Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 15
1.1 Тритерпеновые гликозиды как одна из важнейших групп
углеводсодержащих изопреноидов (терпеноидов) растений 15
1.1.1 Строение, классификация, распространение и содержание в растениях, биосинтез 15
1.1.2 Биологическая активность тритерпеновых гликозидов и их возможные функции в растениях ..
1.1.2.1 Рострегулирующая активность тритерпеновых гликозидов... 23
1.1.2.2 Антифунгальная активность, антибактериальная активность и другие виды биологической активности тритерпеновых гликозидов
1.2 Медико-биологические свойства тритерпеновых гликозидов.. 54
1.3 Биология, химический состав и практическое значение сильфии пронзеннолистной (Silphium perfoliatum) 61
1.3.1 Систематика, морфология, физиологические особенности, опыт выращивания и использования S. perfoliatum 6 1
1.3.2 Вещества вторичного метаболизма и их биологическая активность 70
1.3.3 Другие соединения 76
ГЛАВА 2 Материал и методы исследования 80
2.1 Методы выделения, анализа и установления строения
тритерпеновых гликозидов из S. perfoliatum 80
2.1.1 Общая характеристика методов исследования и материалов... 80
2.1.2 А н ализ качественного состава тритерпеновых гликозидов надземной части растений S. perfoliatum с различных мест произрастания и в разные фазы вегетации 83
2.1.3 Экстракция, очистка, получение индивидуальных тритерпеновых гликозидов из растительного материала и их характеристика 83
2.1.4 И з у чение строения сильфиозида В 87
2.1.5 И з у чение строения сильфиозида Е 89
2.1.6 Изучение строения сильфиозида С 90
2.1.7 Изучение строения сильфиозидов F и G 91
2.1.8 Изучение строения сильфиозида А 93
2.1.9 Лабораторный способ получения очищенной суммы тритерпеновых гликозидов 2.2 Изучение рострегулирующей активности тритерпеновых гликозидов из S. perfoliatum 94
2.3 Методы изучения ферментативной активности и содержания суммарного белка в проростках T. aestivum при действии экзогенных тритерпеновых гликозидов
2.3.1 Растительный материал 98
2.3.2 Определение активности - и -амилаз 99
2.3.3 Определение активности пероксидазы 100
2.3.4 Определение активности ИУК-оксидазы 101
2.3.5 Определение активности полифенолоксидазы (катехолоксидазы) 103
2.3.6 Определение содержания суммарного белка
2.4 Методы изучения рострегулирующей активности суммы тритерпеновых гликозидов и экстракта из S. perfoliatum в оптимальных условиях и при действии абиотических стрессовых факторов 105
2.5 Методы изучения действия экстракта из S. perfoliatum на физиолого-биохимические показатели и зерновую продуктивность T. aestivum 109
2.5.1 Условия выращивания растений и методика проведения полевых опытов 109
2.5.2 Определение ростовых параметров растений, содержания суммы сахаров в узлах кущения, зеленых пигментов, водоудерживающей способности листьев и сухой массы органов растений 113
2.5.3 Анализ зерновой продуктивности, содержания белка, количества и качества сырой клейковины в зерне
2.6 Изучение действия экстракта из S. perfoliatum на корнеобразование, укореняемость и рост черенков травянистых и древесных культур 116
2.7 Методы изучения тритерпеновых гликозидов и экстракта из S. perfoliatum на наличие антифунгальной и антибактериальной активности in vitrо 118
2.8 Методы исследования медико-биологических свойств препарата суммы тритерпеновых гликозидов и экстракта из S. perfoliatum 121
2.8.1 Изучение острой токсичности и гиполипидемической активности препарата суммы тритерпеновых гликозидов 121
2.8.2 Изучение экстракта из S. perfoliatum на наличие регенерирующей активности 121
2.9 Обработка экспериментальных данных и представление
результатов исследования 122
Результаты исследования и их обсуждение
ГЛАВА 3 Состав и строение тритерпеновых гликозидов из s. perfoliatum 124
3.1 Оценка качественного состава и количественного содержа ния тритерпеновых гликозидов в надземной части растения 124
3.2. Строение сильфиозида В 126
3.3 Строение сильфиозида Е 129
3.4 Строение сильфиозида С 134 3.5 3.6
3.7 Строение сильфиозидов F и G 140
Строение сильфиозида А 142
Структурные особенности тритерпеновых гликозидов из S. 145
perfoliatum
ГЛАВА 4 Биологическая активность тритерпеновых гликозидов из s. perfoliatum
Рострегулирующая активность тритерпеновых гликозидов.. Влияние тритерпеновых гликозидов на активность - и -амилаз в проростках T. аestivum
4.1 4. 4.3 Влияние тритерпеновых гликозидов на активность пероксидазы, ИУК-оксидазы и полифенолоксидазы (катехолоксидазы) в проростках T. аestivum .
4.4 Влияние тритерпеновых гликозидов на содержание суммарного белка в проростках T. aestivum .
ГЛАВА 5 Биологическая активность суммарных препаратов тритерпеновых гликозидов из s. perfoliatum, возможность их использования
5.1 Рострегулирующая активность суммы тритерпеновых гликозидов и экстракта из S. perfoliatum .
5.2 Влияние суммы тритерпеновых гликозидов и экстракта из S. perfoliatum на рост проростков агрокультур при действии высокотемпературного и солевого стресса .
5.3 Влияние экстракта из S. perfoliatum на физиолого-биохимические показатели T. aestivum в полевых условиях
5.4 Влияние экстракта из S. perfoliatum на зерновую продуктивность, содержание белка и клейковины в зерне T. aestivum
5.5 Влияние экстракта из S. perfoliatum на укореняемость и рост черенков травянистых и древесных культур .
5.6 Антифунгальная активность in vitro тритерпеновых гликозидов и их суммарных препаратов 206
5.7 Изучение суммы тритерпеновых гликозидов и экстракта из S. perfoliatum на наличие антибактериальной активности in vitro 213
ГЛАВА 6 Медико-биологические свойства суммарных препаратов тритерпеновых гликозидов из s. perfoliatum 215
6.1 Гиполипидемическая активность препарата суммы тритерпеновых гликозидов 215
6.2 Регенерирующая активность экстракта из S. perfoliatum 219
Заключение.. 222
Выводы 226
Предложения по практическому использованию результатов исследования... 230
Список литературы
- Биологическая активность тритерпеновых гликозидов и их возможные функции в растениях
- Экстракция, очистка, получение индивидуальных тритерпеновых гликозидов из растительного материала и их характеристика
- Строение сильфиозида Е
- Антифунгальная активность in vitro тритерпеновых гликозидов и их суммарных препаратов
Введение к работе
Актуальность исследования. Тритерпеновые гликозиды (ТГ)
(cапонины) образуют одну из важнейших групп вторичных метаболитов
растений. В течение последних десятилетий эти соединения были объектами
пристального исследования, позволившего выявить их уникальное
структурное многообразие и широкий спектр фармакологической активности. Однако биологическая роль ТГ в растениях до настоящего времени остается не достаточно выясненной.
Обнаружение у ТГ рострегулирующих свойств, а также их высокого
содержания и скорости биосинтеза в интенсивно растущих органах и тканях
свидетельствует о возможном участии этих веществ в регуляции физиолого-
биохимических процессов, лежащих в основе роста, развития,
стрессоустойчивости растений.
Эти соединения также играют важную роль в экологии растений.
Установление строения ТГ, изучение их действия на ростовые и метаболические процессы в растениях, выявление отношений между структурой и биологической активностью гликозидов необходимо не только для выяснения их биорегуляторных функций, но и разработки способов возможного практического использования как регуляторов роста растений. Это особенно важно в связи с необходимостью создания для нужд сельского хозяйства эффективных экологически безопасных рострегулирующих препаратов нового поколения на основе природных соединений.
Многие ТГ представляют интерес в этом аспекте еще и как вещества,
обладающие антифунгальной, антибактериальной, антивирусной,
моллюскоцидной, нематоцидной, инсектицидной активностью, что позволяет обозначить важнейшую функцию ТГ как фитозащитных веществ.
Сочетание гидрофобного тритерпеноидного агликона и гидрофильных молекул сахаров придает ТГ ярко выраженные поверхностно-активные свойства, благодаря которым эти вещества используются в различных областях хозяйства (парфюмерии, пищевой промышленности и т.п.).
ТГ и растения, их содержащие, благодаря разносторонней
фармакологической активности (иммуностимулирующей,
гиполипидемической, противовоспалительной, противоопухолевой и др.) прочно вошли в арсенал лекарственных средств современной медицины.
ТГ рассматриваются как одни из наиболее эффективных
гиполипидемических средств растительного происхождения. Но создание гиполипидемических препаратов на основе ТГ реализуется не в полной мере. Существенной причиной этого является отсутствие достаточной сырьевой базы. Поэтому важное значение имеет изучение гиполипидемической активности ТГ из новых видов доступного и ежегодно воспроизводимого сапониноносного сырья. Такого рода сырьем могут служить нетрадиционные культивируемые растения – продуценты ТГ.
Благоприятный эффект этих соединений на функциональное состояние кожи позволяет использовать их в дерматологии и в косметологии. В связи с этим целесообразно изучение действия ТГ на регенерацию тканей.
Таким образом, изучение строения, физиологической и метаболической активности ТГ как фиторегуляторов и исследование их медико-биологических свойств представляет актуальную задачу.
ТГ встречаются в различных семействах цветковых растений, главным
образом – в двудольных. Наиболее широко эти вещества представлены в таких
семействах этого таксона, как Apiaceae, Araliaceae, Asteraceae,
Cariophyllaceae, Chenopodiaceae, Fabaceae и др.
В результате поискового изучения ряда видов семейства Asteraceae (Сompositae), Астровые (Сложноцветные) нами было установлено наличие ТГ в Silphium perfoliatum L. (сильфиум, сильфия пронзеннолистная).
Высокая урожайность зеленой массы (свыше 100 т/га),
продолжительный период использования (более 10 лет), повышенное содержание питательных веществ, устойчивость к вредителям и болезням и другие ценные качества этого вида позволили отнести его к числу наиболее перспективных нетрадиционных кормовых культур. Кроме того, сильфия – хороший медонос, ценная экологическая и энергетическая культура, которая может использоваться как фитомелиорант и для получения твердого биотоплива, биогаза и целлюлозы. Известно применение сильфии в народной медицине.
В связи с указанным выше представилось целесообразным взять это растение для детального изучения.
Цель и задачи исследования. Цель работы – изучить состав и строение тритерпеновых гликозидов из надземной части S. perfoliatum, установить их действие на ростовые и некоторые метаболические процессы в растениях, исследовать антифунгальные, антибактериальные и медико-биологические свойства гликозидов и их суммарных препаратов, выявить связь между структурой и биологической активностью гликозидов, определить пути их возможного практического использования.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести оценку качественного состава и количественного
содержания ТГ в надземной части S. perfoliatum.
2. Выделить из надземной части растения индивидуальные ТГ и
установить их строение.
3. Изучить рострегулирующую активность основных ТГ S. perfoliatum,
установить влияние структуры гликозидов на активность.
4. Исследовать на биологической модели прорастающих зерновок
(проростков) пшеницы (Triticum aestivum) действие экзогенных ТГ из на
активность ферментов: - и -амилаз, пероксидазы, ИУК-оксидазы,
полифенолоксидазы (катехолоксидазы) и содержание суммарного белка в
проростках, выявить связь между структурой и метаболической активностью
гликозидов.
5. Оценить рострегулирующее действие суммы ТГ и экстракта из S.
perfoliatum в оптимальных условиях и при действии абиотических
стрессовых факторов (высокой температуры и засоления).
6. Изучить влияние экстракта из S. perfoliatum на физиолого-
биохимические показатели растений Т. aestivum в полевых условиях, выявить
действие экстракта на зерновую продуктивность, содержание белка, количество и качество сырой клейковины в зерне.
-
Установить эффективность экстракта из S. perfoliatum на корнеобразование, укореняемость и рост черенков травянистых и древесных культур.
-
Исследовать in vitro антифунгальную и антибактериальную активность ТГ и экстракта из S. perfoliatum.
9. Изучить медико-биологические свойства препаратов на основе ТГ:
гиполипидемическую активность суммы гликозидов и регенерирующую
активность экстракта из S. perfoliatum.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Особенности рострегулирующей активности ТГ из S. perfoliatum в зависимости от структуры и концентрации в биологических тестах, специфичных для фитогормонов – ауксинов, гиббереллинов и цитокининов.
-
Действие экзогенных ТГ на активность ферментов и содержание суммарного белка в проростках пшеницы. Зависимость стимулирующего эффекта ТГ на активность -амилазы от их структуры.
-
Рострегулирующие и антистрессовые свойства суммы ТГ и экстракта из S. perfoliatum. Влияние экстракта на физиолого-биохимические показатели и зерновую продуктивность озимой пшеницы. Эффективность действия экстракта на ризогенез и рост надземных органов черенков травянистых и древесных культур.
-
Антифунгальная активность in vitro ТГ из S. perfoliatum.
5. Гиполипидемическая активность суммы ТГ и регенерирующая
активность экстракта из S. perfoliatum.
Научная новизна. Впервые установлено, что одна из групп вторичных метаболитов кормовой культуры сильфии пронзеннолистной Silphium perfoliatum представлена тритерпеновыми гликозидами (ТГ). Показана стабильность качественного состава основных ТГ (сильфиозидов В, С, Е и G) растений сильфии пронзеннолистной, произрастающих в различных почвенно-климатических условиях и в разные фазы вегетации. Из надземной части растения выделено и установлено строение 6 ТГ, в том числе 4-х новых соединений, названных сильфиозидами А, В, С и Е.
Впервые изучены особенности рострегулирующей активности
основных ТГ сильфии – сильфиозидов B, C, E и G и продуктов их гидролиза, выявлены эффекты гликозидов, характерные для физиологической активности фитогормонов ауксинов, гиббереллинов и цитокининов. Получены оригинальные данные о стимулирующем действии экзогенных ТГ на активность -амилазы, суммарную амилолилитическую активность в проростках пшеницы. Впервые показаны изменения в активности ферментов, участвующих в метаболизме индолил-3-уксусной кислоты (ИУК): пероксидазы, ИУК-оксидазы, полифенолоксидазы в проростках пшеницы при действии экзогенных ТГ, приводящие к усилению ростовых процессов. Выявлено стимулирующее действие экзогенных ТГ на содержание суммарного белка в проростках пшеницы.
Установлена зависимость проявления гиббереллино- и
цитокининоподобных физиологических и метаболических эффектов от строения углеводной составляющей гликозидов.
Изучены рострегулирующие свойства препарата суммы сильфиозидов и экстракта из S. perfoliatum, установлено их протекторное действие на ростовые процессы в условиях высокотемпературного и солевого стресса.
Предложена методика оценки действия биологически активных
веществ, регулирующих устойчивость растений пшеницы к
высокотемпературному стрессу.
Впервые установлена эффективность экстракта из S. perfoliatum на рост, развитие, суммарное содержание сахаров в узлах кущения, хлорофиллов а и b, водоудерживающую способность в листьях, накопление сухой массы органов растений озимой пшеницы; показано, что при действии экстракта увеличивается урожайность, содержание белка и клейковины в зерне разных сортов озимой пшеницы, улучшается качество зерна. Установлено стимулирующее влияние экстракта из S. perfoliatum на корнеобразование, укореняемость и рост черенков травянистых и древесных культур.
Дана характеристика антифунгальной активности in vitro суммы сильфиозидов в отношении 7 видов фитопатогенных и сапрофитных грибов, выявлен фунгицидный эффект сильфиозидов на фитопатогенный гриб Drechslera graminea.
Изучены медико-биологические свойства суммы сильфиозидов и
экстракта из S. perfoliatum. Впервые показано, что сумма сильфиозидов
является нетоксичным препаратом и обладает выраженной
гиполипидемической активностью, а экстракт усиливает регенерацию тканей.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные дополняют и расширяют представления о структурном многообразии и биорегуляторном действии ТГ и вносят вклад в решение проблемы – выяснения биологической роли этих соединений в высших растениях.
Данные о структуре сильфиозидов используются в
хемотаксономических исследованиях родов и триб семейства Asteraceae (Нegnauer, 1989; Calabria, 2006).
На основании результатов исследования рострегулирующей
активности ТГ и экстракта из S. perfoliatum разработаны способы его возможного использования в растениеводстве в качестве экологически безопасного регулятора роста растений. Способ регулирования роста растений пшеницы позволяет при применении экстракта повысить продуктивность и улучшить качество зерна. Способ стимулирования укоренения и роста черенков, включающий использование экстракта в качестве стимулирующего средства, позволяет увеличить укореняемость черенков и получить высококачественные саженцы с хорошо развитой корневой системой и надземной частью.
Установление высокого гипохолестеринемического и
гипотриглицеридемического эффекта препарата суммы сильфиозидов
позволяет рекомендовать его для углубленного фармакологического
исследования как гиполипидемического средства. Выявление
регенерирующей активности экстракта из S. perfoliatum открывает возможность его использования в дерматологии и косметологии.
Научная новизна и практическая значимость исследований
подтверждена патентами на изобретения РФ.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность экспериментальных данных обусловливается применением современных физико-химических, аналитических, биологических методов исследования, подтверждается статистической обработкой результатов.
Основные положения диссертационной работы доложены на II
Международной научно-практической конференции «Современная биология:
актуальные вопросы» (Санкт-Петербург, 2014), на VII, VIII, IX и Х
Международных симпозиумах «Новые и нетрадиционные растения и
перспективы их использования» (Пущино – Москва, 2007, 2009, 2011, 2013),
на Международной научно-практической конференции «Рациональное
использование биоресурсов в АПК» (Владикавказ, 2006), на Международной
научно-практической конференции «Актуальные вопросы экологии и
природопользования» (Ставрополь, 2005), на VII Международной научно-
практической конференции «Нетрадиционное растениеводство, экология и
здоровье» (Алушта, 1998), на Международной научно-практической
конференции «Защита растений от вредных организмов в условиях
биологизации земледелия (Орел, 1998), на VII Всесоюзной конференции
молодых ученых «Роль ботанических садов в рациональном использовании и
воспроизводстве растительных ресурсов» (Ташкент, 1990), на
Республиканской научной конференции, посвященной 150-летию
Ботанического сада им. акад. А.В. Фомина «Роль ботанических садов в
охране и обогащении растительного мира» (Киев, 1989), на IX научно-
практической конференции «Механизмы интеграции биологических систем.
Проблема адаптации» (Ставрополь, 1989), на IX и Х научных конференциях
молодых ученых Пятигорского фармацевтического института (Пятигорск,
1986, 1987), на Краевой конференции участников философских
(методологических) семинаров «Ускорение научно-технического прогресса – коренной вопрос экономической политики» (Ставрополь,1986).
Публикации. Автором опубликовано всего 53 научные и учебно-методические работы, в том числе 36 по теме диссертации, из них 14 в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, получено 2 патента на изобретение РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, предложений по практическому использованию результатов исследования, списка литературы и приложения. Работа изложена на 288 страницах печатного текста. Содержит 34 таблицы в тексте и 1 в приложении, 38 рисунков в тексте и 2 в приложении. Список
литературы включает 526 источников, в том числе 315 на иностранных языках.
Отдельные фрагменты работы (по изучению строения и медико-биологических свойств ТГ) выполнены совместно с сотрудниками Пятигорского фармацевтического института (ныне Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал Волгоградского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения РФ) и Института химии растительных веществ им. академика С.Ю. Юнусова АН РУз.
Автор выражает искреннюю благодарность всем коллегам, принявшим участие в проведении совместных исследований.
Биологическая активность тритерпеновых гликозидов и их возможные функции в растениях
Долгое время изучение структуры ТГ ограничивалось лишь установлением строения агликона. В 60-х годах прошлого века под руководством академика Н.К. Кочеткова были разработаны аналитические и препаративные методы разделения смесей гликозидов и методы установления строения их углеводных составляющих. Благодаря этому удалось выделить и доказать структуру ТГ с большой молекулярной массой, получивших название «олигозидов».
Так, если к 1960 году в литературе было описано строение четырех гликозидов, то к началу 80-х годов их число приблизилось к 200, причем более 150 из них были изучены отечественными учеными. Значительные работы по изучению структуры и биологической активности ТГ в интактных растениях проведены В.Г. Бухаровым с сотр., Н.К. Абубакировым, Е.С. Кондратенко с сотр., Г.В. Лазурьевским, В.Я. Чирвой, В.И., Гришковцом с сотр., Э.П. Кемертелидзе, Г.Б. Деканосидзе с сотр., аралиевых и морских организмов – Г.Б. Еляковым, В.А. Стоником М.М., Анисимовым с сотр., в культуре клеток – Р.Г. Бутенко, А.М. Носовым с сотр.
Из зарубежных исследователей значительный вклад в изучение ТГ внесли немецкие, японские, индийские, польские, китайские и др. ученые.
За последние два десятилетия благодаря развитию хроматографических (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ) и физико-химических (масс-спектрометрия, ЯМР 1Н и 13С-спектроскопия) методов исследования в изучении структуры гликозидов достигнуты существенные успехи.
Установлены различные типы строения агликона и последовательности соединения моносахаридных остатков в углеводных цепях гликозидов.
Показано, что тритерпеновые агликоны имеют пентациклический или тетрациклический углеродный скелет. Первый лежит в основе олеанана, урсана, лупана, гопана, второй – даммарана, ланостана и др. Кольцевые системы А/B/C/D/E олеанана, урасана и их производных связаны друг с другом в порядке транс-транс-транс-транс. У лупана и его производных наблюдается транс-транстранс-цис сочленение колец, у производных даммарана - транс-транс-транс. Агликон может содержать различные заместители: -ОН, -ОСН3, =0, -СООН. У агликонов олеананового типа гидроксильная группа (-ОН) в положении С-3 находится во всех структурах, часто гидроксильные группы также могут находиться в положении С-16, С-21 и С-22 и менее часто в положениях С-2 и С-15 (рисунок 1).
Метильные группы в положениях С-23, С-24, С-28, С-29, С-30 могут быть окислены до СН2ОН или СООН-групп, а в некоторых случаях также до СНО-группы. Возможно также наличие эпоксидной группы, кето-функции и двойной связи между С-12 и С-13 (Thakur et al., 2011).
В составе углеводной части найдены следующие моносахариды: D-глюкоза, D-галактоза, D-глюкуроновая кислота, D-ксилоза, L-арабиноза, L-рамноза, D-рибоза, D-фукоза, D-хиновоза, D-ликсоза, D-апиоза (Деканосидзе и др., 1982; Thakur et al., 2011). Они образуют одну или две и редко три углеводные составляющие линейной или разветвленной структуры. Так, три углеводных фрагмента обнаружено у гликозида заниковой кислоты, выделенного из надземной части люцерны Medicago sativa L. (Oleszek et al., 1992).
Углеводная цепь гликозидов, агликоном которых являются производные олеанана, урсана, лупана, гопана, наиболее часто связана с ОН-группой у С-3 , но может находиться в другом месте. У музеина из Albizzia anthelmintica Brogn. сахарная цепь связана с ОН-группой у С-16. Вторая углеводная цепь, как правило, связана с СООН-группой при С-17. Встречаются гликозиды, которые имеют свободную гидроксильную группу при С-3 и углеводную часть, связанную с корбоксильной группой при С-17, например, азиатикозид из Centella asiatica (Linn.) Urban (Tschesche, Wulff, 1964).
В олигозидах сахарные остатки связаны с агликоном как с гидроксильной группой при С-3, так и карбоксильной группой при С-17. Олигозиды встречаются во многих растениях. Сапонины из различных видов Aralia, Panax, Hedera, Clematis, Patrinia, Quillaja и др. относятся к этому типу соединений. В отдельных гликозидах может содержаться до 10-12, максимально 18 сахаров.
В состав некоторых гликозидов входят остатки органических кислот: муравьиной, уксусной, малоновой, масляной, изовалериановой, тиглиновой, бензойной, коричной, феруловой, а в некоторых случаях серной, этерифицирующие как агликоны, так и углеводную часть (Деканосидзе и др., 1982; Thakur et al., 2011). В настоящее время существует несколько вариантов классификации ТГ, учитывающих те или иные особенности строения агликона и углеводной части. По структуре агликона гликозиды разделяются на 11 классов: олеанан, урсан, тараксастеран, лупан, гопан, циклоартан, даммаран, тирукалан, ланостан, кукурбитан, германикан.
Олеанан, урсан, лупан, гопан, даммаран подразделяются на 16 подклассов, поскольку углеводородные скелеты подвергаются реакциям фрагментации, омологации и деградации (Sparg et al., 2004; Vincken et al., 2007).
В зависимости от числа углеводных цепей R. Tchesche и G. Wulff (1973) разделили гликозиды на монодесмозиды и бисдесмозиды, то есть на соединения с одной и двумя углеводными составляющими соответственно. Вещества, содержащие углеводные цепи по карбоксильной группе агликона, М.Г. Мжельская и Н.К. Абубакиров предложили назвать ацилозидами (Деканосидзе и др., 1982).
Экстракция, очистка, получение индивидуальных тритерпеновых гликозидов из растительного материала и их характеристика
Сведения об антифунгальной активности ряда сапонинов обобщены в обзорах V. Bader, K. Нiller (1987) и T.H. Schpke, K. Hiller (1990). Отмечается ингибирующее действие гликозидов из Celmisia petrie на рост мицелия Cladosporium cladosporoides, гинзенозидов (концентрация 0,36%) – на рост мицелия (62,3%), продукцию афлотоксина В1 (38,7%) и афлотоксина G1 (22,9%) у Aspergillus parasiticus. Приводятся данные об антифунгальной активности сапонина А из Styrax officinalis в отношении фитопатогенных грибов Trichoderma viride (98%, 40 мкг/мл), Aspergillus niger (41%, 40 мкг/мл) и отсутствии действия против Rhizoctonia solani, Pythium aphanidermatum, Rhizopus mucco и Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici при концентрации 80 мкг/мл. Обсуждается эффект сапонинов из Camellia japonica и C. sinensis против патогенных грибов Pestolotia longiseta, Gloeosporium theae-sinensis, Pulicaria oryzae (отклонения в нормальном прорастании спор и конидий), Cochliobolus miyabeanus (ингибирование образования конидий), Diaporthe citri, Botrytis cinerea (отсутствие нормального образования конидий и роста гиф), Alternaria kikuchiana, А. mali (ингибирование роста гиф). Указывается на значение уроновой кислоты в структуре этих гликозидов и ацетилировании 18--гидроксильной группы агликона в проявлении антифунгальной активности.
Сапонины из С. oleifera проявили активность против грибов Mucor racemosus, Aspergillus oryzae, Rhizopus stolonifer, Saccharomyces cerevisiae и Penicillium glaucum при минимальных ингибирующих концентрациях 250, 250, 250, 31,3 и 125 мкг/мл соответственно (Hu et al., 2012).
Антифунгальной активностью обладали также сапонины, изолированные из листьев Raponea melanophloeos (Okhari, 1993). Гликозиды олеаноловой кислоты, транссильвиозиды А-С, выделенные из цветов Chephalaria transsylvanicа, проявили антигрибную активность против Klyveromyces fragilis, Aspergillus oryzae, А. flavus (Kirmizigul et al., 1996). Выделенные из Eclipta prostata З-0-глюкозид эхиноцистовой кислоты и бисдеcмозид эхиноцистовой кислоты, содержащий в углеводной части молекулы остаток серной кислоты, индуцировали морфологическую деформацию мицелия у Pyrwularia oryzae (Zhao et al, 2001).
Сумма сапонинов из Maesa lanceolata проявила умеренную фунгистатическую активность (Sindambiwe et al, 1998). Экстракт из этого растения был протестирован in vitro против широкого круга фитопатогенных грибов, таких как Phytophtora cryptogea, Trwhoderma virens, Aspergillus mger, Phoma sp., Fusanum oxysporum, Pythium ultimum, Cochliobolus heterostrophus, Rhizoctoma solani, Sclerotium rolfsii и Pyrenophora teres и был активен против всех грибов, кроме P. ultimum и R. solani (Okemo et al, 2003).
Антифунгальные свойства обнаружены у выделенных из семян Lathyrus rattan и L. aphaca двух монодесмозидов, содержащих в качестве агликонов кислоты олеананового и урсанового рядов. Соединение 2 наиболее активно тормозило рост Alternaria alternata (53,9%) (Khan, 2011).
Очищенный экстракт сапонинов из Balanites aegyptica при концентрации 4% проявил высокую (81,1%) и умеренную (34,7%) ингибирующую активность на рост Pythium ultimum и Alternaria solani соответственно, но слабо действовал против Fusanum oxysporum, Colletotrwhum coccoides и Vertwillium dahlia. Аналогичная концентрация сапонинового экстракта Quillaja saponaria вызывала умеренное торможение роста всех грибов, кроме С. coccoides. Экстракт сапонинов показал ингибирующую активность от умеренной до высокой (54,1-100%) против всех исследованных грибов (Сhapagain et al, 2007).
Изучена фунгицидная активность аммониевых и фосфиновых солей глицирризиновой кислоты. Ряд соединений при концентрации 100 мкг/мл обладали средней или достаточно высокой фунгицидной активностью по отношению к различным штаммам грибов (Alternaria alternata, Aspergillus mger, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Monilia sp., Mucor sp., Penicillium lividum, Trwhoderma у wide) (Дикусар и др. 2011).
Значительная антифунгальная активность in vitro выявлена у бисдесмозидов, выделенных из Diploknema butyracea J. F. Gmel и Sapindus mukorossi Gartn., содержащих качестве агликонов 16-а-гидроксипротобассиевую кислоту и хедерагенин соответственно (Saha et al., 2010). Авторы полагают, что сапонины из S. mukorossi, проявившие активность (СD50 181-407 мкг/мл) против Rhyzoctonia bataticola (Taub.) и Sclerotium rolfsii Sacc., могут быть использованы для получения природного фунгицида.
В связи с широкомасштабным использованием пестицидов, в том числе и фунгицидов, создающих угрозу загрязнения окружающей среды, здоровью человека и животных, а так же возрастающей резистентностью грибов к используемым фунгицидам, возникает необходимость поиска веществ с антифунгальной активностью для защиты растений среди природных соединений.
Результаты исследований антифунгальной активности ТГ, приведенные в литературе, показывают, что представители этого класса соединений, могут быть использованы в качестве эффективных экологически безопасных фунгицидных препаратов.
Параллельно с изучением действия ТГ на фитопатогенные грибы проводились исследования антимикотической активности гликозидов против дерматофитов, паразитирующих на коже человека и животных.
Противогрибковая активность установлена для эсцина (Aesculus hippocastanum), каулозидов А-Е (Caulophyllum robustum), суммы сапонинов из Eryngium planum, эуптелозидов А и В (Euptelia polyandra), суммы сапонинов из Polemonium caeruleum, суммы сапонинов из Primula acaulis, ямолозида из Phytolacca octandra, суммы сапонинов из Sanicuea europea, шивалина из Schima wallichii, холотоксинов А1, А, и В из Stichopus japonicus, стихопозидов A и В из Thelenota ananas и телотуринов A и В из Thelenota sp., сапонинов из Hedera helix. In vivo-тестах, проведенных на мышах, инфицированных Candida albicans, эффективность -хедерина была сравнима с медицинскими микотиками (100 мг/кг/10д) и после продолжительного лечения также бисдесмозида хедерасапонина С (100мг/кг/25д) соответствовала эффективности амфотерецина В (2,5 мг/кг/6д) и нистатина (2000000 IЕ/4д) (Bader, 1994).
Строение сильфиозида Е
Применение в народной медицине. S. perfoliatum, как и некоторые другие виды этого рода (S. laciniatum, S. integrifolium и S. compositum), издавна использовались коренными жителями Северной Америки в народной медицине (Fielder, 1975).
Индейские племена (Чероки, Чиппева и др.) применяли экстракты из листьев и цветков S. perfoliatum в качестве отхаркивающих, потогонных, диуретических средств при заболеваниях верхних дыхательных путей, почек, отвар из корней – как анальгезирующее, жаропонижающее, противоревматическое средство при болях в спине и ревматизме, как антигеморрагическое и кровоостанавливающее средства при легочных кровотечениях, открытых ранах (примочки, компрессы) (Felter, Lloyd, 1898; Densmore, 1928).
Крепкий настой из корней, получаемый путем длительного настаивания, использовался как одно из лучших средств при лихорадке, увеличении селезенки. Он был также полезен при внутренних кровоизлияниях, язве желудка, поражениях печени (Felter, Lloyd, 1898). Лечебные свойства корня сильфии связывают с наличием в нем смолы (с запахом скипидара), обладающей стимулирующим и спазмолитическим действием (Steinmetz, 1954). Известно применение индейцами (Месроки) настоя из корней сильфии как противорвотного средства при беременности, для предотвращения преждевременных родов (Smith, 1928). Корни сильфии применяли для окуривания при насморке, ревматизме, невралгии, корневища – в паровых банях (Gilmore, 1919). Некоторые индeйские племена (Ирокезы, Виннебаго) использовали растение в духовных ритуалах, перед охотой и в период воин для поднятия тонуса (Herrig, 1977; Moerman, 2003).
История британской гомеопатии хранит интересные сведения об использовании S. perfoliatum доктором Р.Т. Купером для лечения рака, о чем он сообщает в своей книге «Рак и симптомы рака» (Cazalеt, 1999). В современной гомеопатии сильфия используется для лечения различных форм астмы и хронического бронхита, а также катара мочевого пузыря, катаральной формы гриппа, дизентерии (Берике, 2000).
Детальное изучение медико-биологических свойств веществ, выделенных из сильфии, и препаратов на их основе открывает возможность использования этого растения в научной медицине.
Опыт выращивания сильфии как кормовой культуры и перспективы ее хозйственного использования. В XVIII веке S. perfoliatum вместе с несколькими видами этого рода были завезены в Европу, где получили широкое распространение как декоративные растения. В одичалом виде сильфия встречается по берегам и долинам рек Средней Европы (Hegi; 1906).
В России сильфиумы впервые появились в конце XIX века в Императорском ботаническом саду в Санкт-Петербурге. Там они неплохо прижились, что позволило известному в те времена ботанику Э. Регелю рекомендовать этот род для более активного использования. Однако в годы революции и гражданской войны идеи Э. Регеля были забыты. (Сильфиум. Энциклопедия …). Лишь в 1957 году по инициативе З.И. Грицака сильфия пронзеннолистная была введена в культуру с целью изучения ее кормовой ценности и сельскохозяйственного освоения.
Были установлены высокие кормовые качества сильфии и показаны некоторые приемы ее возделывания в условиях Западной Украины (Грицак, 1970). Впоследствии сильфию интродуцировали в Московской (Кошкин, 1976), Ленинградской (Медведев, 1971) областях и многих других регионах нашей страны и за рубежом. Результаты многочисленных работ по биологии, кормовым достоинствам, агротехнике сильфии обобщены в известных монографиях и справочниках (Вавилов, Кондратьев, 1975; Медведев, Сметанникова, 1981; Утеуш, 1991; Савин, Докукин, 2010).
Технология выращивания сильфии предусматривает ее размещение после озимых зерновых, озимого рапса и сурепицы, пропашных, черного пара. После уборки предшественника поле дискуют на глубину 8-10 см. До поздней осени почву обрабатывают по типу полупара.
Учитывая, что сильфия растет на одном месте много лет, почву необходимо удобрять. Под вспашку целесообразно внесение 40-60 т/га навоза, 60-90 кг/га фосфорных и 90-120 кг/га калийных удобрений. Вспышка проводится на глубину 25-27 см. При семенном размножении оптимальный срок сева – подзимний, за две недели до замерзания почвы. В этих посевах семена проходят естественную стратификацию, без которой невозможно получение дружных всходов весной.
При посеве семена заделывают на глубину 1-2 см. Для весеннего посева семена стратифицируют в течение 2 месяцев при температуре 0-2С.
Сеют сильфию широкорядным способом с междурядьями 70 см. Норма высева семян 12-15 кг/га.
В 1-й год проводят междурядные обработки. Начиная со 2-го года жизни, растения быстро растут, быстро смыкают междурядья, подавляют сорняки. Поэтому посевы всегда чистые от сорняков.
Сильфия выносит с урожаем много питательных веществ, поэтому растение отзывчиво на удобрения. Опыт показывает, что с внесением удобрений урожайность ее возрастает вдвое. Эффективны весенние и летние (после первого скашивания) подкормки азотными удобрениями в дозе 90-120 кг/га д.в.
Высокие урожаи отмечены также в районах, обеспеченных влагой, или при орошении.
Семена сильфии созревают неравномерно, поэтому их собирают выборочно вручную. Когда же большинство корзинок достигают восковой спелости, их срезают и досушивают на току, затем обмолачивают комбайном. Если в посевах 60-70% зрелых корзинок, семена собирают комбайном, переоборудованным под высокое срезание. После очистки семена подсушивают до влажности 14%. С каждого гектара собирают 500-650 кг кондиционных семян.
Антифунгальная активность in vitro тритерпеновых гликозидов и их суммарных препаратов
Рельеф опытного участка равнинный, почвенный покров представлен черноземом обыкновенным, карбонатным, среднемощным, малогумусным с содержанием гумуса не менее 4,1%. Метереологические условия в годы исследований существенно различались. В 1998 году погодные условия в зимний и ранневесенней период были благоприятными для роста и развития пшеницы, но в конце весны и в начале лета отмечалось повышение температуры до 35-40С при полном отсутствии осадков, что оказало отрицательное влияние на состояние посевов. 1999 год также характеризовался явлениями острой засухи в репродуктивный период развития озимой пшеницы.
Погодные условия 2000 и 2001 годов в целом были характерными для зоны неустойчивого увлажнения со сравнительно мягкой зимой и большим количеством осадков в первой половине лета.
Водный и температурный режим на озимом поле в 2003 году был наименее благоприятным. Наблюдалось позднее возобновление весенней вегетации. В связи с малым количеством осадков (сумма осадков за вегетационный период озимой пшеницы составила 349 мм) особенно в фазы колошения, цветения и налива зерна отмечались атмосферная и почвенная засухи. 2004 и 2005 годы по большинству метереологических показателей были близки к средним многолетним данным и были благоприятными для вегетации озимых. Сумма осадков за этот период составила соответственно 745 и 489 мм
Погодные условия в 2011-2013 годах также складывались неоднозначно. Если 2011 год можно считать благоприяным для формирования высокого урожая пшеницы благодаря значительному выпадению осадков и накоплению хороших запасов продуктивной влаги в почве, то 2012 год оказался крайне неблагоприятным. Из-за обильных дождей (149 % от нормы) осенью 2011 года посев был проведен не в оптимальный срок, а в конце октября. В связи с аномально низкими температурами в ноябре (-13-20С) осенняя вегетация растений практически сократилась на месяц. Зима была холоднее нормы на 0,8-6,2С. Минимальные температуры в феврале опускались до -27-30С. Весна оказалась поздней и резкое повышение температуры в апреле после холодного марта на фоне критического недобора осадков (45 % от нормы) вызвало быстрый расход влаги в почве (88-54 %). Возникла сильная засуха. Опытные посевы пшеницы в сложившихся условиях значительно пострадали.
Период сева под урожай 2013 года также сопровождался засухой, что несколько затормозило развитие пшеницы, но мягкая зима и достаточное выпадение осадков весной и в начале лета благоприятно сказались на состоянии растений и способствовали формированию хорошего урожая.
В первой серии опытов, проведенных в 1998-2001 гг., посевы размещали по разным предшественникам: озимой пшенице (монокультура) в 1998 г. и черному пару (1999-2001 гг.) на неудобренном агрофоне.
Агротехника возделывания культуры общепринятая для зоны неустойчивого увлажнения Ставропольского края. Для изучения действия Э был взят сорт озимой пшеницы Безостая 1 (Краснодарский НИИСХ им. П.П. Лукьяненко). Сорт пластичный, зимостойкий, засухоустойчивый, устойчив к болезням, обеспечивает высокое качество зерна (Беспалова и др., 2004). Посев осуществлен сеялкой рядовым способом с нормой высева 4,5 млн. всхожих семян/га. Площадь делянки 12 м2. Посевы обрабатывали водой (контроль) и 0,2 %-ным раствором Э. Эта концентрация Э наиболее эффективно стимулировала рост проростков у данного сорта в лабораторных опытах. Опрыскивание посевов проводили из расчета 500 л/га на VIII этапе органогенеза (э.о.) (фаза колошения). Повторность опытов 4-кратная. В опытах 2003-2005 гг. рострегулирующее действие Э изучали на сортах озимой пшеницы Дар Зернограда и Купава, отличающихся по морфофизиологическим признакам.
Сорт Дар Зернограда (ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко) – среднерослый высокоурожайный сорт полуинтенсивного типа, засухоустойчив, обладает способностью давать хорошие урожаи в годы с засушливой осенью и при поздних сроках сева. Формирует зерно с высоким содержанием белка и клейковины (Ковтун, 2003)
Сорт Купава (Краснодарский НИИСХ им. П.П. Лукьяненко) – среднерослый высокопродуктивный сорт с крупным колосом, отзывчив на удобрения. Сроки сева – оптимальные для зоны, в поздние сроки сеять не рекомендуется. По качеству зерна относится к ценной пшенице (Беспалова и др., 2004).
Посевы размещали по непаровым предшественникам – кукурузе на силос (2003-2004 гг.) и озимой пшеницы (2005 г.) на удобренном агрофоне. Удобрения вносили дробно в дозе N30Р60 (при посеве) + N30 (кущение) + N30 (колошение). Некорневую азотную подкормку карбамидом (мочевина) (NМ) на VIII э.о. (фаза колошения) совмещали с обработкой посевов Э, который использовали в виде 0,2%-ного водного раствора. Сравнение проводили с рострегулирующим препаратом Силк, который также использовали в виде водного раствора в рекомендуемой дозе 30 мл/га (Список пестицидов…, 2011). Посевы опрыскивали из расчета 500 л/га на VIII э.о.