Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 15
1.1. Влияние стрессоров на редокс-регуляцию клеточных функций и развитие окислительного стресса 15
1.2. Молекулярная организация факторов защиты растений от активных форм кислорода и окислительного стресса 22
1.3. Адаптация растений к условиям среды обитания с различным содержанием металлов 25
1.4. Наночастицы металлов и их действие на растительные организмы
1.4.1. Современные представления о наночастицах металлов и их биологических свойстах 29
1.4.2. Прооксидантные свойства наночастиц металлов и их оксидов 39
1.4.3. Общие метаболические изменения в растениях после воздействия наночастиц металлов 42
1.4.4. Генотоксические свойства наночастиц металлов 44
Экспериментальная часть
2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследовани
2.1.1. Семена Triticum vulgare Vill
2.1.2. Наночастицы металлов и их оксидов
2.2. Методы исследования
2.2.1. Методика проращивания семян Triticum vulgare и общая схема эксперимента 50
2.2.2. Метод определения содержания фотосинтетических пигментов 53
2.2.3. Определение накопления наночастиц металлов в проростках Triticum vulgare.. 55
2.2.4. Методы определения активности антиоксидантных ферментов 56
2.2.5. Определение содержания малонового диальдегида 57
2.2.6. Определение содержания, антиоксидантной активности и конформационных изменений фенольных соединений. 58
2.2.7. Определение содержания отдельных активных форм кислорода 64
2.2.8. Определение жизнеспособности проростков Triticum vulgare 68
2.2.9. Определение степени фрагментации ДНК in vitro и in vivo... 69
2.2.10. Определение механизма клеточной дифференциации корней проростков Triticum vulgare после инкубации с наночастицами 74
2.2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных CLASS 3. Результаты и их обсуждение CLASS
3.1. Сравнительный анализ морфо-физиологических особенностей проростков Triticum vulgare после воздействия наночастиц металлов и их оксидов...
3.1.1. Влияние наночастиц металлов и их оксидов на энергию прорастания семян Triticum vulgare
3.1.2. Влияние наночастиц металлов и их оксидов на ростовые параметры Triticum vulgare 78
3.1.3. Влияние наночастиц металлов и их оксидов на содержание фотосинтетических пигментов в листьях Triticum vulgare 81
3.1.4. Накопление наночастиц металлов и их оксидов в проростках Triticum vulgare 86
3.2. Исследование про-/антиоксидантного статуса проростков Triticum vulgare после воздействия наночастиц металлов и их оксидов 92
3.2.1. Уровень антиоксидантных ферментов после воздействия наночастиц металлов и их оксидов на проростки Triticum vulgare.. 92
3.2.2. Степень перекисного окисления липидов в проростках Triticum vulgare после воздействия наночастиц металлов и их оксидов 95
3.2.3. Наночастицы металлов и их оксиды как модификаторы фенольных метаболитов в проростках Triticum vulgare 97
3.2.4. Уровень активных форм кислорода в корнях проростков Triticum vulgare после воздействия наночастиц меди, оксида меди и никеля 105
3.3. Влияние наночастиц меди, оксида меди и никеля на цитогенетические повреждения в корнях проростков Triticum vulgare 112
3.3.1. Жизнеспособность корней проростков Triticum vulgare после воздействия наночастиц никеля, меди и оксида меди 112
3.3.2. Влияние наночастиц никеля, меди и оксида меди на степень повреждения ДНК корней проростков Triticum vulgare 117
3.3.3. Раскрытие механизма дифференциации клеток корней проростков Triticum vulgare после воздействия наночастиц никеля и меди 127
Заключение
Выводы список сокращений и условных обозначений список литературы
- Молекулярная организация факторов защиты растений от активных форм кислорода и окислительного стресса
- Наночастицы металлов и их оксидов
- Влияние наночастиц металлов и их оксидов на энергию прорастания семян Triticum vulgare
- Наночастицы металлов и их оксиды как модификаторы фенольных метаболитов в проростках Triticum vulgare
Введение к работе
Актуальность. Проблема устойчивости растительных организмов к неблагоприятным факторам внешней среды занимает одно из центральных мест в физиологии растений (Papagiannis at al., 2004; Титов и др., 2014). Среди этих факторов особая роль принадлежит нарушению минерального обмена растений в результате вторичного загрязнения тяжелыми металлами (ТМ), которые при повышенных концентрациях оказывают токсическое действие на самые разнообразные физиологические процессы (Титов и др., 2007; Kholodova et al., 2011; Кузнецов, Дмитриева, 2016). Особенно опасны с этой позиции мелкодисперсные наночастицы (НЧ) или нанопорошки металлов, доля производства которых, по официальным прогнозам, будет расти до 58000 тонн ежегодно вплоть до 2020 года (Крылов, 2009; Макаров, 2014). Наибольший практический интерес среди широкого спектра нанопорошков представляют НЧ на основе железа, меди и никеля, которые входят в пятерку наиболее используемых промышленными предприятиями во всём мире (Фельдблюм, 2013). Несмотря на то, что нанометаллы синтезируют в закрытых помещениях, на каждой стадии реализации технологической цепочки происходят потери при распылении. Попав в окружающую среду, диспергированные НЧ могут образовывать устойчивые во времени аэрозоли (El-Temsah, 2010) и агрегаты (Lu et al., 2002), которые с помощью различных механизмов могут попадать в почву и другие компоненты экологической системы (Lin et al., 2004). За счёт того, что наноразмерные металлы обладают бль-шей реакционной активностью и удельной площадью поверхности, чем металлы в макроформе, они легче вступают в химические превращения (Lin et al., 2004) и активно поглощаются растениями (Da Silva et al., 2006; Buzea et al., 2007; Pan et al., 2007).
В целом, изучению нанометаллов на растительных организмах посвящены многочисленные экспериментальные и обзорные статьи (Riahi-Madvar et al., 2012; Faisal et al., 2013; Masarovicova et al., 2013). Большое внимание исследователей обращено к оценке влияния нано-металлов на урожайность и основные показатели роста растений (Sheykhbaglou et al., 2010; Dimkpa et al., 2012; Dhoke et al., 2013). Однако, имеющиеся к настоящему времени работы не вполне удовлетворяют требованиям к тестированию наноматериалов, т.к. не учитывают ряд физико-химических свойств последних. Предполагается, что интенсивность развития биологических эффектов высокодисперсных металлов отличается от эффектов их оксидных форм, и во многом зависит от наличия в составе металлов переменной валентности. Последние способны высвобождать токсичные ионы из своего коллоидного матрикса (Ma et al., 2010; Auffan et al., 2011; Schaeublin et al., 2011) и стимулировать выработку активных форм кислорода (АФК) (Kholmurodov et al., 2013; Ishino et al., 2015), что особенно характерно для оксидов двухвалентных металлов (Griffitt et al., 2007; Keller et al., 2010). Следствием такого повышения ок-сидантов в клетках являются окислительные модификации биомолекул, что может приводить к окислительному стрессу и даже гибели организмов (Zitka еt al., 2013; Karkone, Kuchitsu, 2015). К сожалению, наше понимание относительно того, как протекают подобные процессы в растениях, остаётся достаточно ограниченным. Отсутствует комплексное изучение закономерностей формирования ответных реакций растений к металлическим дисперсиям в сравнении с их оксидными формами, несущих ясные представления о разнообразии обусловленных этим биологических эффектов на клеточном и молекулярном уровнях. В связи с этим, актуальным является расшифровка характерных механизмов устойчивости растений к структурно раз-
личающимся НЧ металлов и их оксидам на уровне не только морфо-метрических характеристик, но и антиоксидантной системы и в целом жизнеспособности клеток, через которые формируется адаптивная стратегия.
Целью настоящей работы является комплексное исследование физиолого-биохимических механизмов устойчивости и/или чувствительности проростков Triticum vulgare к наноча-стицам металлов и их оксидам.
Задачами работы в связи с указанной целью являются:
-
Изучить влияние НЧ металлов и их оксидов на интегральные морфо-физиологические показатели пшеницы.
-
Исследовать функционирование отдельных компонентов антиоксидантной системы в формирующихся проростках пшеницы в присутствии НЧ.
-
Проанализировать изменения в содержании отдельных активных форм кислорода в корнях пшеницы при нагрузке НЧ.
-
Оценить степень цитогенетических нарушений в клетках апикальной меристемы корней пшеницы после воздействия НЧ.
Научная новизна работы определяется комплексом впервые полученных экспериментальных данных об условиях формирования и механизмах ответных реакций проростков Triticum vulgare к ряду металлсодержащих наночастиц. Согласно данным по электрокинетическому -потенциалу впервые продемонстрирована способность НЧ металлов и их оксидов к агрегации, которая увеличивалась в ряду: Ni
Теоретическая и практическая значимость исследования. Полученные результаты могут быть использованы в системе обоснования допустимых уровней загрязнения растительных организмов и агроценозов, существенным компонентом которых являются металлические дисперсии. Это, в свою очередь, может быть полезно при прогнозировании потенциальных рисков поступления НЧ металлов в природные экосистемы. Предложенная методика уменьшения -потенциала суспензий НЧ путём увеличения ионной силы раствора даст возможность искусственного соосаждения и других токсичных металлов в естественных водоёмах. Практическая ценность работы состоит в развитии и совершенствовании методического аппарата для
анализа биологической активности НЧ с обоснованием оптимального алгоритма проведения исследований с использованием взаимодополняющих тестов. Изменение соотношения хлорофилла а/б позволяет использовать его как индикатор дестабилизации пигмент-белкового комплекса растений при загрязнении НЧ металлов. Эффективным подходом является изучение клеточной дифференциации и повреждения ДНК в сочетании с универсальными стрессовыми маркерами – уровнем про-/антиоксидантов и жизнеспособностью клеток. Разработана новая оригинальная методика пробоподготовки экстрактов для снятия ИК-спектров. Разработана методика выделения ДНК, исключающая дополнительную деградацию молекул при гомогенизации проростков. Предложенные методики позволяют диагностировать стрессовое воздействие металлов на растения. Высокий уровень толерантности растений в ответ на НЧ Fe позволил разработать новый способ повышения фотосинтетических пигментов в листьях пшеницы после предпосевной обработки семян (Патент №2539861 от 24.10.2013). Полученные результаты могут быть использованы в научных организациях, проводящих исследования с наноматериа-лами, в растениеводстве, а также в ВУЗах в образовательном процессе по направлениям подготовки «Физиология и биохимия растений», «Биохимия» и «Экология».
Основные положения, выносимые на защиту:
1) толерантность проростков пшеницы к действию НЧ по физиолого-биохимическим
показателям уменьшается в ряду: Fe3O4>Fe>NiO>CuO>Ni>Cu. При этом, металлы
специфично влияют на фотосинтетическую активность в листьях проростков, избирательно
снижая количество либо хлорофилла a (Cu), либо хлорофилла b (Ni);
2) в концентрациях, вызывающих примерно равное ингибирование витальных
показателей – 0,025, 0,05 и 0,1 М – НЧ Cu, CuО и Ni вызывают окислительно-
восстановительный дисбаланс, избирательно влияя на активность ферментативных и
фенольных антиоксидантов в листьях и корнях проростков;
-
увеличение пула АФК в корнях T. vulgare проявляется возрастанием концентрации перекиси водорода и гидроксильного радикала (Cu, CuО) или супероксид-радикала (Ni);
-
снижение устойчивости корней T. vulgare в условиях проращивания с 0,1 М НЧ Cu, CuО и Ni сопровождается достижением порога адаптационных возможностей проростков, что выражается деструкцией ДНК и снижением жизнеспособности;
5) повреждение молекул ДНК имеет бессистемную некрозную (Сu и CuO) или
апоптотическую формы (Ni), что подтверждается визуализацией морфологически
изменённых некрозных (Сu) и апоптозных клеток (Ni), а также увеличением каспазаподобной
активности (Ni).
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Биологическая наука в решении проблем естествознания» (Чебоксары, 2013); Международных научно-практических конференциях «Наука и образование в жизни современного общества» (Тамбов, 2013) и «Актуальные вопросы науки и образования» (Тамбов, 2014); Международной научно-практической конференции «Микроэлементы в медицине, ветеринарии, питании: перспективы сотрудничества и развития» (Одесса, 2014); Областной выставке научно-технического творчества молодёжи «НТТМ-2014» (Оренбург, 2014); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Пермь, 2014); Ежегодной областной научно-практической конференции «Молодые учёные Оренбуржья – науке XXI века» (Оренбург, 2014); XI Международной научно-практической конференции «Современные концепции
научных исследований» (Москва, 2015); 19-ой и 20-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2015, 2016); I Международном конкурсе «Перспективы науки – 2015» (Казань, 2015); Международной научно-практической конференции «Естественные и математические науки: современный взгляд на изучение актуальных проблем» (Астрахань, 2016); VIII Всероссийской конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2016); II Международной школе-конференции аспирантов и молодых учёных «Материалы и технологии XXI века (Казань, 2016).
Связь с научными программами. Работа выполнена в рамках базовой части государственного задания № 342 (от 01.02.2014 г.), при частичной финансовой поддержке гранта РНФ № №14-36-00023 и премии Губернатора Оренбургской области для талантливой молодежи (2014 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в журналах, индексируемых в базе данных Web of science и Scopus, 4 – в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ для публикации результатов диссертационных исследований; получен 1 патент РФ на изобретение.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 194 страницах машинописного текста, включает 26 рисунков и 5 таблиц. Список литературы представлен 349 наименованиями, из них 287 изложены на иностранных языках.
Молекулярная организация факторов защиты растений от активных форм кислорода и окислительного стресса
Наиболее стабильной умеренно реактивной формой активированного кислорода является Н2О2, способная диффундировать на большие расстояния в воде (Tiwari et al., 2012), быть и окислителем, и восстановителем (Gapper, Dolan, 2006; Gill et al., 2010). Переход Н2О2 через мембрану осуществляется через белки-аквапорины (Sharma et al., 2012). Внутриклеточно Н2О2 образуется в результате ферментативных реакций с оксидазами флавиновой природы или цитохромоксидазы путем переноса двух электронов на молекулу О2 (Bhattacharjee, 2012), а также в реакциях аутоокисления некоторых FeS-белков с высвобождением «свободных» ионов железа и восстановления O2- в реакции дисмутации (Hernandez Barrera et al., 2015). В растительной клетке основным местом образования O2- является не дыхательная цепь, а цитоплазма, где функционирует фермент супероксиддисмутаза (СОД), ответственный за основной поток Н2О2 в клетках. За счет действия ферментов защиты от Н2О2 ее концентрация в клетках растений поддерживается на стабильно низком уровне (Levine et al., 1994) и составляет 10-7-10-6 М, в то время как порог токсичности Н2О2 находится в области концентрации 10-5 М (Гуськов и др., 2009). Н2О2 выступает сигнальной молекулой и определяет интенсивность фотодыхания, фотофосфорилирования, фунгицидотоксичность поверхности листьев, активирует процессы прорастания семян за счет окисления ингибиторов роста и снабжения зародыша О2 (Полесская и др., 2007). Помимо функционирования в качестве сигнальной молекулы, Н2О2 является и субстратом стресс-индуцируемых реакций, таких как ингибирование фотосинтетического транспорта электронов на уровне Фотосистемы II (ФСII) и запуск апоптоза (Desikan et al., 1999). Наиболее активной формой из всех АФК считают OH (Гуськов и др., 2009), который представляет собой наиболее короткоживущую АФК. Основным источником образования OH служит реакция одноэлектронного восстановления Н2О2 – Фентона (Karuppanapandian et al., 2011). При этом, источником доноров электронов являются металлы переменной валентности в низшей степени окисления (Fe2+, Cu+, Ni2+, Co2+) (Weidinger, Kozlov, 2015). Наиболее часто используются ионы Fe2+ ввиду более высокой концентрации в клетке, которые выделяются из Fe-S кластеров редокс активных ферментов после разрушения последних O2- (Imlay, 2003). При наличии в биологической среде O2-, реакция может протекать в две стадии, которые впервые описаны Хабером и Вайсом (Haber, Weiss, 1934) и дополнены (El-Bahr, 2013). Дополнительным источником ОН является реакция взаимодействия железа с гипохлоритом. В целом, образование ОН происходит в местах локализации хелатированного железа, электростатически взаимодействующего с полианионными биомолекулами, например, ДНК (Гуськов и др., 2009; Zitka еt al., 2013). ОН действует путем отрыва водорода или электрона, образования двойных связей в биомолекулах или путем присоединения к их двойным связям, разрыв С-Н связи и часто инициирует цепные реакции, подобные перекисному окислению липидов (ПОЛ) мембран, где продукты реакции вызывают дальнейшие повреждения клеточных компонентов (Weidinger, Kozlov, 2015). В растениях ОН участвует в изменении структуры ксилогликанов клеточной стенки, способствуя изменению ее плотности в зоне растяжения (Полесская и др., 2007).
Самое низкое состояние электронного возбуждения кислорода называют синглетным 1О2 (Ovchinnikov et al., 2010), который, как следствие, является экстремально долгоживущим в газовой фазе, нестабильным в воде и в полярных растворителях (Гуськов и др., 2009). У большинства живых организмов основным источником генерации 1O2 служит спонтанная дисмутация О2- в реакции диспропорционирования с Н2О2 или ОН (El-Bahr, 2013). Однако, 1О2 может возникать и как побочный продукт в реакции разложения Н2О2 каталазой или пероксидазой (Weidinger, Kozlov, 2015). В растениях 1О2 может быть сгенерирован в фотовозбуждаемых процессах переноса энергии от окрашенных молекул пигментов (хлорофилла, ретиналя, флавинов, порфиринов) при спонтанном разложении триоксида водорода в воде или в реакции Н2О2 с хлоридом или гипохлоритом (Гуськов и др., 2009). 1О2 крайне реакционноспособен в отношении молекул с двойной связью, может реагировать с белками, пигментами и липидами, и вызывает потерю активности ФС II (Okada et al., 1996).
Итак, АФК играют роль сигнальных молекул у растений (Креславский и др., 2012; Bhattacharjee, 2012). К системам, генерирующим АФК относятся пероксисомы (ксантиноксидаза), клеточная стенка (пероксидаза, оксалатоксидаза) (Liszkay et al., 2004), цитозоль (автоокисление, неферментативные реакции, пероксидаза), ядро, аппарат Гольджи и митохондрии (Del Rio et al., 1998; Vranova et al., 2002). Продукцию АФК также регулируют небольшие ras-белки (Lee et al., 1999). Сверхпродукция АФК происходит при нарушениях в ЭТЦ в митохондриях (комплексы I и III дыхательной цепи переноса электронов) и хлоропластах (ФСI и ФСII), а также в результате деятельности НАДФН-оксидазы (Полесская, 2007), которая активируется при ответе растений на стресс. Такая активация приводит к продукции О2- и его спонтанной дисмутации до Н2О2 (Мерзляк, Погосян, 1988). Образование O2-, ОН и Н2О2 наблюдается преимущественно в зоне роста корня, а у злаковых большей редокс-активностью обладает зародыш (Mak et al., 2006).
Наночастицы металлов и их оксидов
Определение содержания растворимых полифенолов проводили по методу, основанному на взаимодействии экстракта с реактивом Фолина 59 Чокальтеу («Applichem», Германия), состоящего из солей фосфорновольфрамовой и фосфорномолибденовой кислот. В щелочной среде эти соли при взаимодействии с ФС восстанавливаются с образованием окрашенных в синий цвет комплексов (Сибгатуллина и др., 2011). Для извлечения ФС использовали этанол, который наиболее эффективно экстрагирует производные фенолкарбоновых кислот и флавоноидов, катехины и дубильные вещества (Щербакова, 2002). Для анализа 50 мг листьев и корней растирали в ступке с 1 мл 80% этанола, экстракты пересили в плотно завинчивающиеся пробирки типа «Эппендорф» на 1,5 мл и доводили до метки растворителем. Пробы инкубировали на водяной бане при 80С в течение 30 мин. Полученный экстракт осаждали при 12000 g в течение 10 мин. Супернатант сливали в пробирку на 2 мл. К осадку добавляли 500 мкл 80% этанола, взбалтывали и ещё раз центрифугировали при тех же условиях. Супернатанты объединяли и конечный объём доводили до 2 мл.
Реакционная смесь содержала 500 мкл экстракта и 2,5 мл реактива Фолина-Чокальтеу. Затем через 3 мин в смесь добавляли 2 мл 75 г/л Na2CO3, после чего она в разной степени синела. В контрольные пробирки добавляли 500 мкл 80% этанола. Пробирки с реакционной смесью хорошо встряхивали и оставляли на 2 ч. Измерение ОП проводили на спектрофотометре при =765 нм. Содержание ФС в экстракте определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по кверцетину. Далее рассчитывали содержание внутриклеточных ФС в образцах по формуле:
Ф = (СVэкстракта)/(m1000) где ФС – общее содержание внутриклеточных ФС, мг-экв кверцетина/г сырого веса; С – концентрация ФС исходя из ОП образцов по калибровочной кривой, мг-экв кверцетина/л; Vэкстракта – общий объём экстракта, мл; m – масса навески, г; 1000 – коэффициент перевода л в мл. 2.2.6.2 Определение антиоксидантной активности фенольных соединений Антиоксидантную активность (АОА) ФС определяли по модифицированному методу, основанному на измерении OП смеси стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидрозила (ДФПГ) («Sigma-Aldrich», США) с анализируемым экстрактом (Lo et al., 2004). Суть метода заключается в снижении ОП раствора ДФПГ в присутствии АО. Экстракты ФС получали, как описано выше. Реакционная смесь содержала: 250 мкл фенольного экстракта, 1,75 мл 80% этанола и 2 мл 0,2 мМ ДФПГ. В контрольные пробирки вместо фенольного экстракта добавляли 2 мл 80% этанола. Реакцию запускали добавлением раствора ДФПГ в 80% этаноле. Пробирки хорошо встряхивали и оставляли в темноте при комнатной температуре на 30 мин. По истечении времени измеряли ОП при =517 нм.
Рассчитывали процент ингибирования ДФПГ для построения калибровочной кривой и образцов по формуле:
% ингибирования ДФПГ = 100(ОПк – ОПао)/ОПк где ОПк – оптическая плотность без АО (контроль); ОПао – оптическая плотность с АО (сток-раствор водорастворимого витамина Е – Тролокса («Acros organics», США) на 80% этаноле.
По полученным данным строили калибровочную кривую в координатах % ингибирования ДФПГ-концентрация Тролокса, и определяли АОА в мкМ-экв Тролокса.
Сложный характер накопления соединений фенольной фракции при воздействии НЧ затрудняет их идентификацию, поскольку ФС одна из наиболее сложных для анализа группа растительных метаболитов (особенно у злаков) (Афанасьев, Березина, 2011). Полифенольные соединения могут быть связаны с другими компонентами клетки, такими как углеводы и белки (Xu, Chang, 2007), что искажает результат их определения. Поэтому более подходящим инструментальным методом исследования оказался высокочувствительный метод Фурье инфракрасной (ИК)-спектроскопии, позволяющий быстро обнаружить широкий спектр функциональных групп и изменения в молекулярной структуре, а также устанавливающий за счет каких связей происходит взаимодействие между молекулами (Amir et al., 2011; Уилсон, Уолкер, 2015). Однако выбрать характерный участок спектра ФС растительных экстрактов не представляется возможным вследствие разнообразного состава и усложненности за счет наложения целого ряда полос пропускания. Поэтому в нашем случае мы использовали метод оценки степени окисления путем сравнения отдельных максимумов ИК спектров контрольных образцов, а также их частотные сдвиги, и сравнение интенсивности колебаний разных характеристических частот со спектром опытных вариантов. Рациональность такого подхода мы показали в in vitro постановке окисления субстанции дигидроксибензола (Короткова, Давыдова, 2015), широко представленного в пшенице (Liu и др., 2012). Для окисления нами использовалась молекулярная модель генерации суммы АФК, основанная на спонтанном реокислении фотовосстановленного флавина, катализируемого тетраметилэтилендиамином (ТЕМЕДом) (Гривенникова, Виноградов, 2013).
Влияние наночастиц металлов и их оксидов на энергию прорастания семян Triticum vulgare
Совершенно другая картина наблюдалась у растений при аналогичном воздействии НЧ Cu. Так, наряду с появлением темно-бурой окраски листьев, регистрировалось снижение содержания пула Хл в среднем на 19%. Из данных, представленных на Рисунке 3.1.3, видно, что металл вызывал снижение Хл a на 23-33% даже в концентрации в 4 раза меньшей максимальной дозы (0,0125 М). При этом уровень Хл b оставался близким к контролю или изменялся не достоверно. Вероятно, в этих условиях связано с наличием меди, повреждающей пигменты (Maksymiec et al., 1995).
Вместе с тем, при обработке CuO общее снижение суммы Хл (а+b) по отношению к контролю составляло 12%. По отдельно взятым пигментам следует отметить, что небольшие концентрации оксида (от 0,0125 до 0,05 М) в большей степени уменьшали количество Хл b (на 4-24% к контрольному варианту), а концентрации более 0,05 М – снижали сумму Хл а (на 9%-21,5%). Другими исследователями также отмечалось общее снижение суммы ФП после обработки НЧ CuO (Shi et al., 2011; Dimkpa et al., 2012; Nair, Chung, 2014).
Следует отметить, что НЧ Ni также оказывали воздействие на содержание обеих форм Хл (а+b) в листьях T. vulgare – в среднем показатель снижался на 18,5%. С увеличением концентрации металла в среде эффект только усиливался. В данном аспекте более чувствительной к Ni оказался Хл b. В эксперименте получено резкое снижение уровня пигмента на 45,5%, 54% и 81,8% при воздействии 0,05, 0,1 и 1 М металла. Вместе с тем, значения содержания Хл а снижались не более чем на 10% (Рисунок 3.1.3). Наряду с этим, проращивание проростков с NiО не вызывало существенного отклонения в содержании Хл (а+b) от контрольных значений.
Параллельный анализ содержания каротиноидов в листьях проростков T. vulgare показал, что данная группа ФП в наших экспериментах оказалась менее чувствительна к НЧ металлов по сравнению с Хл (Рисунок 3.1.3). Однако, после обработки Fe и Cu было выявлено увеличение каротиноидов по сравнению с контролем до 30% (Р 0,05), что свидетельствует о нарастании окислительных процессов или первичной неспецифической реакции растений на стресс (Кузнецов, Дмитриева, 2016). Напротив, достоверное, но незначительное (менее 10%) отклонение уровня каротиноидов от нормы (0,1-0,5 мг/г сырого веса) в вариантах с остальными металлами CuО, Ni и NiО можно рассматривать в качестве одного из адаптационных механизмов, обеспечивающих эффективное поглощение энергии и предотвращение повреждений фотосинтетического аппарата (Казнина и др., 2016) и хлорофиллов от избыточной энергии триплетных Хл и 1О2 (Мерзляк, 1989; Ладыгин, Ширшикова, 2006; Strzalka, Widomska, 2008).
Однако, из-за разной чувствительности физиологически отличающихся между собой ФП и в целом пигментного комплекса тестируемых проростков, в ответ на действие нанометаллов целесообразно определить их соотношение (Хл a/b и Хл(a+b)/каротиноиды). Эти величины в норме стабильны, однако способны быстро изменяться под действием стрессовых факторов (первое соотношение увеличивается, а второе – уменьшается). Величина, характеризующая отношение содержания Хл а/b, в норме колеблется в пределах 2,5-3,0. Относительное изменение стехиометрического соотношения указывает на нарушение биодоступности азота, а также о структурных перестройках в мембранах хлоропластов, а именно в комплексах реакционных центров фотосистем и светособирающего комплекса II фотоситетического аппарата. В частности, снижение Хл а свидетельствует о дестабилизации работы реакционных центров и периферических антенных комплексов ФС I и ФС II, а Хл б – преимущественно компонентов светособирающего комплекса II (Титов и др., 2007; Казнина и др., 2016). Согласно полученным данным, отношение содержания Хл а/б при действии более Ni в концентрации 0,05 М и более существенно увеличивалось (до 27% по отношению к контролю) (Приложение 3, Таблица 3). Наблюдаемое снижение содержания Хл б, по видимому, вызвано ионами никеля, которые обуславливают опосредованное повреждение светособирающего комплекса (Ouzounidou, 1996; Rico et al., 2015). Одновременно с этим, отношение Хл а/б достоверно уменьшалось на 25% при обработке Cu, что может говорить о нарушении в работе ФС I (Siddiqui et al., 2015), ускорении перехода Хл аb, или интенсивном процессе распада Хл а. По-видимому, НЧ, содержащие Cu как металл переменной валентности, могли непосредственно участвовать в образовании радикалов ОН (в реакциях Фентона и Хабера-Вейса) и 1О2 в клетках, что приводило к окислительной деструкции Хл (Полесская, 2007). С другой стороны, наномедь могла высвобождать ионы Cu2+ или Cu+, и вызывать метаболические эффекты характерные для последних – искажать строму и граны мембран хлоропластов (Siddiqui et al., 2015).
Наночастицы металлов и их оксиды как модификаторы фенольных метаболитов в проростках Triticum vulgare
Немаловажным экспериментальным фактом явилось увеличение количества корневых волосков зоны поглощения корней исследуемых проростков в случае с Ni и прилипание их агломератов (даже после промывания корней) (Рисунок 3.3.1.3), что является признаком фосфатного голодания и стресс-реакции на недостаток питательных веществ (Siddiqui et al., 2015). Вполне допустимо, что показанные ранее свойства НЧ Ni сохранять свой заряд и стабильность в условиях ионной среды, позволяют им электростатически взаимодействовать с компонентами корней (корневые волоски, корневые экссудаты, слизь корневого чехлика) (Zhou et al., 2011). Связывание нано-Ni со слизью, показанное на Рисунке 3.3.1.2 Б, может быть вызвано высокой афинностью металла к слизи, а именно к их N-лигандам (Singel, 1986; Geisler-Lee et al., 2013). Подобные эффекты с изменением количества корневых волосков и вероятным разрушением клеток апекса корня встречались в литературных источниках в присутствии нано-Ag (Yin et al., 2011; Geisler-Lee et al., 2013). Отсюда следует, что Ni, вероятно, вызывал с «экранирование» поверхности корня растений (Lee et al., 2008), и, соответственно, нарушением скорости дыхания, поступления питательных субстратов и воды (Geremias et al., 2010). Все это приводит к обезвоживанию и энергодефицитному состоянию клеток-«мишеней» (Chandra et al., 2009; Siddiqui et al., 2015).
Известно, что молекулы ДНК имеют несколько центров связывания ионов металлов: отрицательно заряженные атомы кислорода фосфатных групп, гидроксильные группы сахаров, эндоциклические атомы азота и экзоциклические кетогруппы оснований, при этом связывание высокоспецифично и зависит от природы иона (Anastasopoulou, 2003). В клетке ионы щелочных и щелочноземельных металлов обычно взаимодействуют с фосфатными группами ДНК с образованием ионных связей, а ионы переходных металлов в более высоких концентрациях активно связываются с кетогруппами оснований (Hackl et al., 2005; Quameur et al., 2005), а в низких – с сахаро-фосфатным остовом (Terrona, 1993; Henle et al., 1999). Важно подчеркнуть, что карбоксильные и карбонильные группы также имеют большое сродство к поверхности частиц переходных металлов и их оксидов (Wu et al., 2004), особенно когда происходит протонирование поверхности, увеличение адсорбции и плотности покрытия (Persson et al., 1996). В литературе также приводятся данные о высокой адсорбционной активности НЧ оксидных ферримагнетиков относительно молекул ДНК (Dutta et al., 2006). Известно, что прямые генотоксические эффекты металлов довольно слабы и/или ограничиваются высокой их концентрацией (более чем 1 мМ) (Hartwig, 1998). Однако, отсутствуют данные о прямом взаимодействии НЧ переходных металлов с молекулами ДНК, выделенных из растений. Поэтому в целях изучения непосредственного влияния НЧ Ni на ДНК апикальной части корней T. vulgare на первом этапе было проведено исследование, направленное на сравнение времени экспозиции на степень повреждения молекул в условиях in vitro. На Рисунке 3.3.2.1.1 видно, что после 24 и 48 часов инкубации ДНК, выделенной из корневой части пшеницы, с 0,1 М Ni в эксперименте in vitro регистрировалось увеличение доли фрагментов массой менее 3000 н.п. на 35 и 38% относительно контроля.
Вместе с тем, исследования in vitro не могут полностью заменить исследований in vivo вследствие возможного взаимодействия НЧ с химическими реагентами, применяемыми для выделения ДНК, специфического отклика клеток на введение металлов (Годымчук и др., 2012). Анализ электрофоретической подвижности ДНК, выделенной из корней проростков после 48-часовой обработки НЧ Ni показал выраженную деградацию ДНК. Так, в концентрациях от 0,0125 до 1 М металл способствовал увеличению линейных низкомолекулярных фрагментов от 60 до 79% относительно контроля (Рисунок 3.3.2.1.2). Существенно, что деградация хроматина несла апоптотическую форму и на электрофореграмме проявлялась в виде апоптозной «лестницы» («леддера») из мультимеров размером кратным 180-200 н.п., свидетельствующих о вероятной рестрикции хроматина в розеточных петлях каспазами или эндонуклеазами (Koukalova 1997; Ванюшин, 2001). Лестницеообразная деградация растительной ДНК ранее показана на примере повреждения молекул в корнях Alium cepa наночастицами TiO2 (Siddiqui et al., 2015).