Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о влиянии озона на биосистемы 12
1.1. Адаптация растений к абиотическим факторам внешней среды 12
1.2. Влияние озона на процессы жизнедеятельности
1.2.1. Озон, его свойства, образование и перспективы применения 18
1.2.2. Окислительный стресс как реакция организма на действие озона ... 25
1.3. Действие озона на функционирование растительного организма 30
1.3.1. Влияние озона на метаболические процессы 30
1.3.2. Влияние озона на регуляторы роста и развития растений 32
1.4. Роль про-антиоксидантной системы в условиях окислительного стресса 34
1.4.1. Активные формы кислорода: механизмы действия и источники образования 34
1.4.2. Антиоксидантная система организма 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Общая схема исследования 43
2.2. Объект исследования 44
2.3. Экспериментальная установка 47
2.4. Методика проведения озонового воздействия 49
2.5. Биохимические методы исследований
2.5.1. Методы определения массовой доли влаги и сухого вещества 52
2.5.2. Методы определения протеина, жира, растворимых углеводов 52
2.5.3. Методы определения макроэлементов 53
2.5.4. Метод определения каротина 54
2.6. Определение свободнорадикальной активности методом индуцированной хемилюминесценции 54
2.7. Методы определения активности ферментов 56
2.7.1. Определение активности пероксидазы 56
2.7.2. Определение активности полифенолоксидазы 56
2.7.3. Определение активности каталазы
2.8. Методика проведения мелкоделяночного полевого опыта 57
2.9. Методы статистической обработки 58
ГЛАВА 3. Физиолого-бохимическая оценка состояния проростков при озоновом воздействии на «сухие» семена 60
3.1. Морфофизиологические показатели 60
3.1.1. Влияние озона на длину и массу проростков семян льна 60
3.1.2. Влияние концентрации озона в ОВС и продолжительности его воздействия на интенсивность ростовых процессов 66
3.1.3. Влияние озона на энергию прорастания и лабораторную всхожесть семян льна 67
3.2. Биохимические показатели 69
3.3. Активность свободнорадикальных процессов в проростках льна в зависимости от величины озонового воздействия 71
3.3.1. Влияние озонового воздействия на показатели свободнорадикальной активности в проростках льна 72
3.3.2. Состояние антиоксидантной системы защиты проростков льна в зависимости от величины озонового воздействия 73
3.4. Оценка продуктивности льна масличного при предпосевном озоновом воздействии 77
3.4.1. Влияние предпосевного озонового воздействия на рост и развитие льна в период вегетации 77
3.4.2. Влияние предпосевного озонового воздействия на урожай и масличность семян льна 81
ГЛАВА 4. Физиолого-биохимическая оценка состояния проростков при озоновом воздействии на «влажные» семена 84
4.1. Морфофизиологические показатели 85
4.1.1. Влияние озона на длину и массу проростков, выращенных из семян, находившихся в смоченном состоянии до воздействия 85
4.1.2. Влияние озона на длину и массу проростков, выращенных из семян, замачиваемых в воде одни и двое суток до воздействия 87
4.1.3. Проявляемые закономерности биологических эффектов процессов прорастания при озоновом воздействии 90
4.2. Биохимические показатели 93
4.3. Активность свободнорадикальных процессов в проростках льна, выращенных из влажных обработанных озоном семян 97
4.3.1. Влияние озонового воздействия на показатели свободнорадикальной активности в проростках льна 97
4.3.2. Состояние антиоксидантной системы защиты проростков льна в зависимости от величины озонового воздействия и состояния семян 100
ГЛАВА 5. Математическая модель реакции проростка льна на озоновое воздействие 105
5.1. Основные положения модели 105
5.2. Формализация модели 107
5.3. Адекватность модели 111
Заключение 116
Выводы 120
Список литературы
- Окислительный стресс как реакция организма на действие озона
- Биохимические методы исследований
- Влияние озона на длину и массу проростков семян льна
- Проявляемые закономерности биологических эффектов процессов прорастания при озоновом воздействии
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В последние десятилетия область
применения озона значительно расширилась, имеются разработки по его
эффективному использованию в медицине, сельскохозяйственном производстве,
пищевой и перерабатывающей промышленности. В настоящее время ведутся
работы по изучению механизмов действия озона на растительные объекты,
которые открывают большие перспективы его применения в
сельскохозяйственных целях.
Интенсификация растениеводства имеет важнейшее стратегическое значение для развития сельского хозяйства. В этой связи особый интерес представляет лён масличный, который является перспективной технической культурой. Семена льна масличного, являются источником высококачественного пищевого масла, используемого в медицинской практике, а так же как высококачественный пищевой продукт. Полученное из льняных семян масло по своей биологической ценности стоит на первом месте среди пищевых масел (Budwig, 2000; Артюшкевич, 2008; Гордуновская, 2014; Неумывакин, 2014). В последние годы во всём мире возрос интерес к использованию семян льна и льняного масла в связи с их лечебными свойствами (Kritchevsky et al., 1995; Ayres, Loike, 2008; Перевалова, 2011; Шиндин, 2012).
Разработка методов, влияющих на увеличение продуктивности и масличности семян льна, приобретает всё большее значение. Одним из направлений таких исследований может стать использование озона для обработки семян. Однако возникает много вопросов связанных с оптимальными параметрами обработки, физиологическим состоянием семян и ответной реакцией растительного организма на действие озона. При озоновом воздействии в растительном организме образуются активные формы кислорода, которые в результате своего окислительного повреждающего действия вызывают стресс. В связи с этим изучение стрессовых реакций, вызванных воздействием озона, является важным для выяснения функционирования антиоксидантной защиты прорастающих семян. Исследование влияния различных доз озонового воздействия на физиолого-биохимические показатели семян льна, его продуктивность и масличность, функционирование защитных антиоксидантных систем является актуальным.
Степень разработанности темы. Установлено, что озон обладает уникальными
антибактериальными свойствами, экологической чистотой и безопасностью,
экономичностью и простотой применения (Богдан, 2006; Chen et al., 2009), влияет на
микрофлору и урожай растений. К настоящему времени имеются работы, в которых
исследовалось влияние озона на урожайность и продуктивность
сельскохозяйственных культур: пшеница, сахарная свёкла, горох, картофель, козлятник, кукуруза (Кунина, 1987; Резчиков и др., 1998; Pleijel et al., 2000; Tiedemann, Firsching, 2000; Danielsson et al., 2003; Шестерин, 2004; Васильчук, Эпштейн, 2007; Авдеева, 2008, Booker et al., 2009; Нормов, 2009; Данилов, 2010; Гаврилова, 2012; Сигачёва, 2014). В указанных работах в основном рассматривалась экологическая чистота озона и его антибактериальные свойства, позволяющие подавлять патогенную микрофлору и тем самым способствовать сохранению урожая растений. Однако реакции растительного организма на действие озона, его морфофизиологические и биохимические показатели в них не рассматривались. Вместе с тем исследований по влиянию озонового воздействия на прорастание семян
льна масличного и формирование урожая растений не проводилось.
Изучению стрессовых реакций и механизмов защиты растений от действия различных абиотических факторов посвящены многочисленные работы: Гуральчук Ж.З. (1994), Кургановой Л.Н. (1997), Asada К. (1997), Dat, J.F. et al. (2000), Веселова А.П. (2001), Шакировой Ф.М. (2001), MittlerR. (2002), Зыковой В.В и др. (2002), Чирковой Т.В. (2002), Полесской О.Г. (2007), Рощиной В.В. (2009). Авторами установлено, что в результате действия неблагоприятных абиотических факторов активируются процессы свободнорадикального окисления, приводящие к смещению про-антиоксидантного равновесия, что может послужить запуском различных механизмов защиты взрослых растений. Также обнаружено, что при воздействии абиотических факторов, в растениях могут наблюдаться как подавляющие, так и стимулирующие процессы. Принимая это во внимание, представляет интерес изучение адаптационных возможностей прорастания семян льна после озонового воздействия.
Цель работы. Изучение влияния озона на морфофизиологические, биохимические показатели и продуктивность льна масличного, а также установление особенностей функционирования защитных ответных реакций семян на действие озона.
Задачи исследования: 1. Исследовать влияние озонового воздействия на морфофизиологические показатели прорастающих семян льна масличного, в зависимости от состояния семян перед озонированием.
2. Изучить влияние озона на биохимические показатели прорастающих семян.
3. Оценить зависимость величины озонового воздействия на активность
свободнорадикальных процессов в проростках льна.
4. Изучить влияния озона на продуктивность и масличность семян льна.
5. Разработать интегральное представление реакции проростка на озоновое
воздействие и определить особенности функционирования его защитных систем.
Научная новизна работы. Впервые проведены исследования реакции семян льна масличного на озоновое воздействие. Выявлены дозы озона стимулирующие и подавляющие интенсивность прорастания семян льна в зависимости от физиологического состояния семян перед воздействием.
Впервые дана оценка изменений биохимических и свободнорадикальных процессов в проростках льна масличного, выращенных из сухих и увлажнённых перед воздействием озона семян.
Установлена доза озонового воздействия при предпосевной обработке семян льна, повышающая продуктивность и масличность растений.
Разработана математическая модель, описывающая реакции проростка льна масличного на озоновое воздействие и определены механизмы функционирования защитных систем организма.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведённого исследования позволяют расширить представление о биологической роли озона и механизмах функционирования защитных систем растительного организма.
Особенности реакции льна масличного на озоновое воздействие могут быть использованы для повышения посевных качеств семян, увеличения урожайности семян и выхода масла.
Полученные материалы диссертации приняты к использованию в учебном
процессе ФГБОУ ВО Нижегородской ГСХА.
Методология и методы исследования. Работа выполнена с использованием современных физиолого-биохимических методов и оборудования. Подробно методология и методы исследования изложены в разделе «Материалы и методы исследования».
Положения, выносимые на защиту:
-
Воздействие озоном приводит к изменению морфофизиологических и биохимических показателей прорастания семян льна масличного. Эффект стимуляции или подавления прорастания семян зависит от дозы озона и физиологического состояния семян.
-
При воздействии озоном на семена льна в его проростках происходит изменение активности свободнорадикальных процессов и, как следствие, смещение про-антиоксидантного равновесия.
-
При проведении полевых опытов у обработанных озоном семян льна изменяются их посевные качества, а также урожайность и биохимические показатели растений.
-
Математическая модель реакции проростка льна масличного на озоновое воздействие.
Апробация результатов. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 62-й и 63-й студенческой научной конференции биологического факультета государственного университета им. Лобачевского: «Биосистемы: организация, поведение, управление» (Н. Новгород, 2010), Международной научно-практической конференции, посвященной 75-летия со дня рождения профессора Важенина А.Н.: общетеоретические биологические и экономические вопросы сельского хозяйства (Н. Новгород, 2013), I Всероссийской XII научной сессии молодых ученых и студентов с международным участием «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (Н. Новгород, 2013), конференции «Research Journal of International Studies» XXVI (Екатеринбург, 2014), II международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки и хозяйства: новые вызовы и решения» (Санкт-Петербург, 2014), II Всероссийской XIII Межрегиональной с международным участием научной сессии молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (Н. Новгород, 2015), международной научной конференции «Инновационные технологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2015), VI Международной научно-практической конференции «Научные исследования: от теории к практике» (Чебоксары, 2015).
Публикации. Основные положения диссертации изложены в 16 научных работах, из них 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 220 наименований (173 отечественных и 47 иностранных). Диссертация содержит 141 страницу основного текста, 32 рисунка и 17 таблиц.
Личный вклад автора. Соискателем проведён анализ состояния вопроса, обоснованы цели и задачи исследования, разработана программа и методика исследований, самостоятельно проведены опыты, наблюдения и лабораторные анализы, проведена статистическая обработка полученных данных. Обсуждены и описаны полученные результаты.
Окислительный стресс как реакция организма на действие озона
При действии низких температур увеличивается синтез фитогормона абсцизовой кислоты, играющего важную роль в адаптации растений к пониженным температурам (Лось, 2005).
При действии высоких температур наблюдается обратимое смещение прооксидантно-антиоксидантного равновесия, являющегося одним из первых звеньев в процессе формирования адаптации растений на тепловой стресс (Веселов и др., 1997; Курганова и др., 1997).
Адаптация растений к повышенным температурам осуществляется синтезом белков теплового шока (Войников и др., 1984; Кулаева, 1997).
Радиационное излучение. В основе радиационного (ионизирующего) излучения лежит комплекс взаимосвязанных процессов. При ионизации и возбуждении атомов и молекул образуются высокоактивные радикалы, вступающие в дальнейшем в реакции с различными биологическими структурами клеток. При этом изменения, происходящие, в клетках зависят от полученной дозы радиации, состояния организма и длительности воздействия (Кузин, 1997).
Действие ничтожно малых количеств поглощенной энергии оказывается для клетки губительным из-за физического, химического и биохимического усиления радиационного эффекта, и основную роль в развитии этого эффекта играет повреждение надмолекулярных структур, обладающих высокой радиочувствительностью (Вредные химические вещества.., 1990).
Однако имеется экспериментальный материал по предпосевному облучению семян разных культурных растений обобщенный в трудах Н.М. Березиной и Д.А. Каушанского (Березина, Каушанский, 1975).
Защитную функцию от радиации на уровне клетки осуществляют вещества - радиопротекторы, роль которых заключается в гашении свободных радикалов, возникающих при облучении (Полевой, 1989).
Электромагнитное воздействие. Среди всего спектра электромагнитных излучений радиоволнового диапазона выраженным биологическим действием обладают СВЧ и КВЧ поля. Механизмы воздействия этих факторов на организм и характер протекания физиологических процессов под их воздействием неоднозначны (Исмаилов, 1987; Тамбиев, Кирикова, 1995).
Выявленная закономерность влияния СВЧ излучений сверхслабой интенсивности (10-8 -10-15 Вт) на сезонные ритмы живых организмов дает возможность управлять биоритмами, что открывает перспективы по использованию СВЧ излучений в различных областях народного хозяйства (Орлов и др., 2011). Установлено, что наибольшее воздействие КВЧ излучения на растительные клетки происходит на частотах 60 и 145 ГГц при плотности потока энергии 120 мкВт/см2 (Русских и др., 2011). При целенаправленном воздействии КВЧ-излучения на организм позволяет управлять многими процессами жизнедеятельности, в том числе, влиять на рост и развитие бактерий, животных, тканей и органов человеческого организма (Бецкий, Девятков, 2000).
Сведения о воздействии КВЧ-излучения на высшие растения встречаются редко и имеют фрагментарный характер (Лященко, Лихолат, 1999).
Химическое воздействие. К химическим факторам вызывающим стресс у растений относят засоление почв (хлоридное, сульфатное, хлоридно сульфатное, карбонатное), выброс тяжёлых металлов (наиболее токсичные среди них: Co, Cu, Ni, Sn, Zn, Te, As, Rb, Cd, Hg, Pb, Pt, Bi), газообразные соединения (озон, окислы азота, сернистый газ, соединения фтора, угарный газ, пары кислот, углеводороды). Загрязнение среды химическими веществами происходит в результате производственной деятельности человека (промышленность, автотранспорт), использования пестицидов, сжигания топлива и мусора, сбрасывания сточных вод (Илькун, 1978; Артамонов, 1986; Гуральчук, 1994; Кузнецов, Дмитриева, 2001; Островский, 2009).
Влияние химических вредных веществ может быть отражено в нарушении клеточного метаболизма, снижении интенсивности фотосинтеза, уменьшении количества хлорофилла и каротина, затруднении газообмена, ингибировании роста, уменьшении оводнённости тканей, повышении концентрации ионов натрия в цитоплазме клеток (Кузнецов, Дмитриева, 2001; Медведев, 2004; Якушкина, Бахтенко, 2004). Загрязнение атмосферы приводит к росту концентрации озона в тропосфере (Семёнов и др., 1999). Увеличение содержания озона происходит за счёт реакции взаимодействия углеводородов с кислородом воздуха под действием ультрафиолетового излучения. Озон, обладая высокой реакционной способностью, при взаимодействии с химическими компонентами клетки продуцирует кислородные радикалы (Кунина, 1986; Алёхина и др., 2005; Рощина, 2005, 2009). По мере увеличения озона в воздушной среде проблема устойчивости растений к нему будет обостряться, поэтому воздействие озона на растительные структуры и процессы функционирования живых клеток, заслуживает специального рассмотрения (Алёхина и др., 2005; Booker et al., 2009; Рощина, 2009; Кошкин, 2010; Ashmore, 2005; Klingberg, 2011; Mills, Harmens, 2011).
Биохимические методы исследований
Лён и его семена используются во многих отраслях жизнедеятельности человека: в сельскохозяйственном производстве, медицине, косметологии, текстильной и пищевой промышленности (Виноградов и др., 2001; Беляк и др., 2003). Вследствие разнообразного использования этого растения Карл Линней дал ему название Linum usitatissimum, то есть лён полезнейший (Дьяков, 2006).
Лён культурный подразделяется на пять подвидов: лён-долгунец, кудряш, межеумок, крупносемянный, полуозимый (стелющийся). В качестве масличной культуры высевают межеумок и кудряш. Лён масличный относится к виду Linum usitatissimum L. (лён культурный), семейству льновых - Linaceal Dum (Шиндин и др., 2012).
Лён масличный однолетнее травянистое растение с ветвящимися стеблями высотой 20-70 см. Стебель светло-зеленый, с легким восковым налетом. Листья линейные, длиной 2-4 см заостренные кверху. Корневая система стержневая слабо развитая (Буряков, 1971; Гайнулин и др., 2005).
Цветки льна мелкие, собранные в соцветие зонтиковидная кисть, имеют 5 чашелистиков, 5 лепестков, 5 тычинок. Окраска лепестков чаще всего синяя или голубая, но встречаются сорта с белой, фиолетовой, розовой окраской цветка (Галкин, 1987; Живетин, Гинзбург, 2000; Лукомец и др., 2010).
Плод - небольшая пятигнёздная коробочка. При полном оплодотворении и нормальном развитии в коробочке формируются 10 семян. Семена удлинённо-эллиптические, сильно сплюснутые, гладкие, блестящие. Средняя масса 1000 семян колеблется от 6,5 до 9 г, достигая для некоторых сортов 13 г. В семенах масличного льна накапливается до 52% масла, богатого жирами. В строении семени льна различают: оболочку, состоящую из шести слоёв, эндосперм и зародыш, имеющий зародышевый корешок, почечку и две семядоли. Зародыш занимает большую часть семени (Живетин, Гинзбург, 2000). Лён - растение самоопыляющееся возможно и перекрестное опыление посредством ветра и насекомых. В течение жизненного цикла растения льна различают следующие основные фазы: всходов, «ёлочки», бутонизация, цветения, созревания. Период вегетации льна масличного в зависимости от группы спелости и погодных условий составляет 80-110 дней (Лукомец и др., 2010).
Семена льна богаты жирами, протеинами, клетчаткой и клейковиной (Зубцов и др., 2001; 2002). В зависимости от сорта, среды выращивания и способов переработки льна состав льняного семени может существенно меняться (Bhatty et al., 1995; Зубов, Лебедева, 2002).
В России лён масличный возделывается в южных районах (Северный Кавказ), Центральном Черноземье, Поволжье, Западной Сибири.
Лён масличный, сорт ЛМ 98. В 2009 г. в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в Российской Федерации, включено 15 сортов льна масличного, 14 из них отечественной селекции: ВНИИМК 620, ВНИИМК 622, ВНИИМК 630, «Ручеек», «Циан», «Исилькульский», «Легур», «Северный», «Сокол», «Небесный», «Кинельский 2000», «Лирина», «Исток», ЛМ 98, «Санлин» (Шиндин и др., 2012).
Среди представленных выше сортов можно выделить сорт масличного льна ЛМ 98, так как он уникален и создан специально для пищевого и фармацевтического назначения. Сорт выведен в ГНУ ВНИИ льна Россельхозакадемии и включён в Госреестр в 2008 году по Средневолжскому региону. Растение высотой 55-65 см. Лепесток в стадии бутона сине-фиолетовый, при полном развитии светло-синий. Масса 1000 семян может составлять от 5 до 8 г. Содержание жира в семенах - 42,8 %. Отличительной особенностью сорта ЛМ 98 является низкое содержание линоленовой кислоты (класс Омега-3) - 4 % и повышенным содержанием линолевой кислоты (класс Омега-6) - 68,9 % (Шиндин и др., 2012). Такое соотношение кислот приближается к рекомендованному Всемирной организацией здоровья.
Льняное масло сорта ЛМ 98 обладает уникальным диетическим и лечебно-профилактическим свойствами при атеросклерозе, нарушении жирового обмена, онкологических заболеваниях (Болобан, 1998; Артюшкевич, 2008; Неумывакин, 2014). Нормализует функции щитовидной железы, печени, кишечника, желудка, обладает омолаживающим действием (Живетин и др., 2000, 2001). Главным его достоинством является наличие действующих веществ, содержащихся в семени: полисахариды, растительные волокна, лигнаны и полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК): омега-3, омега-6, омега-9 (Перевалова, 2011; Гордуновская, 2014). Семена льна применяют при заболевании язвой желудка и гастритом, так как полисахариды придают семени смягчающие, обволакивающие и противовоспалительные свойства (Oomah, 2001; Перевалова, 2011; Гордуновская, 2014). Необходимо важным для женского здоровья является содержание в семенах льна клетчатки из лигнанов, которые обладают эстрогенблокирующим действием и позволяют применять семена при гормональных нарушениях (Ayres, Loike, 2008). Помимо этого лигнаны обладают антиоксидантными свойствами, антибактериальным, антивирусным и антигрибковым эффектом, препятствуют развитию рака молочной железы и простаты (Перевалова, 2011; Ayres, Loike, 2008; Barrett, 1996).
Полиненасыщенные жирные кислоты, которые в организм человека поступают только с пищей, необходимы для нормального функционирования организма, предотвращения сердечных заболеваний и артритов (Гордуновская, 2014). Омега-3 составляет значительную часть оболочки каждой человеческой клетки, которая обеспечивает подвижность клеточной мембраны и её нормальную проницаемость (Гаврисюк, 2001; Ипатова и др., 2004; Перевалова, 2011). -Линоленовая кислота участвует в регенерации сосудистой системы человеческого организма, в росте и развитии мозга (Simopoulos, Cleland, 2003).
Растительная клетчатка семян льна активизирует деятельность кишечника, способствует снижению риска онкологических заболеваний, повышает иммунитет, а также выводит из организма желчные кислоты, холестерин, токсины и яды (Kritchevsky et al., 1995; Пащенко и др., 2004).
Благодаря своим полезным свойствам в России потребность населения и перерабатывающей промышленности во льне и его семенах непрерывно растёт, и раскрывает перспективы дальнейшего развития льноводства. Таким образом, льняные семена становятся важным и необходимым продуктом для поддержания здоровья человека и лечения различных заболеваний.
Экспериментальная установка по воздействию озона на растительный материал представлена на рисунке 2.2. Основными узлами установки являются: генератор озона, камера объемом 0,043 м3, спектрофотометр СФ-26 с газовой кюветой, колба с раствором KJ для нейтрализации озона и вытяжной компрессор (Резчиков, 1977).
Озон получали методом барьерного разряда из кислорода воздуха на малогабаритном генераторе озона. Озонатор выполнен на пассивных элементах, имеет производительность до 10 г/ч и потребляемую мощность не более 120 Вт (Резчиков и др., 1998).
Принцип электросинтеза озона в барьерном разряде основан на диссоциации молекул кислорода под воздействием энергии электрического разряда в диэлектрическом промежутке. Образующийся в процессе диссоциации атомарный кислород соединяется с молекулой кислорода, в результате образуется озон. Одновременно идет реакция распада озона. Равновесие обоих реакций и обеспечивает регистрируемую концентрацию озона на выходе озонатора (Ортенберг, Трифонов, 1990).
Влияние озона на длину и массу проростков семян льна
Основными показателями качества семян являются их всхожесть и энергия прорастания. Последний признак, характеризующий дружность и скорость прорастания семян, даёт возможность оценить потенциальную защитную функцию развивающегося растительного организма, так как быстро проросшие семена имеют наилучшие перспективы перенести неблагоприятные условия после их посева в весенний период (Ремерс, Илли, 1978). Поэтому во время проведения опытов у каждого исследуемого образца определялась лабораторная всхожесть, а также энергия прорастания на вторые и третьи сутки после начала проращивания.
Из полученных результатов видно что, энергия прорастания контроля на второй день равна 35 %. При обработке семян ОВС максимальная энергия прорастания наблюдалась при дозе озона 190 мгмин/м3 – 62 %, минимальная при D=12000 мгмин/м3 и 24000 мгмин/м3 - 31 % (рис. 3.7). Из полученных данных можно сделать заключение, что определённые дозы озона могут угнетать и усиливать начальные ростовые процессов, выраженные в виде энергии прорастания семян на второй день.
При определении энергии прорастания на третий день получили приблизительно равноценные показатели (рис. 3.7), что можно обосновать высокой средней скоростью процесса прорастания семян льна масличного в лабораторных условиях. У опытных семян обладающих высокой энергией прорастания на второй день наблюдается наибольший биологический эффект по длине, по видимому резкая активация стартовых процессов прорастания приводила к последующему стимулирующему эффекту, выраженному в длинах
Установлено, что при озоновом воздействии на семена льна изменяется их энергия прорастания, а лабораторная всхожесть остаётся на одном уровне с контролем. 3.2. Биохимические показатели
Установленные при озоновом воздействии морфометрические изменения экспериментальных растений должны быть отражены в соответствующих биохимических показателях. С целью выявления изменений биохимического состояния подопытных организмов проведён общий биохимический анализ проростков льна на содержание протеинов, жира, сахаров (комплекс водорастворимых олиго- и моносахаридов), крахмала, каротина, калия, кальция и фосфора (табл.3.4). Для анализа были выбраны образцы проростков выращенных из семян обработанных дозами озона: D=190 мгмин/м3 -соответствующая максимальному стимулирующему эффекту по длине и D=6000 мгмин/м3 - соответствующая началу подавления ростовых процессов от действия ОВС, а также из контрольных семян.
Биохимическая характеристика исследования проростков после озонового воздействия на сухие семена, % к абсолютно сухому веществу (все значения показателей достоверно отличаются друг от друга с p0,05) К - отклонение биохимического показателя экспериментального образца относительно контроля, %. ( - определение проводили в целой пробе (семя + проросток)) Сухое вещество содержит в себе как органическую, так неорганическую составляющую (сырая зола). Органическое вещество проростков - это жир, протеин и углеводы. Как видно из представленных результатов массовая доля сухого вещества для проростков, выращенных из семян обработанных дозой озона D=6000 мгмин/м3, по сравнению с контролем осталась на прежнем уровне, что видимо, связано с внутренним перераспределением компонентов сухого вещества. Для проростков, полученных из семян с дозой озона D=190 мгмин/м3, наблюдается увеличение массовой доли сухого вещества на 5,2 %.
Проведённый биохимический анализ тканей всех выделенных групп проростков льна не позволил обнаружить существенных изменений в содержании жира, каротина и макроэлементов, таких как калий и фосфор. Их значения относительно контроля достоверно не отличались друг от друга. Но массовая доля кальция у всех экспериментальных образцов повысилась на 0,01 %, и составила 0,07 % (табл.3.4).
Как известно основной формой запасных углеводов в семенах растений является крахмал (Физиология и биохимия покоя…, 1982). При прорастании семян происходит активирование группы амилолитических ферментов (амилазы), под действием которых начинается гидролиз крахмала с образованием низкомолекулярных сахаров (олиго- и моносахаридов) (Степаненко, 1978). Из полученных результатов биохимического анализа можно предположить, что при обработке семян озоном у проростков распад крахмала проходит интенсивнее, чем у контрольных (табл.3.4). При воздействии на семена дозами D=6000 и 190 мгмин/м3 содержание крахмала снижалось на 4,2 и 13,0 % соответственно.
Отметим, что в результате ускоренных процессов распада крахмала содержание низкомолекулярных сахаров при озоновом воздействии на сухие семян возрастало при переходе от контрольных проростков к проросткам, выращенным из семян при дозе D=6000 мгмин/м3 и, далее, D=190 мгмин/м3 соответственно на 8,3 и 12,0 % (рис. 3.6, кривая 1). Все значения содержания сахаров достоверно отличались друг от друга с p 0,95.
Проявляемые закономерности биологических эффектов процессов прорастания при озоновом воздействии
Массовая доля сухого вещества для проростков, выращенных при воздействии озоном на влажные семена дозой D=190 мгмин/м3, по сравнению с контролем увеличилась на 8,3 % (табл. 4.3), а по сравнению с проростками выращенных из сухих обработанных семян на 2,9 % (табл. 3.4 и 4.3).
Проведённый биохимический анализ тканей проростков выращенных из обработанных влажных семян также не позволил обнаружить существенных изменений в содержании жира, каротина и макроэлементов, таких как калий и фосфор, их значения относительно контроля достоверно не отличались друг от друга. Но массовая доля кальция у опытных проростков относительно контроля повысилась до 0,07 % (табл.4.3).
В проростках, выращенных из обработанных влажных семян дозой D=190 мгмин/м3, по сравнению с контролем наблюдается снижение крахмала на 20,1 %, а по сравнению с проростками выращенных из сухих обработанных семян на 8,1 %.
Отметим, что если перед воздействием озоном дозой D=190 мгмин/м3 сухие семена смочить в воде, то содержание сахаров в проростках по сравнению с контролем повышалось на 26,9 %, что выше, чем в опытах с сухими семенами на 13,3 %. В проростках, выращенных из обработанных влажных семян дозой D=190 мгмин/м3, по сравнению с контролем наблюдается снижение протеина на 6,6 %, а по сравнению с проростками выращенных из сухих обработанных семян на 3,2 %.
Зарегистрированная динамика биохимических показателей также свидетельствует о возрастании интенсивности обменных процессов у опытных групп проростков. Причём самые высокие показатели выявлены у проростков, выращенных из семян, смоченных перед озоновым воздействием, несмотря на то, что выбранная доза озона соответствовала максимальной стимуляции прорастания сухих семян.
Для выявления причин изменения зарегистрированных биохимических показателей рассмотрим процессы, которые происходили на стадии обработки смоченных семян. При добавлении к сухим семенам дистиллированной воды, их оболочка покрывалась водной «капсулой» и при воздействии озоном, газ проходил непосредственно через неё. При этом после взаимодействия озона с водой проходит ряд химических реакций приводящих к частичному разложению газа в воде (Богдановский, 1994): 1) О3 + Н2О 2ОН + О2 4) О Н + ОН Н2О2 2) О3 + ОН НО2 + О2 5) О3 + Н2О2 ОН + НО2 + О2 3) О3 + НО2 ОН + 2О2 6) ОН + НО2 Н2О + О2 При растворении озона в водной фазе образуются свободные радикалы и пероксиды, окислительная способность которых очень высока. Особое значение в изучении механизма действия озона и его производных будет иметь образованный в ходе реакций гидроксильный радикал (ОН) (Богдановский, 1994), который может реагировать как с веществами, находящимися в воде, так и с компонентами живых клеток семян.
Кроме того, следует учесть физические факторы – смачиваемость, несмачиваемость, капиллярность, молекулярное и дополнительное давления и другие, которые могут изменить пути проникновения озона и его производных в организм и, следовательно, привести к другой итоговой интегральной реакции проростка на озоновое воздействие.
С целью выявления изменений происходящих в дистиллированной воде при озоновом воздействии, на базе ОАО «Теплоэнерго» Санитарно-промышленной экологической службы, проведен анализ воды, обработанной дозами озона D=190 мгмин/м3 (С=19 мг/м3; t=10 мин) и D=6000 мгмин/м3 (С=300 мг/м3; t=20 мин) (табл.4.4). Из полученных результатов видно, что реакции озона и его производных с водой приводит к изменению водного баланса ионов. При этом разные дозы озона по-своему изменяют этот баланс. К примеру, при D=190 мгмин/м3 по отношению к контролю в воде снижается содержание нитрат- и нитрит-ионов, но увеличивается содержание ионов аммония и перманганата калия, а при D=6000 мгмин/м3 снижается количество нитрит-ионов и увеличивается количество нитрат-ионов.
Получаем, что у семян смоченных водой, в которой за счёт реакций с озоном произошли изменения водного баланса ионов и образовались свободные радикалы, могут протекать иные изменения ростовых процессов в отличие от опытов с сухими семенами.
Анализ озонированной воды (p 0,05) Показатели Обозначение НД Результаты и погрешность измерений Контроль (дист.вода) D =190 мгмин/м3 D =6000 мг-мин/м3 Водородный показатель (рН), ед.рН ГИД Ф 14.1:2:3:4. 121-97 7,32±0,20 7,29±0,20 7,27±0,20 Железо общее, мг/дм3 ГОСТ 4011-72, п.3 0,1 0,1 0,1 Ион аммония (NH4-), мг/дм3 ГОСТ 4192-82, п.3 0,39±0,04 0,47±0,05 0,40±0,04 Нитрат-ион (NO3-), мг/дм3 ГОСТ 18826-73, п.3 0,55±0,11 0,23±0,05 0,64±0,13 Нитрит-ион (NO2-), мг/дм3 ГОСТ 4192-82, п.4 0,005±0,00 1 0,003 0,003 Хлорид-ион (CL-), мг/дм3 ГОСТ 4245-72, п.3 1,0 1,0 1,0 Сульфат-ион (SO4-), мг/дм3 ГОСТ Р 52964-2008, п.3 2,0 2,0 2,0 Перманганат калия (KMnO4), мг/дм3 ГИД Ф 14.2:4. 154-99 0,25 0,8±0,2 0,25
Получается, что при озоновом воздействии на влажные семена, образцы будут подвергаться воздействию со стороны озона, его производных, образованных при растворении газа в водной фазе и самой дистиллированной воды с изменённым балансом ионов.
Образованный в ходе реакции гидроксильный радикал реагирует с жирными кислотами и липидами плазматических мембран, служащих одним из барьеров для проникновения озона в цитоплазму клетки (Рощина, 2009). В результате потерь ненасыщенных жирных кислот и перекисного окисления липидов увеличивается проницаемость мембран и происходит частичный их разрыв, что сопровождается дальнейшим проникновением озона внутрь клетки (Рощина, 2009). По-видимому, аналогичные процессы происходили в опытах с влажными семенами, а частичный разрыв клеточной оболочки мембран приводил в дальнейшем к резкому изменению нормальных процессов обмена веществ у опытных групп проростков, что отразилось на их биологических эффектах по длине и массе проростков в подавляющую сторону. 4.3. Активность свободнорадикальных процессов в проростках льна, выращенных из влажных обработанных озоном семян