Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. АЗП как представитель лектинов злаковых 9
1.1.1. Общие сведения о лектинах 9
1.2.1. Структура и физико-химические свойства АЗП 10
1.1.1. Функции АЗП 12
1.1.3.1. Участие АЗП в гормональной регуляции ростовых процессов растений пшеницы
1.1.3.2. Участие АЗП в формировании ассоциативных 15
взаимоотношений пшеницы с азотфиксирующими бактериями
1.1.3.3. Защитные функции АЗП 17
1.1.3.4. Участие АЗП в ответе пшеницы на абиотический стресс 18
1.2. Защитные механизмы растений в ответ на действие токсических 21
ионов кадмия
1.2.1. Проникновение кадмия и его распределение в органах и тканях растений
1.2.2. Механизмы токсического действия кадмия на растения 25
1.2.3. Сигналинг 29
1.2.4 Регуляция гомеостаза 31
Экспериментальная часть
2. Материалы и методы 37
2.1. Объект исследования 37
2.2. Постановка опытов при воздействии ацетата кадмия 37
2.3. Определение митотического индекса в клетках зоны меристемы корней пшеницы
2.4. Определение содержание свободных фитогормонов и АЗП 38
2.4.1. Экстрагирование фитогормонов и лектина из одной з
растительной навески
2.4.2. Метод ИФА для оценки содержания лектина и фитогормонов 39
2.5. Иммунолокализация АБК и АЗП 40
2.6. Локализация кадмия в клеточных стенках тканей корней растений 41
2.7. Отложение лигнина в клеточных стенках 42
2.8. Определение концентрации кадмия 42
2.9. Определение концентрации активных форм кислорода 43
2.10. Определение активности супероксиддисмутазы 43
2.11. Определение активности пероксидазы 44
2.12. Оценка гистохимического распределения H2O2 и пероксидазы 45
2.13. Определение содержания малонового диальдегида 45
2.14. Выделение и очистка РНК из растений 45
2.15. Полимеразная цепная реакция 46
2.16. Реакция обратной транскрипции РНК и полуколичественный 47
анализ транскрипции генов
2.17. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 47
3. Результаты исследований и их обсуждение 49
3.1. Влияние ацетата кадмия на рост и гормональный статус проростков пшеницы и количественный уровень АЗП в них Рост 49
Гормональный статус 54
Экспрессия АЗП в корнях проростков пшеницы 57
Экскреция лектина в наружную среду 61
3.2. Проявления защитного действия АЗП на растения пшеницы в 63
условиях кадмиевого стресса
3.2.1. Влияние предобработки АЗП на рост и гормональный статус 63
растений пшеницы при стрессе
3.2.2. Ко-иммунолокализация АЗП и АБК в тканях корней 4-сут 69
проростков пшеницы, подвергнутых воздействию кадмия
3.2.3. Влияние предобработки АЗП на состояние проантиоксидантного статуса проростков при кадмиевом стрессе
3.2.4. Влияния АЗП на отложение лигнина в базальной части корней в условиях кадмиевого стресса и распределение токсических ионов по тканям
3.3. Вклад АЗП в индуцированной салициловой кислотой устойчивости пшеницы к токсическому действию ионов кадмия
Заключение 93
Выводы 98
Список литературы
- Участие АЗП в гормональной регуляции ростовых процессов растений пшеницы
- Определение митотического индекса в клетках зоны меристемы корней пшеницы
- Определение активности пероксидазы
- Влияния АЗП на отложение лигнина в базальной части корней в условиях кадмиевого стресса и распределение токсических ионов по тканям
Участие АЗП в гормональной регуляции ростовых процессов растений пшеницы
Концентрацию свободных форм АБК, ИУК, цитокининов и АЗП в корнях 4-суточных проростков в ходе обработки ацетатом кадмия определяли методом иммуноанализа (Shakirova et al., 2004). Для этого навеску, состоящую из 10 растений, растирали в жидком азоте и экстрагировали гормоны 80% этанолом 16 ч при 4С. После центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g супернатант упаривали в токе воздуха до водного остатка, в аликвоте которого определяли суммарное содержание иммунореактивных к анти-зеатинрибозидной сыворотке форм цитокининов (Кудоярова и др., 1990). Оставшийся водный остаток затем подщелачивали 2%-ным гидрокарбонатом натрия, экстрагируя нейтральные и основные соединения серным эфиром (2 : 1). Процедуру повторяли дважды. Эфирный экстракт отбрасывали, из водного раствора после подкисления 1 н НСl ИУК и АБК дважды экстрагировали серным эфиром и метилировали диазометаном. После упаривания эфирного экстракта сухой остаток растворяли в 80%-ном этаноле, в аликвоте которого анализировали количество этих фитогормонов методом иммуноанализа (Ямалеев и др., 1989).
Оставшийся после центрифугирования спиртового экстракта твердый растительный осадок заливали 50 мМ НСl (1 : 5) и экстрагировали лектин в течение 1 ч при комнатной температуре. После центрифугирования при 15 000 g в течение 15 мин надосадочную жидкость, содержащую этот белок, нейтрализовали 1 М фосфатным буфером (рН 7.2–7.4) в соотношении 1 : 10 и вновь центрифугировали. Полученный супернатант использовали для количественного определения лектина методом ИФА (Shakirova et al., 2004).
Содержание лектина в растительных образцах определяли методом непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (Шакирова и др., 1993). Полистироловые планшеты ("Costar", США) сенсибилизировали АЗП ("Serva", ФРГ) в концентрации 0.5 мкг/мл в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7.2) при 37С в течение 1.5 ч. Для удаления не связавшихся с полистиролом молекул белка, как и на всех последующих этапах, лунки трижды промывали фосфатно-солевым буфером (рН 6.0–7.0), содержащим 0.05% твин-20 (ФТ). В промытые лунки приливали ФТ, содержащий 0.5% желатины (ФТЖ) в качестве балластного белка, аликвоты растительных экстрактов или чистого препарата АЗП (1 мг/мл) в виде десятичных стандартных разведений, и анти-АЗП сыворотку, разведенную в ФТЖ. Смесь инкубировали при 37 С в течение 1 ч. После промывки проводили количественную оценку сорбированных на планшете анти-АЗП антител путем добавления в лунки разведенных в ФТЖ меченых пероксидазой антикроличьих антител (ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва). Планшеты выдерживали 1 ч при 37С, после промывки в лунки добавляли субстрат для оценки связавшейся со стенками лунок пероксидазной активности, содержащий ортофенилендиамин (ОФД) (0.05%), перекись водорода (0.016%) в 0.06 М фосфатном буфере (рН 5.8). Развитие окраски останавливали добавлением 4 н серной кислоты. Интенсивность хромофорного ответа определяли на приборе "Benchmark Microplate Reader" ("Bio-Rad", США) при 492 нм. Содержание лектина в экстрактах рассчитывали по калибровочной кривой оптической плотности стандартных растворов АЗП с использованием оригинальной компьютерной программы.
Иммуноанализ свободных форм АБК, ИУК и суммарных форм цитокининов, иммунореактивных к сыворотке, полученной к зеатин-рибозиду, с использованием конъюгатов каждого из этих гормонов с человеческим сывороточным альбумином для сенсибилизации планшет и специфичных к фитогормонам кроличьих антител включал все этапы, указанные выше для оценки количества АЗП, согласно (Ямалеев и др., 1989; Кудоярова и др., 1990).
Подготовку материала, заливку в метакрилатную смолу JB 4, проведение иммуногистохимического анализа распределения АБК и АЗП с использованием полученных нами поликлональных специфических антител к АБК и АЗП выполняли согласно (Ахиярова и др. 2008). Сбор образцов для изучения иммуногистохимического распределения АБК и АЗП в тканях корня проводили через 7 ч после начала воздействия ацетата кадмия. Корни фиксировали в 4%-ном растворе карбодиимида (Sigma, Япония) для иммунолокализации АБК, и в смеси 4% формальдегида и 1% глутарового альдегида приготовленных на 0.1 М фосфатном буферном растворе (рН 7.4), в течение суток. На следующем этапе образцы тканей отмывали в течение 1 ч в 0.1 М фосфатном буферном растворе (рН 7.4). Дегидратацию образцов проводили в серии разведений этанола (30, 50, 70, 90 и 96 %), выдерживая в каждом по 30 мин. Затем их заключали в заливку в метакрилатную смолу JB 4 (Electron Microscopy Sciences, США). С помощью ультрамикротома готовили гистологические срезы толщиной 1 мкм. Иммунолокализацию проводили, как описано в статье Ахияровой и др. 2008, с небольшими модификациями. На первом этапе на срезы наносили по 50 мкл раствора 0.1 М фосфатного буферного раствора (рН 7.2—7.4), содержащего 0.2 % желатина и 0.05 % Tween-20 (ФЖТ), выдерживая их в течение 30 мин во влажной камере. После промывания дистиллированной водой часть срезов обрабатывали иммунной сывороткой, содержащей антитела к АБК, а также к АЗП, по 20 мкл на каждый срез (в разведении 1 : 2). В качестве контрольных использовали образцы, обработанные козьей сывороткой, не содержащей антитела к АБК и АЗП. Указанное разведение сывороток готовили на растворе ФЖТ. Обработанные сывороткой срезы помещали во влажную камеру на 2 ч, предварительно закрыв парафильмом. Затем проводили 3-кратное промывание раствором ФТ. В качестве вторичных антител использовали меченные FITС антикроличьи антитела или антитела DyLight 633, которые применяли согласно протоколу (Agrisera, Швеция). Срезы анализировали с помощью конфокального микроскопа LSM5 (Carl Zeiss, Германия), используя камеру AxioCam HR, при возбуждающей длине света 633 нм с использованием барьерного фильтра LP 650 после отражения через дихроичное зеркало NFT 545.
Определение митотического индекса в клетках зоны меристемы корней пшеницы
Гистохимическое определение H202 было выполнено с использованием 3,3-диаминобензидина (ДАБ) в качестве субстрата. Отрезки 1 см кончиков корней погружали в раствор 0,01% ДАБ в 10 мМ ФБ рН 7,2 на 1-3 мин. В раствор непосредственно перед использованием добавляли 0,02% H202. После формирования стойкой коричневой окраски (стабильного бензидинового коричневого) стабилизировали цвет ополаскиванием 96% спиртом. Затем готовили постоянные препараты окрашенных ДАБ кончиков корней, путем заливки на предметном стекле в желатин-глицерин.
Для окрашивания поперечных срезов кончиков корней, залитых в метакрилатную смолу JB-4 в области летеральной меристемы использовали 0,1% ДАБ, добавляя в него перед окрашиванием 0,02% H202. На срезы наносили по 50 мкл раствора ДАБ, а затем инкубировали во влажной камере при комнатной температуре 12 ч в отсутствие прямого света.
Окрашенные срезы фотографировали с помощью микроскопа Biozero 810 (Keyence, Япония).
Содержание малонового диальдегида (МДА), являющегося одним из основных продуктов перекисного окисления липидов, определяли, как описано ранее (Bezrukova et al, 2008). Навеску корней около 0.5 г гомогенизировали в 10% трихлоруксусной кислоте и после центрифугирования к супернатанту добавляли равный объем тиобарбитуровой кислоты и смесь кипятили 30 мин при 100С. После центрифугирования измеряли оптическую плотность супернатанта при 532 нм и рассчитывали количество МДА, используя коэффициент экстинкции 155000 М-1 см"1.
РНК из растений выделяли по методу, описанному Boothe et al. (1995). Для этого проростки растений растирали в жидком азоте до гомогенного состояния. К полученному образцу добавляли гуанидин-тиоцианатный буфер (4 М гуанидин-тиоцинат; 2% саркозил; 50 тМ Трис, рН 8.0; 10 mM EDTA; 1% меркаптоэтанол) из расчета 5 мл к 1 г сырой массы растительного материала и тщательно перемешивали до получения однородной массы. Образцы переносили в центрифужные пробирки и добавляли к ним равный по отношению к буферу объем водонасыщенного кислого фенола (pH 5.0), 0.2 объема 10% ДДС натрия, 0.1 объем 3 M CH3COONa, pH 4.0 и 0.2 объема хлороформа. Смесь интенсивно перемешивали на встряхивателе (Elpan, Польша) в течение 15 мин, затем центрифугировали 20 мин при +4 С и 10000 об/мин. Верхний водно-солевой слой, содержащий суммарную фракцию РНК, переносили в чистую пробирку и подвергали депротеинизации добавлением к ней равного объема смеси водонасыщенного фенола и хлороформа (1 : 1) с последующим центрифугированием в тех же условиях. Процедуру депротеинизации повторяли до исчезновения интерфазы. РНК осаждали добавлением к верхней фазе 2-х объемов изопропанола, смесь инкубировали при -20 С в течении 12-16 ч. РНК осаждали центрифугированием, промывали 70%-ным этанолом и растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды, обработанной диэтилпирокарбонатом. Концентрацию РНК измеряли при А2бо/А28о на спектрофотометре Smart Spec Plus (Bio-Rad). Выравненные по концентрации образцы РНК использовали для определения уровня экспрессии гена АЗП с методом полуколичественной ПЦР с обратной транскрипцией. Все манипуляции с образцами РНК проводили при температуре не превышающей 4 С. 2.15. Полимеразная цепная реакция
ПЦР проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01-«Терцик» фирмы ДНК-Технология следующим образом: начальная денатурация - 94С, 2 мин; 25-35 циклов амплификации: 1) денатурация - 94С, 30 сек; 2) отжиг - от 61 до 68С, 1 мин; 3) элонгация - 72С, 30 сек; достраивание цепей ДНК - 72С в течение 5 мин. Реакция проводилась в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-НС1, 15 мМ (NH4)2S04, 2 мМ MgCl2, 0.1 мкг геномной ДНК, по 2 пМ каждого праймера, по 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ и 1 е.а. Taq-полимеразы.
2.16. Реакция обратной транскрипции РНК и полуколичественный анализ транскрипции генов
Реакцию обратной транскрипции проводили в 20 мкл общего объема смеси, содержащей 10 мкг общей РНК, 1 мкл M-MuLV обратной транскриптазы, 9 мкл 1х буфера для обратной транскрипции, 32 мМ MgCl2, 1 мкл олигонуклеотидных праймеров, по 5 l 1.25 mM dNTP. При этом отжиг олигонуклеотидных праймеров на матрице РНК проводили в течение 5 мин при 65 С и построение кДНК по матрице РНК в течение 1 ч при 37 С. Полученную одноцепочечную кДНК использовали в реакции амплификации. Для полуколичественного анализа транскрипции генов эмпирически подбирались температура отжига и количество циклов в экспоненциальной фазе амплификации. Транскрипционную активность генов АЗП оценивали при помощи подобранных на основе имеющихся в Генбанке последовательностей мРНК АЗП праймеры: F 5 CCTGCCGCGCCGACATCAAGTG 3 , R 5 GCAGCCGCCGCCGCAGAAC 3 , с образованием продукта размером 119 п.н. Для выравнивания результатов ОТ-ПЦР использовали реакцию амплификации гена с конститутивной экспрессией в пшенице RLI (Rnase L inhibitor-like protein), используя праймеры F (5 TG-AGC-AACCAGG-ACC-AG-3 ), R (5 -GCTTC-CAA-GGC-ACA-AAC-AT-3 ) (Gimenez M. J. et al, 2011) или гена -тубулина пшеницы, имеющую последовательность: F (5 - TCTTCATGGTGGGCTTCGC -3 ) и R (5 -CGCCTCGGGTGAACTCCATCT -3 ) (Ciaffi et al, 2005).
Продукты ПЦР, ОТ-ПЦР и образцы РНК анализировали с помощью горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле в ТАЕ буфере (40 мМ трис-ацетат (рН 7,6) и 2 мМ ЭДТА) при 10 V/см (Sambrooke, 1989) в приборах подводного типа Bio-Rad Sub-Cell GT WIDE MINI (США). В качестве маркеров использовали фрагменты ДНК фага X после расщепления рестриктазами. После окончания электрофореза гели окрашивали бромистым этидием (1 мкг/мл). Флуоресценцию нуклеиновых кислот наблюдали в ультрафиолетовом трансиллюминаторе ТМ-36 (UV Products, Inc., США). О росте растений, наряду с изменением интенсивности деления клеток апикальной меристемы корней, судили по приросту сырой и сухой массы предобработанных и необработанных АЗП проростков, подвергнутых воздействию ацетата кадмия. Для определения сухой массы растительный материал высушивали до воздушно-сухого состояния при 70оС. Все опыты проводили не менее чем в трех биологических повторах и четырех-пяти аналитических повторах. В иллюстрациях представлены средние арифметические значения и ошибки средних. Статистическую обработку проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.
Определение активности пероксидазы
Из рис. 17а видно, что показатели коэффициентов отношений ИУК/АБК в корнях необработанных АЗП проростков в ходе кадмиевого стресса стабильно низкие, что связано как с резким обратимым накоплением АБК, так и драматическим падением содержания ИУК в этих условиях (рис. 7а и б). В то же время в корнях предобработанных АЗП проростках эти показатели существенно выше, что связано с меньшей амплитудой вызываемых кадмием изменений в содержании как АБК, так и ИУК (рис. 17а).
Динамика изменений коэффициентов отношений содержания цитокининов к АБК в корнях предобработанных и необработанных АЗП растений заметно отличается от таковых ИУК к АБК (рис. 17). Постепенное увеличение этого показателя в ходе опыта у необработанных АЗП проростков также связано с обратимым накоплением АБК, так и заметным восстановлением уровня цитокининов в корнях в ходе стресса (рис. 7в). Однако важно отметить, что в корнях АЗП-предобработанных растений коэффициенты отношения содержания цитокининов к содержанию АБК существенно выше и в конце опыта этот показатель соответствует уровню контроля (рис. 17б). Ранее сотрудниками лаборатории было выявлено, что сама обработка АЗП вызывает быстрое кратковременное накопление АБК с максимумом на 1 ч и более стойкое увеличение содержания ИУК и особенно цитокининов, что отражается в реализации его рост-стимулирующего эффекта на проростки (Shakirova et al., 2004). Вероятно, вследствие этого предобработанные АЗП растения характеризуются меньшей амплитудой вызываемых кадмием сдвигов в балансе фитогормонов и меньшим уровнем повреждающего действия кадмия на ростовые процессы.
Таким образом, в основе проявления защитного действия предобработки АЗП на ростовые процессы растений пшеницы при стрессе лежит предотвращение в них резких перестроек в гормональной системе
Коиммунолокализация АЗП и АБК в тканях корней 4-сут проростков пшеницы, подвергнутых воздействию кадмия Как показано выше (раздел 3.1), ключевую роль в регуляции вызываемой обработкой кадмием экспрессии АЗП играет эндогенная АБК, уровень которой в корнях в ответ на кадмий возрастает уже в течение первого часа более чем в два раза. Для лучшего понимания их взаимодействия интересно было проанализировать ко-иммунолокализацию АЗП и АБК в растительных тканях в условиях кадмиевого стресса. С помощью конфокальной лазерной микроскопии нам впервые удалось провести сравнительный анализ иммунолокализации АЗП и АБК на поперечных срезах в начале зоны элонгации корней проростков пшеницы, подвергнутых воздействию токсических ионов, с использованием кроличьих антител против АЗП и АБК и DyLight 633 анти-кроличьих антител.
Данные, представленные на рисунке 18, демонстрируют вызываемую кадмием интенсификацию накопления АБК преимущественно в клетках ризодермы, перицикла, сосудах мета- и протоксилемы и менее выраженное дискретное свечение - в клетках первичной коры и стеллярной паренхимы (рис. 18а-в). В тоже время предобработка АЗП оказывает защитный эффект на растения при стрессе, о чем свидетельствует и существенно меньший уровень накопления АБК в них. Это четко проявляется в иммуногистохимическом распределении гормона в тканях корней, которое характеризуется пониженной дискретной иммунофлуоресценцией гормона в ризодерме и первичной коре и повышенной - в клетках центрального цилиндра, что указывает на то, что в этом варианте опыта АБК главным образом сосредотачивается в области сосудов мета-и протоксилемы (рис. 18в).
Иммуногистохимический анализ АЗП, вывил, что кадмий вызвал сходное по локализации с АБК усиление иммунофлуоресценции АЗП в ризодерме, клетках первичной коры, перицикле, мета- и протоксилеме (рис. 18г-е). В предобработанных АЗП и подвергнутых стрессу корнях интенсивность иммунофлуоресценции АЗП преимущественно выявлялась в области ризодермы и клетках сосудистой системы, но на существенно меньшем уровне в сравнении с вариантом опыта с одним кадмием (рис. 18е), что также может служить аргументом меньшей степени повреждающего действия кадмия на АЗП предобработанные проростки.
Ко-локализация АБК и АЗП в тканях корней растений пшеницы, подвергнутых воздействию токсических ионов, иллюстрирует вовлечение лектина в спектр АБК-контролируемых защитных реакций растений пшеницы на этот стресс.
Рис. 18. Влияние 1 мМ ацетата кадмия на иммуногистохимическое распределение АБК (а-в) и АЗП (г-е) в начале зоны растяжения корней 4-сут проростков пшеницы: а, г – контроль; б, д – 7 ч кадмия; в, е – 24 ч АЗП + 7 ч кадмия. В вариантах без предварительного воздействия специфических антител АБК и АЗП не выявлялись. 3.2.3. Влияние предобработки АЗП на состояние про-/антиоксидантного статуса проростков при кадмиевом стрессе
Способность экзогенного АЗП вызывать усиление продукции АФК и контролировать последующую активацию антиоксидантных ферментов может иметь важное значение в предадаптации растений пшеницы к последующим стрессовым ситуациям и уменьшении уровня повреждающего действия АФК на них. Действительно, как видно из рисунка 19, сама обработка АЗП привела к быстрому двукратному накоплению супероксид радикала в проростках с максимумом, приходящимся на 2-3 ч, что отразилось в небольшом увеличении уровня МДА, одного из основных конечных продуктов перекисного окисления липидов. Так, в контрольном варианте содержание МДА в проростках составляет 94 нМ/г сырой массы, тогда как через 24 ч воздействия АЗП - 104 нМ/г сырой массы.
При этом необходимо напомнить, что обработка АЗП оказывает рост-стимулирующий эффект на проростки, в связи с чем выявленное нами быстрое транзиторное накопление супероксид радикала и небольшое повышение уровня МДА в ответ на экзогенный АЗП является вполне благоприятным для растений. Вместе с тем, известно, что в низких концентрациях АФК выполняют важную роль сигнальных молекул, запускающих защитные реакции в ответ на стрессовые факторы, в частности, вызывающие нарушение водного режима (Miller et al., 2010). Таким образом, индуцируемое АЗП накопление АФК может внести вклад в регуляцию предадаптирующего действия АЗП на растения пшеницы к возможным стрессовым воздействиям.
Из данных, приведенных на рис. 20 и 21, видно, что кадмий вызывает существенные сдвиги в состоянии про- и антиоксидантной систем в проростках пшеницы в сравнении с контролем, связанные с накоплением АФК и последующей активацией антиоксидантных ферментов, что согласуется с имеющимися в литературе сведениями (Gallego et al., 2012). Так, в ответ на обработку кадмием в 4-х суточных проростках происходит резкое накопление супероксид радикала с максимумом на первый час инкубации (рис. 20а) и последующая активация супероксиддисмутазы с максимумом на 2 ч (рис. 20б).
Вместе с тем, предобработанные АЗП проростки характеризуются значительно меньшим уровнем кадмий-индуцированной генерации супероксид радикала и активации СОД (рис. 20), вероятно, благодаря предадаптирующему эффекту лектина, который, в частности, проявляется в кратковременном усилении продукции АФК в ходе предобработки растений АЗП.
Влияния АЗП на отложение лигнина в базальной части корней в условиях кадмиевого стресса и распределение токсических ионов по тканям
В предобработанных СК в смеси с ингибитором биосинтеза АБК флуридоном проростках заметных изменений в уровне эндогенной АБК в корнях в ответ на ацетат кадмия не наблюдалось (рис. 28а).
Накопление АБК является характерным ранним ответом растений на кадмиевый стресс, что приводит к закрытию устьиц и торможению поглощения и транспорта воды и отражается в задержке роста и развития растений (DalCorso et al., 2008). Вместе с тем АБК играет ключевую роль в индукции экспрессии широкого спектра чувствительных к ней белков, задействованных в защите клеток от повреждающего действия стрессовых факторов, вызывающих обезвоживание (Nakashima, Yamaguchi-Shinozaki, 2013).
К таковым, в частности, относится АЗП (Skriver, Mundy, 1990; Cammue et al., 1989). Поэтому неудивительно, что на фоне накопления АБК наблюдалась активация транскрипции гена АЗП и последующее двукратное транзиторное увеличение концентрации лектина в корнях проростков, подвергнутых воздействию ацетата кадмия (рис. 28б, в), которое сопровождалось усилением его экскреции в наружную среду (рис. 29). 10 Контроль Cd (СК)+Cd (Фл+СК)
Влияние предобработки 50 мкМ СК на концентрацию АЗП в среде инкубирования 4-сут предобработанных и необработанных 5 мг/л флуридоном проростков пшеницы через 7 ч воздействия 1 мМ ацетата кадмия на них. Так, уже через 7 ч воздействия ацетата кадмия содержание АЗП в среде вдвое превышало значение контроля. В предобработанных СК и подвергнутых стрессу растениях, как и при анализе АБК, уровень транскрипционной активности гена АЗП и содержание лектина в корнях были существенно ниже (рис. 28б, в), что отразилось и в уменьшении почти на 50% содержания лектина в среде (рис. 29). В варианте опыта с предобработкой СК в смеси с флуридоном в условиях стресса показатели концентрации лектиновых мРНК и содержания АЗП в корнях оставались на уровне близком контролю вследствие предотвращения под влиянием ингибитора вызываемого ацетатом кадмия накопления АБК (рис. 28). Такая же картина наблюдалась и при анализе уровня лектина в среде инкубирования проростков (рис. 29).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что активация транскрипции гена АЗП и обратимого накопления лектина в корнях предобработанных СК проростков при воздействии ацетата кадмия, а также экскреции белка в наружную среду в область корневого чехлика обусловлена поддержанием в этих растениях повышенной концентрации АБК.
Ранее в нашей лаборатории было показано участие АЗП в стимуляции деления клеток апикальной меристемы корней в норме (Безрукова и др., 2004), предотвращении стресс-индуцированного торможения деления клеток кончиков корней, а также ускорении восстановления роста клеток корней делением в постстрессовый период (Кильдибекова и др., 2004б; Bezrukova et al., 2008).
Для оценки вовлечения АЗП в проявление защитного эффекта СК на ростовые процессы растений при кадмиевом стрессе нами в необработанных и предобработанных СК в присутствии или отсутствие флуридона проростках пшеницы был проведен анализ МИ корней при действии ацетата кадмия.
Данные таблицы 5 иллюстрируют рост-ингибирующий эффект ацетата кадмия на деление клеток апикальной меристемы корней, который проявился уже через 7 ч воздействия. СК-предобработанные проростки характеризовались существенно меньшим уровнем повреждающего действия ацетата кадмия на рост клеток и поддержанием МИ корней в этих условиях на уровне даже несколько выше контроля (табл. 5). В присутствии флуридона протекторный эффект СК на этот показатель не выявлялся, что иллюстрирует важную роль эндогенной АБК в проявлении защитного действия СК на растения пшеницы при кадмиевом стрессе.
Основываясь на данных о важной роли АЗП в уменьшении уровня повреждающего действия засоления на деление клеток апикальной меристемы корней пшеницы (Безрукова и др., 2004), можно было предположить, что предотвращение защитного эффекта СК на рост клеток кончиков корней в условиях кадмиевого стресса при совместной с флуридоном предобработке связано с подавлением под влиянием флуридона СК-индуцированного усиления транскрипции гена АЗП и накопления АЗП в корнях (рис. 28), а также его экскреции во внешнюю среду (рис. 29).
Из табл. 5 видно, что предобработка АЗП способствует поддержанию митотической активности клеток кончиков корней в условиях кадмиевого стресса на уровне близком контрольному варианту и эти результаты согласуются с полученными ранее данными о предотвращении под влиянием АЗП вызываемого засолением ингибирования деления клеток апикальной меристемы корней пшеницы (Кильдибекова и др., 2004б). Вместе с тем, инкубирование проростков, предобработанных АЗП в смеси с флуридоном, полностью предотвратило проявление его защитного эффекта на МИ корней при стрессе, так же как и в варианте опыта с совместной с флуридоном предобработки СК и последующем воздействии кадмия (табл. 5). Внесение же в среду инкубирования предобработанных смесью СК с флуридоном растений АЗП совместно с ацетатом кадмия способствовало поддержанию МИ корней на уровне близком контролю или предобработанных СК растений при воздействии ацетата кадмия (табл. 5).
Выявленный эффект является следствием обработки именно АЗП, поскольку запасной белок пшеницы глиадин не оказал защитного действия на деление клеток корней предобработанных смесью СК и флуридона растений в условиях стресса (табл. 5).