Влияние экзогенных регуляторов роста на степень токсичности тяжелых металлов для растений пшеницы Грузнова Кристина Александровна

Содержание к диссертации

Введение

I Аналитический обзор 11

1.1 Тяжелые металлы в растениях 11

1.2 Токсическое действие тяжелых металлов на физиологические параметры растений

1.3 Механизмы адаптации и толерантности растений к действию тяжелых металлов

1.4 Общая характеристика регуляторов роста и их значение для растений

II Материалы и методы 33

2.1 Объекты исследования 33

2.2 Постановка эксперимента 34

2.3 Методы исследования 35

III Аккумуляция и действие тяжелых металлов на физиологические и биохимические процессы в растениях пшеницы

3.1 Содержание ионов тяжелых металлов в осевых органах пшеницы

3.2 Ростовые параметры растений пшеницы 46

3.3 Скорость генерации супероксидного анион-радикала в листьях растений пшеницы

3.4 Интенсивность перекисного окисления липидов в листьях пшеницы

3.5 Проницаемость клеточных мембран листьев пшеницы 56

3.6 Активность антиоксидантных ферментов в листьях пшеницы 58

IV Влияние регуляторов роста на физиологические и биохимические параметры растений пшеницы при действии ионов тяжелых металлов

4.1 Влияние цитодефа на физиологические и биохимические параметры растений пшеницы при действии тяжелых металлов

4.2 Влияние тидиазурона на физиологические и биохимические параметры растений пшеницы на фоне ионов тяжелых металлов

4.3 Влияние Рибав-Экстра на физиологические и биохимические параметры растений пшеницы на фоне ионов тяжелых металлов

4.4 Влияние Эпин-Экстра на физиологические и биохимические параметры растений пшеницы при действии тяжелых металлов

V Сравнительная характеристика эффективности регуляторов роста для растений пшеницы при действии тяжелых металлов

Заключение 106

Выводы 108

Список использованных источников

• Токсическое действие тяжелых металлов на физиологические параметры растений
• Постановка эксперимента
• Проницаемость клеточных мембран листьев пшеницы
• Влияние Рибав-Экстра на физиологические и биохимические параметры растений пшеницы на фоне ионов тяжелых металлов

Введение к работе

Актуальность проблемы. Иoны тяжeлыx метaллов (ТМ) в пoвышeнных кoнцентрaциях оказывают тoксическое действиe на растeния (DalCorso et. al., 2008; Казнина и др., 2008; Титов и др., 2011; Kholodova et. al., 2011; Emamverdi-an et al., 2015). В последние десятилетия наблюдается возрастающее загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами, в том числе на землях сельскохозяйственного назначения (Лебедев и др., 2015). Это приводит к усилению поглощения ТМ культурными растениями, нарушениям физиологических процессов, ухудшению качества продукции (Серегин, Кожевникова, 2006; Титов и др., 2007; Башмаков, Лукаткин, 2009; Гришко, Сыщиков, 2012; Казнина, Титов, 2013; Титов и др., 2014; Михайлова, Лукаткин, 2016; Шумакова, 2016). Одной из ведущих культур России является пшеница (...), которая возделывается на территории 25,5 млн. га, в том числе – на почвах, загрязненных ТМ (Лебедев и др., 2015). Поэтому весьма актуален поиск путей снижения аккумуляции и токсического действия ТМ в растениях озимой пшеницы.

Регуляторы роста (РР) позволяют повысить устойчивость растений к неблагоприятным условиям окружающей среды (Бессонова, 1992; Веселов, Фахрисламов, 1999; Bajguz, 2000; Лукаткин, 2002; Kaur, Bhardwaj, 2003; Лукат-кин, Овчинникова, 2009; Кошкин, 2010; Шаповал и др., 2010; Шаповал и др., 2015). Однако работ по применению РР для снижения токсического действия ТМ на растения сравнительно немного (Прусакова, Чижова 2005; Janda et al., 2007; Башмаков, Лукаткин, 2009; Bajguz, Hayat, 2009; Barbafieri, Tassi, 2011; Elobeid, Polle, 2012). Показано, что РР разной химической прирoды способствовали снижению аккумуляции ТМ и их негативных эффектов в растениях (Vod-nik et. al., 1999; Bilkisu et. al., 2003; Janeczko et. al., 2005; Бондаренко, Зволин-ский, 2016; Грузнова и др., 2016); однако имеются и противоположные данные – что некоторые РР усиливали накопление тяжелых металлов в тканях растений (Gadallah, El-Enany, 1999; Drazic et al., 2005, 2006). Такие противоречивые сведения о роли РР в аккумуляции ТМ и модификации их токсического действия в растениях требуют сравнительного изучения эффектов различных РР в растениях, подверженных действию ТМ в разных концентрациях.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: изучить влияние экзогенных регуляторов роста различной природы на аккумуляцию тяжелых металлов в проростках пшеницы, физиологические и биохимические реакции растений пшеницы на различные дозы тяжелых металлов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить содержание ТМ в осевых органах растений пшеницы при выращивании на различных дозах тяжелых металлов.

2. Изучить влияние ТМ на физиолoгические и биохимические прoцеcсы в растениях.

3. Проанализировать влияние предпосевной обработки регуляторами роста на содержание ТМ, ростовые параметры и состояние клеточных мембран растений пшеницы при действии ТМ.

4. Изучить влияние экзогенных регуляторов роста на про- и антиоксидантную активность растений пшеницы на фоне различных концентраций ТМ.

5. Разработать критерии сравнительной оценки эффективности РР при действии ТМ.

Основные положения, выносимые на защиту:

6. Ионы тяжелых металлов в высоких дозах (1 мМ) оказывают на молодые растения пшеницы токсическое действие, в основе которого лежит возникновение окислительного стресса. Он проявляется повышением скорости генерации О₂^-, усилением перeкисного окисления липидов (ПОЛ), изменениями активности каталазы и аскорбат-пероксидазы, и сопровождается изменениями роста и проницаемости клеточных мембран.

7. Предпосевная обработка регуляторами роста снижает содержание тяжелых металлов как в корнях, так и в надземной части растений пшеницы, выращенных на растворах ТМ, и ослабляет тяжесть стрессорных воздействий, главным образом через изменение антиоксидантного статуса клетки. Эффекты регуляторов роста (особенно цитокининовой природы) варьируют на фоне различных металлов и их концентраций.

8. Сравнительная эффективность различных РР на растениях пшеницы, подвергнутых действию ТМ, может быть определена на основе индекса эффективности, в основе которого лежит совокупность физиологических и биохимических ответных реакций растений. Наиболее действенными для растений пшеницы оказались препараты Рибав-Экстра и Эпин-Экстра.

Научная новизна. Проведено комплeксное исследование действия ТМ и РР различной природы на физиологические и биохимические процессы в растениях пшеницы. Показано, что при действии ТМ на растения возникает окислительный стресс, который характеризуется усилением генерации активных форм кислорода (АФК) и ПОЛ, а также изменением антиоксидантной активности. Выявлено, что природный регулятор (Рибав-Экстра) и синтетические РР цитокининовой (цитодеф, тидиазурон) и брассиностероидной (Эпин-Экстра) природы способствовали улучшению физиологических характеристик растений

пшеницы как в нормальных условиях, так и при действии ТМ. Впервые показано дифференцированное влияние регуляторов роста на про-/антиоксидантную активность растений пшеницы: цитодеф и тидиазурон могут оказывать как си-нергическое, так и антагонистическое с ионами ТМ действие, тогда как Эпин-Экстра и Рибав-Экстра оказывали антагонистическое с ТМ действие.

Научно-практическая значимость работы. Разработан методологический подход к оценке эффективности регуляторов роста на растения при действии стрессора (ТМ) по степени изменений физиологических и биохимических параметров, характеризующих окислительный стресс.

Полученные результаты указывают на возможность использования экзогенных РР (в первую очередь Эпин-Экстра и Рибав-Экстра) для снижения токсического действия ТМ при выращивании озимой пшеницы на почвах, загрязненных ТМ.

Полученные рeзультаты мoгут быть использовaны при разрaботке технолoгий повышeния стреcсoустойчивости и прoдуктивности культурных растeний, в адaптивных системах растeниеводства; в учебном процeссе при чтении лекций и проведении лаборaторных занятий по курсам «Экологическая физиoлогия растeний», «Физиoлогия растений», «Регуляция рoста и развития растений», «Растeние и стресc» и др.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены и доложены на научных конференциях: VI, VІІ Международных научно-практических конференциях «Тяжелые металлы и радионуклиды в окружающей среде» (Семипалатинск, 2010; Семей, 2012), VII Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2011), «Climate change: Agro- and forest systems sustainability» (Babtai, 2011), Symposium on Carotenoids Towards a Brighter Side of Life (Krakow, 2011), Международной научной конференции и школе молодых ученых «Физиология растений – теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехнологий» (Калининград, 2014), 4 и 5 Всероссийских научно-практических конференциях «Управление качеством образования, продукции и окружающей среды» (Бийск, 2010, 2011), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Plants under Environmental Stress) (Москва, 2010), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз России 2010» (Нижний Новгород, 2010), Третьем международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011), VII Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений и фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной школе «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011), Всероссийском симпозиуме «Экология мегаполисов: фунда-

ментальные основы и инновационные технологии» и Школе для молодых ученых по экологической физиологии растений (Москва, 2011), IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), Всероссийской (с международным участием) научной конференции «Биологические аспекты распространения, адаптации и устойчивости растений» (Саранск, 2016), XIV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета имени Н. П. Огарева (Саранск, 2010), Третьих чтениях памяти профессора О.А. Зауралова (Саранск, 2011), XXXIX Огаревских чтениях (Саранск, 2011).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, в числе которых 5 статей в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах печатного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа включает 24 рисунка и 24 таблицы. Список литературы содержит 269 источников, из них 155 на иностранных языках.

Токсическое действие тяжелых металлов на физиологические параметры растений

Тяжелые металлы – это химические элементы с плотностью более 5 г/см3 и атомной массой свыше 40 Да, обладающие свойствами металлов (Кузнецов, Дмитриева, 2006). Многие тяжелые металлы в оптимальных дозах являются эссенциальными для растений и животных, выполняя жизненно важные функции в физиологических процессах организмов и в биосфере (Гусев, Немерешина, 2003; Немерешина, Гусев, 2013). ТМ принимают участие в процессах метаболизма, вступая в тесную связь с БАВ – белкaми, ферментами, а также витaминами и гормoнами (Полевой, 1989; Протасова, 1998; Clemens, 2001; Clemens et al., 2003).

По негативному действию на высшие растения ТМ располагаются в следующем убывающем порядке: Cd Cu Pb Cr Ni Zn. Некоторые тяжелые металлы (Ni, Cu, Mo, Zn) являются незаменимыми элементами для жизнедеятельности организма. Они входят в состав целого ряда ферментов и участвуют в биохимических и физиологических процессах (Blindauer, Schmid, 2010; Kramer et al., 2007; Hansch, Mendel, 2009; Husted et al., 2011). Металлы, такие как Cu, Ni, Zn, в определенных концентрациях не только стимулируют ростовые процессы, но и повышают иммунитет растений (Полевой, 1989; Башмаков, Лукаткин, 2009; Титов и др., 2014). Поскольку в природных условиях при естественном расселении растения могут попасть в условия с неблагоприятным, недостаточным содержанием химических элементов, ряд ТМ применяют в качестве микроудобрений (Башмаков, Лукаткин, 2009).

Повышенное количество тяжёлых металлов, поступающих в живые организмы, оказывает токсическое действие, способствуя проявлению различных патологий в объектах биосферы (Немерешина и др., 2011; Дрогайцева, Петрова, 2014).

Цинк – эссенциальный элемент (среднее содержание в растениях 20-60 мг/кг сухой массы) (Rout, Das, 2003). Это микроэлемент, который необходим для роста и развития растений и используется в следующих метаболических процессах (Cakmak, Marschner, 1993; Третьяков и др., 2005; Ли и др., 2008): 1) стабилизация структуры многих белков, в том числе некоторых последовательностей регуляторов транскрипции (Сапрыкин, 1984; Howden et all, 1995); 2) регуляция азотного обмена; 3) деление клеток; 4) синтез ауксинов; 5) является кофактором для многих ферментов (в том числе участвующих в детоксикации АФК) (Cakmak, 2000; Ishimaru et al., 2005); 6) активирует су-пероксиддисмутазу (Christov, Bakardjieva, 1999).

Дефицит цинка как микроэлемента в почве – широко распространенное явление, снижающее урожайность сельскохозяйственных культур и содержание цинка в продуктах сельского хозяйства, что в итоге ведет к дефициту цинка в рационе человека (Ruel, Bouis, 2000). Характерные признаки дефицита цинка в растениях: задержка роста междоузлий и листьев, развитие ро-зеточности и мелколистности, накопление редуцирующих сахаров (Серегин, Иванов, 2001), уменьшение содержания сахарозы и крахмала, увеличение количества органических кислот и небелковых соединений азота – свободных аминокислот и амидов (Полевой, 1989), нарушение фосфорного обмена (Третьяков и др., 2005), резкое уменьшение митотической активности клеток корневой меристемы, увеличение числа хромосомных аберраций (Серегин, Иванов, 2001).

Цинк поступает в растение в виде Zn2+, а также в комплексах небелковых аминокислот (фитосидерофы и фитометаллофоры) (Rengel, 1999). В последние годы был достигнут большой прогресс в понимании молекулярных механизмов транспорта цинка в растениях (Ishimaru et al., 2005; Guerinot, 2000; Pence et al., 2000; Moreau et al., 2002; Lopez-Millan et al., 2004; Ramesh et al., 2003) и выявлены белки-переносчики различных металлов, в том числе семейство белков ZIP (от ZRT, IRT-like protein), Zat12 (Eide et al., 1996; Eide, 1996 a,b; Grotz et al., 1998; Guerinot, Eide, 1999; Zhao, Pence et al., 2000; Assuncao et al., 2001; Gaither, Eide, 2001;Moreau et al., 2002; Burleigh et al., 2003; Ramesh et al., 2003; Lopez-Millan et al., 2004; Davletova et al., 2005; Ishimaru et al., 2005; Mizuno et al., 2005).

Известно немалое число видов – гипераккумуляторов цинка, которые вполне успешно растут в присутствии высоких концентраций Zn в почве, но при этом избыток элемента токсичен для растений (Ebbs, Kochian, 1997; Pra-sad, Saradhi, 1995; Rout, Das, 2003).

Среди наиболее типичных симптомов повреждающего действия высо ких концентраций цинка на растения можно назвать ингибирование развития корня, скручивание и отмирание кончиков молодых листьев, хлороз (Кабата Пендиас, Пендиас, 1989), появление хлоротичных пятен, вследствие конку ренции с ионами железа. Связываясь с SH-группами плазмалемных белков, Zn нарушает барьерные свойства мембран, что, в свою очередь, увеличивает концентрацию цинка в цитоплазме. Таким образом, целый ряд биохимиче ских процессов подвергается токсическому действию цинка (Rout, Das, 2003). Цинк не участвует напрямую в окислительно-восстановительных про цессах, но активируя окислительные ферменты, он так же приводит к повы шению концентраций свободных радикалов в клетке, что оказывает отрица тельное действие на мембраны и дестабилизирует ДНК активными формами кислорода (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). Имеются данные о негативном действии токсичных концентраций Zn на фотосинтез из-за дестaбилизирующегo влияния на мембраны хлoропластoв и сам хлорoфилл (Карпачев, 2008).

Постановка эксперимента

Длины корней и надземной части растений пшеницы измеряли на миллиметровой бумаге с точностью 0,5 мм.

Сырую и сухую массу и содержание воды определяли для корней и надземной части пяти растений. Взвешивали высушенные (из эксикатора) пустые бюксы на аналитических весах. В каждый из них помещали корни и побеги, отделенные от 5 растений. Для каждого варианта опыта готовили минимум по три бюкса с корнями и по три бюкса с побегами. Измеряли массу бюксов с растениями и помещали их в сушильный шкаф на 10 – 11 час при температуре 95 С, затем досушивали до постоянной массы при температуре 100 – 105 С (Большой практикум…, 2015). Бюксы с высушенными проростками взвешивали. Содержание влаги в растениях: W = (Mсыр – Mсух)/Mсыр 100 (%), где Mсыр – сырая масса корней (побегов), мг; Mсух – сухая масса корней (побегов), мг; W – содержание воды в растении, %. Измерение проницаемости мембран кондуктометрическим методом. Состояние клетoчных мембран опредeляли по выходу электрoлитов из высечек листьев в дистиллиpованную воду на кoKдуктометре ОК-102 («Radeliks», Венгрия) с платиновым электрoдом при частoте 3 кГц (Зауралов, Лукаткин, 1985). Для этого брали 3 г листьев растений кaждого варианта, делили их на 6 параллельных усрeдненных навесок листовой ткaни по 0,5 г, тщательно промывали дистиллирoванной водой для удaления клеточного сoка со срезов, обсушивали фильтровальной бумагой и заливали каждую навеску 100 мл дистиллированной воды. Экстракцию проводили при комнатной температуре (22 - 24 С) в течение 4 часов. Выход электролитов из листовой ткани в дистиллированную воду определяли по изменению электропроводности раствора. При этом из полученных значений вычитали электропроводность воды. После экстракции стаканчики с растительным материалом доводили до кипения, остужали до комнатной температуры, доводили объем до 100 мл и определяли полный выход электролитов по электропроводности той же вытяжки. Результирующий выход электролитов рассчитывали в процентах от полного выхода (Гришенкова, Лукаткин, 2005). Степень повреждения клеток в различных вариантах оценивали по величине коэффициента повреждаемости (КП) по формуле: L -L КП = 0х100% 100 -4 где Ld - выход электролитов из ткани подвергнутой действию ТМ, в процентах от полного выхода электролитов; L0 - выход электролитов из ткани контрольных растений, в процентах от полного выхода электролитов. Величина Ld является относительной мерой выхода электролитов, вызванного действием ТМ и может быть принята пропорциональной количеству (или интенсивности) «повреждений», вызванных стрессами в клеточных мембранах. Следовательно, рассчитанные значения повреждений (КП) отражают выход электролитов, вызванный только действием стрессоров (Заура-лов, Лукаткин, 1985; Гришенкова, Лукаткин, 2005).

Определение интенсивности перекисного окисления липидов. Навеску ткани листьев (1 г) гомогенизировали в 10 мл среды выделения (0,1 М трис-НС1 буфер, рН 7,6, содержащий 0,35 М NaCl). К 3 мл гомогената добавляли 2 мл ТБК в 20% ТХУ, нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут и фильтровали. Оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре при длине волны 532 нм против среды выделения с реагентом. В основе метода цветная реакция МДА и ТБК. Концентрацию МДА рассчитывали по молярной экстинкции (s=l,56-K lVrW1) (Лукаткин, Голованова, 1988). Количество МДА в листьях рассчитывали в мкМ / г сырой массы листьев по формуле: С = D/ є х 1 х щ, где С - концентрация МДА, D - оптическая плотность, є - коэффициент молярной экстинкции, 1 - длина оптического пути, m - масса навески.

Определение скорoсти генерации супероксиднoго анион-рaдикала. Высечки листьев (300 мг) гомогенизировали в 15 мл дистиллированной воды. Затем гомогенат центрифугировали 15 минут при 4000g. К 3 мл супернатанта добавляли 100 мкл раствора адреналина (0,01%), и инкубировали 45 минут при комнатной температуре и освещенности 2000 лк. Сразу после инкубации измеряли оптическую плотность образовавшегося адренохрома против гомо-гената с водой на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 480 нм. Скорость генерации 02- рассчитывали в мкМ/гмин (Purvis et al, 1995) по формуле: С =D/ є х m х t, где С - концентрация, D - оптическая плотность, є - коэффициент молярной экстинкции (4020 М см"1), m - масса навески, t - время инкубирования. Активноcть аскорбат-пероксидaзы определяли по методике (Nakano, Asada, 1981) с модификациями (Лукаткин, 20026). Высечки листьев массой 1 г гомогенизировали в 10 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,6) с добaвлением 0,3 г поливинилпиppолидона (ПВП). Получeнную смесь фильтpoвали и центрифугиpoвали 10 мин пpи 8000 g. Реакциoнная смесь состoяла из 50 мкл 0,1 мМ ЭДТА, 300 мкл 0,05 мМ - аскорбинoвой кислоты, 50 мкл перeкиси водоpoда, 2,55 мл фосфатнoго буфеpa (рН 7,6) и 100 мкл раститeльного экcтракта. Оптичecкую плотнoсть регистрировали на спектрoфотометре СФ-46 при длинe волны 290 нм. Контролeм служила слeдующая смесь: 2,75 мл фосфaтного буфера (рН 7,6), 50 мкл ЭДТA, 50 мкл перекиcи водорода, 150 мкл аскорбинoвой кислoты (без фермeнтного экстpaкта). При расчете активнoсти аскорбaт-пероксидaзы использoвали понижение оптической плотнoсти раствора за пeрвые 30 сек реакции с поcледующим расчетом активнoсти по формуле: акт. АПО=D/ х m х t, ммоль / г мин, где D - падение оптичecкой плотности m - масса ткaни, г t - время, за которое произошло пaдение оптической плотности - коэффициент моляpной экстинкции (2,8 мМ -1 см -1)

Определение активности каталазы осуществляли спектрофотометрическим методом по методике (Kumar, Knowles, 1993) с модификациями (Лу-каткин, 2002б). 1 г листьев пшeницы растирали с 10 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,0), получeнный гомогенат фильтровали и центрифугиpoвали 10 мин. при 8000g. Далее регистрировали оптическую плoтность реакционной смеси 2,2 мл фосфaтного буфеpa, 100 мкл получeнного экстрaкта и 70 мкл 3% Н2О2 на спектрoфотометре СФ-46 при длинe волны 240 нм. Перекись водорода приливaли непосредственно перед измерениeм. Контролем служила смeсь из 2,3 мл фосфатного буфepa (pH 7,0) и 70 мкл 3% Н2О2. Измерения провoдили 3 раза. Результаты раccчитывали по падению оптичecкой плотности раствора за 1 мин. с перeсчетом на концентрацию по коэффициeнту молярной экcтинкции = 39,4 мМ -1см - 1 . активность раccчитывали в мМ/г мин по формуле: акт. КАТ==D/ х m х t, ммоль / гмин, где D - падение оптической плотности m - масса ткани, г t - время, за которое произошло падение оптической плотности - коэффициент молярной экстинкции. Определение никеля, свинца, меди, цинка в осевых органах растений пшеницы. На первом этапе проводили озоление пробы и растворение золы. Выращенные растения пшеницы высушивали в сушильном шкафу при 100 ± 5 С до постоянной массы. В фарфоровую чашку помещали сухую навеску побегов (корней) массой 0,01г - 0,02 г, взвешенную с записью результатов взвешивания до четвертого знака. Пробу укладывали в чашку без уплотнения, чтобы в ее нижние слои поступал воздух. Чашку с пробой помещали в холодную муфельную печь и повышали температуру до 250-300 С (до появления дыма). После прекращения выделения дыма температуру муфельной печи доводили до 525±25С и вели прокаливание в течение 2 ч. Отсутствие несгоревших частиц и равномерный светло-серый цвет золы указывали на полное озоление навески.

Чашку с золой охлаждали на лабораторном столе. Золу смачивали несколькими каплями деионизированной воды, добавляли 10-15 мл раствора азотной кислоты, разбавленной деионизированной водой 1:1, накрывали чашку часовым стеклом и нагревали на электроплитке до полного растворения золы. После охлаждения раствор золы из чашки переносили через воронку в мерную колбу вместимостью 100 мл. Чашку, воронку тщательно ополаскивали горячей деионизированной водой, доводили раствор до метки (ГОСТ 30692-2000; Методические указания…, 1992).

Проницаемость клеточных мембран листьев пшеницы

Таким образом, ионы ТМ усиливали выход электролитов из клеток, что указывает на нарушение целостности мембран (Lauro et al., 2011; Dong-Hang, 2007; Костюк и др., 2005).

Результаты исследований проницаемости мембран при действии ионов ТМ свидетельствуют о том, что наиболее негативное воздействие на клеточные мембраны листьев пшеницы оказали ионы свинца (коэффициент повреждения 25 и 66 %), а наименее отрицательное – ионы цинка (коэффициент повреждения 3 и 9 %).

Увеличение продуктов ПОЛ при действии ионов Ni и Cu указывает на серьезные повреждения мембранных липидов. О структурных изменениях мембран при влиянии различных ТМ свидeтельствуют данныe ряда авторов (Meharg, 1993; Ouariti et al., 1997). Так, при действием Сd2+ показано увеличение количества пальмитиновой кислоты и уменьшение содержания лино-леновой и линолевой кислот во всех классах липидов (Ouariti et al., 1997). Изменение проницаемости мембран могло быть следствием изменения их липидного состава, что, наряду с ингибированием мембранных ферментов, вероятно, могло привести к изменению ионнoго баланса в цитоплазме.

Известно, что в разных растениях и при разных стрессах используются одни и теже механизмы, защищающие их от АФК, которые включают в себя такие ферменты как каталазу, аскорбатпероксидазу, глутатионпероксидазу, супероксиддисмутазу и др. (Grant et al., 1997).

Мы определяли влияние ТМ на активность антиоксидантного фермента – каталазы. Из таблицы 3.7 видно, что активность каталазы в листьях пшеницы возрастала (за исключением ионов Ni2+ в концентрации 10 мкМ) при всех концентрациях металлов по отношению к контролю.

Максимальную активность фермента индуцировали ионы меди: при 10 мкМ – 225 % и при 1 мМ – 166 % к водному контролю. Сходное действие оказывали и ионы свинца: на 117 и 64 % выше контроля при 10 мкМ и 1 мМ, соответственно. При действии субоптимальной концентрации ионов никеля активность каталазы в листьях пшеницы была на уровне контроля, тогда как сублетальная концентрация повышала активность фермента на 85 %. Исследовали действие ТМ на изменение активности одного из основных антиоксидантных ферментов – аскорбат-пероксидазы. АПО является основным ферментом, который утилизируюет перекись водорода у растений. Повышение активности аскорбат-пероксидазы, возможно, свидетельствует об усилении синтеза изоформ аскорбат-пероксидазы, которые направленны на снижение концентрации Н2О2 и защиту от окислительнoго стресса (Дмитриева, 2003).

Как видно из таблицы 3.8, активность аскорбат-пероксидазы (в отличие от активности каталазы) при всех изученных концентрациях ТМ находилась на уровне водного контроля, либо была ниже его. Таблица 3.8 – Влияние ионов ТМ на активность аскорбат-пероксидазы в листьях пшеницы, мкмоль/г мин ТМ Металлы Концентрация ТМ 10мкМ 1мМ Контроль 0,49 ± 0,07 Cu2+ 0,33 ± 0,10 0,30 ± 0,07 Ni2+ 0,51 ± 0,04 0,39 ± 0,06 Zn2+ 0,38 ± 0,04 0,45 ± 0,08 Pb2+ 0,45 ± 0,05 0,25 ± 0,06 Так, ионы меди подавляли активность фермента на 33 и 39 % при 10 мкМ и 1 мМ, соответственно. Менее токсичное действие оказали ионы свинца (при 10 мкМ – 92 %, при 1 мМ – 51 %) и цинка (при 10 мкМ – 78 %, при 1 мМ – 92 %). В случае ионов никеля активность фермента была на уровне контроля при действии субоптимальной концентрации и ниже его при действии сублетальной концентрации (80 %).

Таким образом, возрастающие дозы ТМ в первую очередь ингибируют рост корней, которые являются первым барьером на пути поступления ТМ из почвы в растение, и именно корень берет на себя основную функцию по их аккумуляции (в 1,3 – 24 раза содержание ТМ выше в корне, чем в надземной части). Токсичное действие металлов проявляется также в угнетении роста надземной части растений, хотя и в меньшей степени, чем корней.

Особое место в защитных реакциях растений на действие тяжелых металлов принадлежит антиоксидантным ферментам, активность которых значительно возрастает в этих условиях (Prasad et al., 1999; Шевякова и др., 2003; Wu et al., 2003; Балахнина и др., 2005; Холодова и др., 2005; Devi, Pra-sad, 2005; Brahim et al., 2007; Seema, 2008; Яруллина, 2011). Это приводит к нейтрализации свободных радикалов и пероксидов, которые образуются под влиянием ТМ и оказывают повреждающее действие на клетки (Devi, Prasad, 2005), что в свою очередь способствует повышению устойчивости.

Влияние Рибав-Экстра на физиологические и биохимические параметры растений пшеницы на фоне ионов тяжелых металлов

Так содержание меди в 4 и 6 раз выше контроля при действии 10 мкМ и 1 мМ ионов Cu2+. Уровень никеля относительно контроля составлял 583 и 1962 % при 10 мкМ и 1 мМ ионов Ni2+. Загрязнение корней пшеницы ионами свинца превышало контроль на 705 и 10839 % на фоне 10 мкМ и 1мМ ионов Pb2+. На фоне субоптимальной и сублетальной концентрации ионов Zn2+ содержание цинка в корнях пшеницы в 6 и 18 раз выше контроля.

Несмотря на то, что тидиазурон не снижал загрязненность корней ионами ТМ до уровня контроля, относительно необработанных растений препарат эффективно снижал данный показатель во всех вариантах эксперимента (за исключением 10 мкМ ионов Ni2+ и 1 мМ ионов Zn2+). Содержание свинца составило 88 и 39 % относительно необработанных растений на фоне 10 мкМ и 1 мМ ионов Pb2+. При действии субоптимальной концентрации ионов Zn2+ и субоптимальной концентрации ионов Ni2+ уровень цинка и никеля в корнях пшеницы был на 28 и 48 % ниже варианта без РР. Наиболее эффективно тидиазурон снижал содержание меди в корнях пшеницы (10 % относительно необработанных растений).

Под влиянием регулятора роста содержание ионов ТМ в надземной части пшеницы многократно превышало контроль во всех вариантах эксперимента, за исключением субоптимальной концентрации ионов Cu2+, где ти-диазурон снижал содержание меди до уровня контроля (таблица 4.5). Концентрация никеля в надземной части пшеницы составляла 924 и 1569 % относительно контроля при 10 мкМ и 1 мМ ионов Ni2+. Загрязненность ионами цинка была на 199 и 1806 % выше контроля на фоне субоптимальной и сублетальной концентрации ионов Zn2+, максимальным было загрязнение ионами свинца (в 19 и 38 раз выше контроля).

Аналогично цитодефу, тидиазурон оказал двойственное действие на содержание ионов ТМ в надземной части пшеницы относительно необработанных растений. Так на фоне ионов Cu2+ и 10 мкМ ионов Zn2+ отмечено снижение концентрации меди и цинка относительно варианта без РР (на 37, 71 и 75 %, соответственно). При действии ионов Ni2+ и Pb2+ наоборот было увеличение уровня никеля (149 и 181 %) и свинца (257 и 157 %).

Концентрация ионов ТМ Cu2+ Ni2+ РЬ2+ Zn2+ 0 11 ± 3 11 ± 0 10 ± 2 10 ± 1 15 ± 1 14 ± 1 13 ± 214 ± 0 10 мкМ 19 ± 2 12 ± 1 62 ± 1 92 ± 11 110 ± 14283 ± 16 159 ± 51 39 ± 0 1 мМ 90 ± 526 ± 0 142 ± 19257 ± 22 365 ± 95572 ± 59 256 ± 77 248 ± 5 Примечание: над чертой – вариант без РР, под чертой – с тидиазуроном Таким образом, при обработке семян тидиазуроном, загрязнение осевых органов ионами ТМ относительно контроля остается значительным. Но относительно необработанных растений регулятор роста в ряде случаев снижает содержание металлов в надземной части и в корнях пшеницы. Наиболее эффективно препарат действовал на фоне ионов Cu2+.

Аналогичные результаты по снижению содержания ТМ показано для растений огурца, наиболее выраженное действие отмечено при обработке семян и двойной обработке (Башмаков, 2002; Башмаков, Лукаткин, 2009).

Ростовые параметры растений пшеницы. Регулятор роста тидиазу-рон в микроколичествах способен стимулировать рост и развитие растений (Лукаткин и др., 2003; Лукаткин, Каштанова, 2013). Изучали действие препарата на ростовые параметры растений пшеницы на фоне ионов ТМ. На седьмые сутки экспозиции измеряли длину корней и надземной части растений пшеницы. Контролем служили растения, выращенные на воде.

Тидиазурон стимулировал рост корня в 2,2 раза относительно водного контроля (рисунок 4.6). На фоне действия ионов ТМ у обработанных регуля 75 тором роста растений было увеличение длины корня относительно водного контроля во всех вариантах, кроме 1 мМ ионов Cu2+ и Ni2+. Так, на фоне 10 мкМ и 1 мМ ионов Zn2+ отмечено стимулирование роста корня относительно контроля на 119 и 40 %, соответственно. При действии ионов Pb2+ тидиазу-рон увеличивал длину корня на 126 % при 10 мкМ и на 12 % при 1 мМ. При действии 10 мкМ ионов меди и никеля отмечено стимулирование роста корня на 127 и 23 %. Относительно необработанных регулятором роста растений во всех вариантах, за исключением ионов никеля и 1 мМ ионов меди, отмечено увеличение длины корня при действии тидиазурона: в 1,8 раза на фоне ионов Pb2+, в 2 и 1,5 раза на фоне 10 мкМ и 1 мМ ионов Zn2+, соответственно, в 1,7 раза на фоне субоптимальной концентрации ионов Cu2+.