Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Фитогормоны брассиностероиды 9
1.1.1. Структура и функции брассиностероидов 9
1.1.2. Молекулярные механизмы действия брассиностероидов в клетках растений 12
1.2. Фосфорилирование/дефосфорилирование белков растений. 16
1.2.1. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции метаболизма азота и углерода 17
1.2.2. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции ферментов энергетического метаболизма 22
1.2.3. Участие фосфорилирования белков растений в реіуляции активности структурных белков 22
1.2.4. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции клеточного цикла 23
1.2.5. Участие фосфорилирования белков в регуляции сигнальных систем клеток растений 27
1.2.6. Участие фосфорилирования белков в регуляции фотосинтеза 30
1.2.7. Участие фосфорилирования белков в регуляции других процессов клеток растений 32
1.3. Тирозиновое фосфорилирование белков растений 33
1.3.1. Тирозиновые протеинкиназы и протеинфосфатазы растений 33
1.3.2. Роль тирозинового фосфорилирования белков в регуляции функционирования клеток растений 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Объекты исследования 39
2.2. Определение общего фосфорилирования белков листьев гороха in situ 39
2.3. Определение тирозинового фосфорилирования растворимых белков листьев гороха методом Вестерн-блотинга с использованием моноклональных антител PY20 к фосфотирозиновым белкам 41
2.3.1. Приготовление образцов 41
2.3.2. Метод полусухого блотирования (Вестерн-блотинг) 41
2.3.3. Иммунодетекция тирозинового фосфорилирования белков...42
2.3.4. Детектирование хемилюминесценции 42
2.4. Одномерный электрофорез по методу Laemmli 43
2.5. Двумерный электрофорез 44
2.6. Анализ данных, полученных с помощью методов одномерного и двумерного электрофореза 44
2.7. Идентификация белков методом MALDI-TOF MS 44
2.7.1. Трипсинолиз белкового образца 44
2.7.2. Регистрация масс-спектров 45
2.7.3. Идентификация белков 45
2.8. Определение содержания перекиси водорода в клетках корней гороха 45
2.9. Определение содержания оксигенированных производных линолевой кислоты in vitro в листьях гороха 46
2.10. Определение количества белка в растворе по методу Бредфорда 47
2.11. Химические реактивы и материалы 48
Глава 3. Результаты и обсуждение 49
3.1. Влияние эпибрассинолида на общее фосфорилирование растворимых белков листьев гороха 49
3.1.1. Временная зависимость действия эпибрассинолида на общее фосфорилирование белков in situ 49
3.1.2. Участие липоксигеназной сигнальной системы в эпибрассинолид-индуцированном общем фосфорилировании белков 49
3.2. Влияние эпибрассинолида на тирозиновое фосфорилирование растворимых белков листьев гороха 52
3.2.1. Изучение специфичности связывания антител PY20 с растворимыми фосфотирозиновыми белками гороха 52
3.2.2. Временная зависимость влияния эпибрассинолида in situ на тирозиновое фосфорилирование растворимых белков листьев 54
3.2.3. Влияние эпибрассинолида и ингибиторов тирозиновых фосфатаз (ортованадата натрия и оксида фениларсена) in situ на тирозиновое фосфорилирование белков листьев гороха 57
3.2.4. Участие липоксигеназной сигнальной системы в эпибрассинолид-индуцированномтирозиновом фосфорилировании белков листьев гороха 66
3.3. Идентификация белков листьев гороха, тирозиновое фосфорилирование которых изменялось под влиянием эпибрассинолида 71
3.4. Влияние эпибрассинолида на содержание перекиси водорода в клетках корней гороха 85
3.5. Влияние эпибрассинолида на содержание оксигенированных производных линолевои кислоты в листьях гороха 86
Заключение 90
Выводы 92
Список использованной литературы 93
- Участие фосфорилирования белков растений в регуляции метаболизма азота и углерода
- Участие фосфорилирования белков в регуляции сигнальных систем клеток растений
- Участие липоксигеназной сигнальной системы в эпибрассинолид-индуцированном общем фосфорилировании белков
- Влияние эпибрассинолида и ингибиторов тирозиновых фосфатаз (ортованадата натрия и оксида фениларсена) in situ на тирозиновое фосфорилирование белков листьев гороха
Введение к работе
Актуальность проблемы. Фитогормон 24-эпибрассинолид (ЭПБ) - один из наиболее активных представителей брассиностероидов, структурно сходных со стероидными гормонами животных - вызывает широкий спектр ответов клетки, включая рост растений, прорастание семян, активность фотосинтеза, фиксацию азота, повышение устойчивости к холоду, патогенам, солевому стрессу (Khripach et al., 2000; Шакирова, 2001). Большая часть современных исследований направлена на выяснение молекулярных механизмов действия сигнала ЭПБ: выявлены рецепторы на плазматических мембранах, их трансфосфорилирование по Ser/Thr (Nam and Li, 2002). Обнаружена киназа, фосфорилирующая ядерные белки (Не et al., 2000), а также факторы регуляции транскрипции, участвующие в брассиностероид-регулируемой экспрессии генов (Yin et al., 2005; Li and Deng, 2005). В то же время, практически не изучена роль конкретных сигнальных систем в реакции растений на брассиностероиды. Сигнальные системы клеток - это каскады биохимических реакций, принимающих участие в распознавании и рецепции внеклеточных сигналов, их трансформации, усилении и передаче в геном. В результате этих процессов происходит изменение программы экспрессии генов, и, как следствие, адаптация растений к изменившимся условиям существования.
Известно, что фосфорилирование белков является обязательным этапом функционирования всех сигнальных систем. Активность до 30 % белков эукариот регулируется фосфорилированием/дефосфорилированием (Cohen, 2004), в основном, по остаткам серина, треонина, тирозина и гистидина. Тирозиновое фосфорилирование белков составляет относительно небольшую долю от общего фосфорилирования, но принимает участие в реіуляции целого ряда процессов метаболизма у растений (Luan et al., 2001). Фосфорилирование белков по тирозину играет ключевую роль и в осуществлении контроля над процессами пролиферации и дифференцировки клеток (Hunter, 1995; Mustelin and Hunter, 2002). В литературе информация о влиянии брассиностероидов на тирозиновый тип фосфорилирования белков растений отсутствует. В связи с этим, изучение механизмов действия брассиностероидов на фосфорилирование/дефосфорилирование белков растений является актуальным.
Цель и задачи исследования. Цель проводимых исследований заключалась в выявлении сигнальных систем и идентификации фосфорилированных белков листьев гороха, участвующих в сигналинге брассиностероидов.
В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Выявление влияния 24-эпибрассинолида на общее фосфорилирование белков.
Исследование влияния эпибрассинолида на тирозиновое фосфорилирование белков и вклада протеинкиназ и протеинфосфатаз в уровень их фосфорилированности.
Идентификация некоторых выявленных белков, тирозиновое фосфорилирование которых регулируется 24-эпибрассинолидом.
Определение возможности участия липоксиі еназной и супероксидсинтазной сигнальных систем в эпибрассинолид-индуцированном фосфорилировании белков.
Научная новизна работы. Впервые выявлена регуляция 24-эпибрассинолидом уровня фосфорилирования белков по тирозину, что было вызвано действием 24-эпибрассинолида на активность тирозиновых протеинкиназ и протеинфосфатаз. Впервые показано влияние эпибрассинолида на липоксигеназную и супероксидсинтазную сигнальные системы, о чем свидетельствует повышение содержания оксилипинов, а также эндогенной Н2О2. Впервые методом MALDI-TOF MS идентифицированы белки цикла Кальвина, тирозиновое фосфорилирование которых регулируется эпибрассинолидом.
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные о влиянии эпибрассинолида на фосфорилирование белков растений, в частности на тирозиновое фосфорилирование ряда белков цикла Кальвина, помогут приблизиться к пониманию механизма повышения брассиностероидами фотосинтетической активности растений и, в связи с этим, повышения их урожайности. Результаты работы могут быть использованы при подготовке и чтении курсов лекций на кафедрах биохимии и физиологии растений в университетах и сельскохозяйственных ВУЗах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в 2001-2006 гг. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Взаимодействие сигнальных систем клеток растений». Исследования автора являлись частью работ, проводимых по фантам РФФИ 04-04-49348, 04-04-49350, а также по гранту ведущей научной школы. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 6*и международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002); 13"м международном конгрессе FESPP (Греция, 2002); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005); 1(1Х) международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); II международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), а также на итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ (2004 - 2006).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи, две из которых опубликованы в центральных российских научных журналах.
Участие фосфорилирования белков растений в регуляции метаболизма азота и углерода
Существенное значение приобретает выявление у представленных соединений функций, характерных для других групп фитогормонов, и взаимодействие с последними, что позволяет подойти к установлению механизма их действия [Yopp et al., 1981; Cohen and Meudt, 1983; Katsumi, 1985].
Как эндогенные регуляторы роста, БС включаются в регуляцию разнообразных процессов жизнедеятельности растений, т.е. характеризуются множественными проявлениями физиологического действия. БС стимулируют деление и удлинение клеток, влияют на ферментативную активность, например, активируют Н+-помпу, усиливают синтез белков и нуклеиновых кислот, влияют на состав жирных кислот и свойства мембран, усиливают фотосинтетическую способность и транслокацию продуктов фотосинтеза, повышают устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, стрессам, заболеваниям [Khripach et al., 2000].
С самых первых опытов применения БС в агрономической практике было продемонстрировано их ярко выраженное защитное действие. БС повышают устойчивость растений к низкой и высокой температурам, засухе, водному стрессу, засолению, аноксии, повреждающему действию гербицидов, воздействию патогенов [Шакирова, 2001].
Предполагается, что БС-индуцированная устойчивость растений связана с его действием на структуру и функции мембран. Увеличение под влиянием БС устойчивости к охлаждению и аноксии связывают с защитой целостности мембран и мембранносвязанных структур, в том числе и ядерных. Например, В.А. Хрипач с сотрудниками показали протекторные свойства БС для биологических мембран, так как БС ингибировал перекисное окисление липидов мембран, особенно в условиях гипоксии и преобладания С02 в среде развития растений [Хрипач и др., 1995].
БС находят использование в качестве высокоэффективных и экологически безопасных средств защиты растений картофеля от фитофторы. ЭПБ и гомобрассинолид в концентрациях выше 0,1 нМ замедляют процессы роста мицелия Phytophtora infestam, интенсивность его спорообразования и прорастание зооспор [Васюкова, 1993].
Как известно, одной из первых регистрируемых реакций растительной клетки на экзогенные фитогормоны является гиперполяризация мембран и активация протонной помпы. БС-индуцируемое растяжение клеток также сопровождается выбросом протонов и гиперполяризацией клеточных мембран, что, вероятно, связано с активацией мембранной АТФазы [Katsumi, 1985]. Интенсивность ростовых процессов находится в четкой зависимости от активности белково-нуклеинового обмена клеток. Известны данные об активации ДНК- и РНК-полимераз, а также синтеза ДНК, РНК в растениях фасоли под влиянием обработки БС, причем возрастание активности РНК-полимеразы I способствует увеличению объема белоксинтезирующего аппарата и усилению синтеза белка [Kalinich et al., 1985]. Существуют данные об активации транскрипции более 50 генов и усилении синтеза полипептидов в результате обработки БС. В 1989 г. О.Н. Кулаева с коллегами показали, что растительные стероиды увеличивают белковый синтез в растениях и существенно изменяют спектр синтезированных белков, некоторые из которых соответствуют молекулярным массам белков теплового шока; они также повышают порог чувствительности белкового синтеза к высоким температурам [Кулаева и др., 1989].
К числу вызываемых БС физиологических ответов растений относятся стимуляция фотосинтетической активности клеток (увеличивается содержание хлорофилла), повышение уровня растворимых белков, углеводов, модуляция активности ферментативной системы растений [Braun and Wild, 1984; Yu et al., 2004].
В классической модели действия стероидных гормонов животных стероиды взаимодействуют с внутриклеточными рецепторами, которые действуют как лиганд-зависимые транскрипционные факторы, регулирующие генную экспрессию. Эти рецепторы - члены ядерного суперсемейства рецепторов, имеют модулярную структуру, состоящую из ДНК-связывающего домена, сигналов ядерной локализации, лиганд-связывающего домена и различных факторов активации транскрипции. В последнее время приумножаются данные о том, что стероиды животных могут оказывать быстрые негеномные эффекты за счет взаимодействия с рецептором на клеточной поверхности [Benten et al., 1998].
В 1997 году Li и Chory показали с использованием БС-нечуствительных мутантов bril, что существует некий белок BRI1, который может функционировать как рецептор брассиностероидов (БС) в клетках растений [Li and Chory, 1997]. Позднее показали, что BRI1 экспрессируется в различных типах клеток и локализован в плазматической мембране [Friedrichsen and Chory, 2001]. BRI1 является протеинкиназой, которая показала типичную для простых мембранных рецепторов структуру, содержащую N-концевой экстраклеточный домен (состоящий из лейцин-обогащенных повторов), трансмембранный домен и Ser/Thre цитоплазматический киназный домен. Li и Chory предположили, что BRI1 может образовывать димеры с другой рецептор-подобной киназой через их лейцин-обогащенные повторы. В этом случае могут также связываться БС за счет встраивания в полость, образованную 70 аминокислотами между 21 и 22 лейцин-обогащенными повторами. Образование димеров при связывании лигандов характерно для рецепторных киназ - это приводит цитоплазматический киназный домен в состояние сближения, облегчая трансфосфорилирование, которое активирует этот домен и позволяет дать старт реакциям клеточного ответа.
В 2002 году Nam и Li биохимически и генетически доказали вовлечение гетеродимера BRI1/BAK1 в брассиностероидный сигналинг Arabidopsis. ВАК1 и BRI1 показали не только схожую экспрессию генов и локализацию белков, но также способность физически связываться друг с другом в растениях, что было показано методом иммунопреципитации. Это предполагает, что BRI1/BAK1 могут образовывать гетеродимерный рецепторный комплекс на поверхности клеток [Nam and Li, 2002]. BRI1/BAKI гетеродимеризация вызывает конформационные изменения, которые приводят к увеличению киназной активности и запуску сигнальных систем клеток.
Связывание БС, в основном через брассиностероид-связывающий белок, способствует BRI1/BAK1 гетеродимеризации, приводя к трансфосфорилированию специфических серин/треониновых остатков одной из рецепторных киназ за счет соответствующей киназы. Такая модель активации БС рецептора принципиально схожа с моделью активации большинством гормонов рецепторных тирозиновых киназ у животных.
Поскольку существуют данные, что БС увеличивают резистентность растений к патогенам [Прусакова и Чижова, 1996], то можно предполагать участие BRI1 в процессах распознавания патогена. Согласно первой модели связывания, BRJ1 после взаимодействия с БС, может образовать гетеродимер с другой рецептор-подобной киназой. Например, было показано, что BRI1 может образовывать гетеродимеры с R-ген-кодируемыми рецепторами, имеющими лейцин-обогащенные повторы, которые способствуют распознаванию вирусных, бактериальных и грибных патогенов [Не et al., 2000].
В этой же работе с помощью химерного рецептора было показано, что BRI1 участвует в восприятии БС. Была предложена модель предполагаемой работы рецептора BRI1: экстраклеточный и трансмембранный домены отвечают за восприятие лиганда, тогда как внутриклеточный домен определяет последующие шаги сигнальной трансдукции [Не et al., 2000].
Участие фосфорилирования белков в регуляции сигнальных систем клеток растений
Самые разнообразные химические сигналы, поступающие из окружающей среды, улавливаются клеткой с помощью специальных рецепторных белковых молекул, пронизывающих клеточную мембрану. Нужно отметить, что рецепторы могут обладать киназной активностью, которая выражается в автофосфорилировании рецептора по тем или иным остаткам аминокислот. Примером может служить серин/треониновая рецептор-подобная киназа БС - BRI1 [Li and Chory, 1997] или гистидиновые рецепторы цитокинина [Inoue et al., 2001; Ueguchietal.,2001].
Фосфорилирование белков участвует в регуляции активности двухкомпонентных сигнальных систем растений. Особенностью двухкомпонентных систем является то, что при ответе на стимул, происходит фосфорилирование по остаткам гистидина и аспарагиновой кислоты. Простая форма двухкомпонентной системы состоит из рецептора с гистидинкиназной активностью и белка регулятора ответа. Рецептор располагается в плазмалемме и в ответ на стимул автофосфорилируется по остаткам гистидина. Фосфат затем переносится на остатки аспарагиновой кислоты, располагающейся в домене-получателе регулятора ответа. Существует более сложная двухкомпонентная сигнальная система. Она состоит из гистидиновой киназы и домена-получателя, которые представляют собой единый белок, гистидин-содержащего белка и отдельного белка регулятора ответа [Appleby et al., 1996]. В этой системе фосфат переносится от гистидина на аспарагиновую кислоту, от нее на гистидин гистидин-содержащего белка, а затем на аспарагиновую кислоту белка регулятора ответа. Анализ генома Arabidopsis thaliana выявил 8 гистидиновых киназ, которые содержат все консервативные остатки, необходимые для ферментативной активности. Семейство рецепторов этилена Arabidopsis thaliana также содержит белки с гистидинкиназными доменами [Chang et al., 1993; Hua et al., 1998]. Гистидинкиназная активность может быть вовлечена в сигналинг этилена. Также вероятно, что гистидинкиназная активность позволяет обеспечивать взаимодействие между сигналингом этилена и другими сигнальными путями с участием двухкомпонентных систем, например, такими как сигналинг цитокининов [Schaller et al., 2002].
Нековалентное взаимодействие внешнего участка рецептора с той или иной сигнальной молекулой, поступающей из среды, окружающей клетку, приводит к изменению конформации рецепторного белка. В большинстве сигнальных систем с рецептором контактируют посреднические G-белки, выполняющие функции преобразователя сигналов, передавая сигнальный конформационный импульс на стартовый фермент, специфичный для той или иной сигнальной системы.
Одним из важнейших звеньев сигнальных систем являются протеинкиназы и протеинфосфатазы, активируемые продуктами начальных сигнальных реакций или их производными.
Ключевую роль в функционировании сигнальных систем клеток играют не только реакции фосфорилирования белков, но и обратные реакции их дефосфорилирования, катализируемые протеинфосфатазами и возвращающие активность белков - субстратов в исходное состояние.
Белковые факторы регуляции транскрипции являются следующим важным звеном сигнальных систем и представляют собой один из субстратов протеинкиназных реакций. Структура этих белков в значительной степени унифицирована, а модификации структуры определяют принадлежность факторов регуляции транскрипции к той или иной сигнальной системе. Фосфорилирование факторов регуляции транскрипции приводит к изменению конформации этих белков, их активации и последующему взаимодействию с промоторным участком определённого гена, что приводит к изменению интенсивности его экспрессии (индукции или репрессии), а в крайних случаях - к "включению" некоторых молчавших генов или "выключению" - активных. Репрограммирование экспрессии совокупности генов генома вызывает изменение соотношения белков в клетке, что и является основой её функционального ответа (рис.8).
В настоящее время интенсивно исследуются МАП-киназная, аденилатциклазная, фосфатидатная, кальциевая, липоксигеназная, НАДФН-оксидазная, NO-синтазная и протонная сигнальные системы и роль их соответствующих протеинкиназ и прогеинфосфатаз в формировании ответа на изменяющиеся условия существования, на действие различных абиотических и биотических стрессоров.
В лаборатории сигнальных систем под руководством Ф.Г. Каримовой изучается влияние различных фитогормонов, активаторов и ингибиторов компонентов сигнальных систем на фосфорилирование белков растений. Установлено, что цАМФ-активируемая протеинкиназная активность растворимых 9-4 белков листьев гороха зависела от концентрации Са [Каримова и др., 1989]. Показана зависимость профиля фосфорилированности полипептидов от экзогенного цАМФ, причем число полипептидов, фосфорилирование которых стимулировалось цАМФ, было наибольшим при микромолярной концентрации [Каримова и др., 1990]. Использование высоко специфического белкового ингибитора цАМФ-зависимых протеинкиназ позволило подтвердить предположение, что цАМФ-зависимые протеинкиназы могут быть активированы эндогенным цАМФ еще в процессе приготовления образца [Каримова, 1994]. Было обнаружено сильное цАМФ-индуцированное повышение фосфорилирования полипептида 10 кДа при воздействии низкой температуры [Ягушева, 2000]. Было выявлено, что интермедиа липоксигеназной сигнальной системы (9Z)-12-гидрокси-9-додеценовая кислота (ГДК) и метилжасмонат активировали цАМФ-зависимую протеинкиназную активность [Tarchevsky et al., 2000]. Были показаны изменения уровня фосфорилирования ряда белков листьев гороха под влиянием форсколина (активатора аденилатциклазы) [Каримова и др., 2003; 2005]. Выявлено, что салициловая кислота индуцировала повышение уровня цАМФ-зависимого фосфорилирования полипептидов 22, 61 и 74 кДа в листьях гороха [Мухаметчина, 2000].
В последнее время приумножается информация о влиянии реакций фосфорилирования на регуляцию фотосинтеза. Наиболее хорошо изучен механизм быстрой регуляции переноса электрона за счет перераспределения энергии возбуждения между двумя фотосистемами, основанный на обратимом фосфорилировании белков светособирающего комплекса. Дополнительный отрицательный заряд, получаемый основным полипептидом светособирающего комплекса при присоединении фосфатной группы (по остаткам треонина) специальной протеинкиназой, вызывает его латеральную миграцию из стыкованных областей мембраны тилакоида в нестыкованные, что переводит хлоропласт из состояния 1 в состояние 2, когда повышается перенос энергии света к фотосистеме I и увеличивается вклад циклического фосфорилирования [Forsberg and Allen, 2001]. В активировании протеинкиназы огромную роль играет редокс-состояние переносчиков электронов. Каталитическая часть протеинкиназы локализована в строме хлоропласта, а ее мембранная часть связана с цитохромным комплексом. Протеинкиназа неактивна, пока пул хинонов окислен. После посадки дважды восстановленного хинона на цитохромныи комплекс, он восстанавливает железо-связанный комплекс Риске и цитохром f, вызывая одновременно конформационные изменения в макромолекуле цитохромного комплекса вблизи внутренней поверхности мембраны, передающиеся на мембранную часть протеинкиназы. Изменение ее конформации активирует протеинкиназу, которая фосфорилирует остатки треонина белков светособирающего комплекса и фотосистемы II. Изменение активности протеинфосфатазы также зависит от конформационных перестроек на внутренней поверхности мембран тилакоида [Рубин и Кренделева, 2003].
Участие липоксигеназной сигнальной системы в эпибрассинолид-индуцированном общем фосфорилировании белков
Было выявлено, что тирозиновое фосфорилирование белков вовлечено в сигнальную трансдукцию фитохромов - фоторецепторов растений красного и дальнего красного света. Эти фоторецепторы необходимы для прорастания семян, гравитропизма, роста и цветения растений [Quail et al., 1995]. Было показано, что фитохром А обладает тирозинкиназной активностью. Вероятно, этот фитохром может функционировать как тирозиновая протеинкиназа либо тирозиновое фосфорилирование этого белка может осуществлять регуляцию активности предполагаемой серин-треониновой протеинкиназы фоторецептора [Sommer et al., 1996].
Установлено, что в растениях тирозиновое фосфорилирование затрагивает регуляцию эмбриогенеза и дифференциации тканей растений. Кроме того, тирозиновое фосфорилирование белков не просто связано с развитием растений, оно является существенным, особенно на ранних стадиях эмбриогенеза. Например, эмбриогенез полностью подавлялся, когда на ранних стадиях развития эмбриогенные культуры обрабатывали ингибиторами специфических тирозиновых протеинкиназ [Barizza et al., 1999]. Известно, что число фосфотирозиновых белков, а также интенсивность их фосфорилированности отличаются в зависимости от возраста тканей растений [Huang et al., 2003].
Обнаружение тирозинового фосфорилирования белков каллуса Arabidopsis thaliana позволило сделать вывод, что этот тип фосфорилирования белков играет важную роль в пролиферации клеток, индуцируемой фитогормонами (2,4-D и кинетином). Усиление тирозинового фосфорилирования разных белков каллуса в ответ на действие фитогормонов коррелировала с активацией промотора циклин-зависимой протеинкиназы CDK;1. По-видимому, при действии фитогормонов активация промотора циклин-зависимой протеинкиназы CDK;1 и усиление тирозинового фосфорилирования разных белков пролиферируемых клеток вовлечены в одинаковые процессы и могут регулироваться сходным механизмом [Huang et al., 2003].
Ранее освещалось, что для регуляции активности белков фотосинтеза, а именно, основного полипептида светособирающего комплекса необходимо фосфорилирование по остаткам треонина. Однако, была продемонстрирована важная роль тирозинового фосфорилирования светособирающего комплекса при переходе хлоропласта в состояние 2. При этом состоянии повышается перенос энергии света к фотосистеме I и увеличивается вклад циклического фосфорилирования [Forsberg and Allen, 2001]. Вероятно, что тирозиновое фосфорилирование светособирающего комплекса необходимо для адаптации растений к изменениям освещенности при переходе хлоропласта в состояние 2. Также было показано, что малые субъединицы РУБИСКО могут фосфорилироваться по тирозину [Aggarwal et al., 1993].
В клетках животных тирозиновое фосфорилирование белков играет важную роль в активации апоптоза. Существуют данные литературы о влиянии тирозинового фосфорилирования белков на программируемую смерть клеток растений [Shih et al., 2004]. При обработке маннозой и последующем старении суспензионной культуры риса наблюдалась программируемая смерть клеток -была установлена фрагментация ДНК. Этот эффект коррелировал с усилением тирозинового фосфорилирования белков по сравнению с контролем. Было также выявлено, что экспрессия гена, кодирующего МАП-киназу OsMAPK2, регулировалась обработкой маннозой [Shih et al., 2004]. Эти результаты могут свидетельствовать о возможном участии МАПК сигнального каскада в программируемой смерти клеток, которая вызывалась D-маннозой.
В 2002 г. MacRobbie, используя специфический ингибитор тирозиновых протеинфосфатаз оксид фениларсена, продемонстрировал, что тирозиновая протеинфосфатазная активность, индуцированная АБК, экзогенным Са2г, темнотой и Н2Ог, была существенна для закрывания устиц [MacRobbie, 2002]. Известно, что АБК, экзогенный Са и Н2Ог может вызывать изменение гомеостаза внутриклеточного Са+, что сопряжено с изменением активности К+-каналов. Установлено, что регуляция К+-каналов тонопласта осуществляется с помощью тирозинового фосфорилирования [MacRobbie, 2002].
Тирозиновое фосфорилирование белков может регулировать взаимодействие 14-3-3 белков с субстратами. Например, продемонстрировано, что тирозиновое фосфорилирование 14-3-3 белка приводило к снижению его взаимодействия с 14-3-3-связывающим участком Н+-АТФазы плазмалеммы [Giacometti et al., 2004].
Было показано, что фосфотирозиновые белки митохондрий с низкими молекулярными массами вовлечены в редокс-сигналинг дыхательной цепи [Hakansson and Allen, 1995].
Также выявлено, что белки цитоскелета актин и профилин могут регулироваться тирозиновым фосфорилированием [Guillen et al., 1999; Kameyama et al., 2000]. В 2006 г. было установлено, что в растениях фасоли профилин, фосфорилированный по тирозину, может связываться с пролин-обогащенными мотивами фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) III типа. Вероятно, этот комплекс может обеспечивать взаимосвязь цитоскелета (через реорганизацию динамичности актина), трафиком мембран и эндоцитозом клеток растений [Aparicio-Fabre et al., 2006].
Тирозиновое фосфорилирование белков вовлечено в ответы растений при инфицировании патогенами. Например, было обнаружено, что в суспензионной культуре табака, обработанной элиситором Phytophthora infestans, активация серин-треониновой МАП-киназы осуществлялась с помощью тирозинового фосфорилирования этого белка [Suzuki and Shinshi, 1995].
При кратковременной обработке древеснеющих проростков лимона патогеном Alternaria alternate, было выявлено тирозиновое фосфорилирование некоторых полипептидов проростков. Использование специфических ингибиторов тирозиновых протеинкиназ приводило к снижению активности фенилаланинаммиаклиазы (PAL) и содержанию фитоалексина скопарона. Результаты предполагают вовлечение тирозинового фосфорилирования белков в индукцию PAL и синтез фитоалексинов в ответ на поражение патогеном [Ortega et al., 2002].
Итак, фосфорилирование белков растений является одним из важных процессов пост-трансляционной модификации белков и участвует в регуляции многих процессов в клетках. Фосфорилирование белков растений (в том числе тирозиновое фосфорилирование) активно изучается многими исследователями. Тем не менее, существует много пробелов в понимании его функционирования, что служит стимулом для дальнейших исследований в этой области.
Влияние эпибрассинолида и ингибиторов тирозиновых фосфатаз (ортованадата натрия и оксида фениларсена) in situ на тирозиновое фосфорилирование белков листьев гороха
Полагают, что малые субъединицы РУБИСКО стабилизируют комплекс больших субъединиц. Кроме того, в образовании холофермента участвует РУБИСКО-связывающий белок, состоящий из 14 субъединиц, в свою очередь состоящих из равного количества двух изоформ с мол. массой 60 и 62 кДа. Они связываются с большой субъединицей РУБИСКО и поддерживают ее в удобной форме для связывания с малой субъединицей [Streusand and Portis, 1987]. В образовании холофермента также участвует активаза РУБИСКО, член семейства белков с шаперон-подобными функциями. Активаза РУБИСКО состоит из изоформ с молекулярными массами 43 и 46 кДа [Parry et al., 2003], которые также связываются с большой субъединицей РУБИСКО. Мультиэнзимные комплексы белков цикла Кальвина в разных вариациях были изолированы из гороха и шпината [Graciet et al., 2004]. Образование холофермента РУБИСКО из выделенных и очищенных белков РУБИСКО было показано с помощью антител к РУБИСКО-связывающему белку и активазе РУБИСКО методами EL1SA, иммунной преципитации и иммуноблотинга [Demirevska-Kepova et al., 1999]. Авторы нашли, что наибольшей ферментативной активностью обладал именно полный комплекс РУБИСКО.
Тем не менее, механизмы связывания белков РУБИСКО и образования их активного ансамбля остались неясны.
Сведений о фосфорилировании ферментов цикла Кальвина также относительно мало. С помощью изотопа 32Р„ было обнаружено фосфорилирование больших и малых субъединиц РУБИСКО, что повышало фиксацию С02 [Foyer, 1984; 1985], затем было показано, что большие субъединицы РУБИСКО Са2+-зависимо фосфорилируется по серину и треонину [Guitton and Mache, 1987]. Позднее было найдено, что малая субъединица может фосфорилироваться по треонину и тирозину; дефосфорилирование приводило к диссоциации малых и больших субъединиц и к падению активности РУБИСКО. Однако, фосфорилирование было обнаружено лишь у одного (Cicer arietinum) из двух исследованных в этом эксперименте видов растений [Aggarwal et al., 1993].
Подтверждения фосфорилирования белков РУБИСКО по тирозину в литературе отсутствует. Также отсутствуют данные о тирозиновом фосфорилировании фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазы.
Известно, что большинство белков хлоропластов, в том числе малая субъединица РУБИСКО, РУБИСКО-связывающий белок и активаза РУБИСКО синтезируются на рибосомах цитозоля под контролем ядерных генов и только затем транспортируются в хлоропласта. Было обнаружено, что фосфорилирование по серину сигнального фрагмента предшественников малых субъединиц в цитозоле облегчает их транспорт к хлоропластам с помощью 14:3:3 белков [May and Soil, 2000]. Сигнальный фрагмент малых субъединиц РУБИСКО по аминокислотной последовательности сходен с фосфопептид-связывающим мотивом 14:3:3 белков. 14:3:3 белки - семейство высоко консервативных конститутивных белков, присутствующих во всех типах клеток эукариот и участвующих в сигнальной трансдукции [Aitken, 1996]. Дефосфорилированиая форма малых субъединиц РУБИСКО импортируется в хлоропласт [May and Soil, 2000]. В то же время, именно в фосфорилированной форме малые субъединицы в строме хлоропластов образуют комплекс с большими субъединицами [Aggarwal et al., 1993]. Это предполагает или существование фосфорилирования отличных от серина и треонина остатков аминокислот (например, тирозина) в малых субъединицах РУБИСКО, которое не влияет на их перенос в хлоропласта, или в строме происходит дополнительное фосфорилирование малых субъединиц для того, чтобы они могли участвовать в формировании полноценного комплекса фермента. Если иметь в виду, что механизм транспорта белков из цитозоля в хлоропласты, подобный малым субъединицам РУБИСКО, характерен и для других кодируемых ядерными генами хлоропластных белков [May and Soil, 2000], то не исключена вероятность локализации и в цитозоле и в строме хлоропластов также обнаруженного нами тирозинового фосфорилирования малых и больших субъединиц РУБИСКО, РУБИСКО-связывающего белка и изоформ фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазы.
Обнаруженное тирозиновое фосфорилирование белков, идентифицированных с помощью метода MALDIOF MS позволяют дополнить существующие представления о типах фосфорилирования белков ферментов темновой стадии фотосинтеза.
Можно предположить, что тирозиновое фосфорилирование белков РУБИСКО может объяснить механизмы образования активного комплекса этого фермента способностью фосфорилированных по тирозину белков связывать другие белки, имеющие в своем составе SH2 (Src homology) домены, образуя большие ансамбли белков (как у РУБИСКО), что хорошо показано при сигнальной трансдукции в клетках животных [Pavvson et al., 2001]. Возможно, что тирозиновое фосфорилирование фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазы также необходимо для образования комплекса с другими белками, чтобы обеспечить выполнение своей функции.
SH2 или фосфотирозин-связывающий домен состоит из 100 аминокислот, которые взаимодействуют с разными белками, последовательности которых содержат фосфорилированные по тирозину остатки. В результате таких белок-белковых взаимодействий при передаче сигналов в клетках формируются ансамбли белков [Pavvson et al., 2001]. SH2 домены найдены во многих белках: фосфолипазе, инозитолфосфатазе, сигнальных адаптерных белках, тирозиновых протеинкиназах и тирозиновых протеинфосфатазах, а также у членов транскрипционных факторов семейства STAT. В молекулах с каталитической активностью SH2 домены часто конъюгированы непосредственно с другими функциональными последовательностями - SH3 доменами. SH3 домены узнают пролин-богатые последовательности. Типичный SH3 домен состоит из 50-70 аминокислот, которые формируют два антипараллельных р-складчатых слоя, упакованных перпендикулярно друг к другу [Musaccho et al., 1994]. SH2 и SH3 домены обнаружены также и в растениях [Lam et al., 2001; Gao et al., 2004]. SH2 и SH3-домены принимают участие в образовании больших сигнальных комплексов включающих 14:3:3-белки [Aitken, 1996]. Как упоминалось ранее 14:3:3-белки участвуют в транспорте предшественников малых субъединиц РУБИСКО к хлоропласту [May and Soil, 2000].
Из данных литературы известно, что синтез, транспорт и образование комплексов РУБИСКО, а также регуляции его активности и деградация сопровождается различными пост-трансляционными модификациями (фосфорилированием, метилированием, ацетилированием, гидроксилированием различных остатков аминокислот) [Houtz and Portis, 2003]. Значение этих модификаций белков в образовании активных мультиэнзимных комплексов можно понять из данных, которые были выявлены лишь за последние 10 лет [Pawson and binding, 2005]. Найдено, например, что метилирование и ацетилирование белков могут ингибировать фосфорилирование этих белков [Pawson and Nash, 2003]. Показанная на листьях растений невозможность импорта в хлоропласта предшественника малых субъединиц РУБИСКО, фосфорилированного по серину [May and Soil, 2000], возможно, связана с тем, что фосфосерин-зависимое взаимодействие белка-мишени с 14:3:3 белком уменьшает фосфотирозин-зависимую сборку комплексов белков через 8Н2-домены [Yaffe et al., 1997].
