно, это формирование более высокой биологической урожайности у растений пшеницы.
Таким образом, проведенные исследования показали на наличие у изучаемых соединений фунгицидных свойств и физиологической активности. Могут ли исследуемые соединения применяться самостоятельно или же они должны быть в состав комплексных препаратов? Скорее последнее. Так как они по-разному влияли на всхожесть, оказывали ростстимулирующее или же имели ретардантное действие. Необходимо изучать действие такого препарата при использовании в различных стадиях онтогенеза, особенно в полевых условиях. Вероятно, соотношение веществ необходимо корректировать в зависимости от стадии развития растения, метеорологических условий, особенности структуры и состава почвы и т.п..