Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Рапс как сельскохозяйственная культура 12
1.2 Амарант как сельскохозяйственная культура 14
1.3 Трансгенный рапс
1.3.1 Основные методы трансформации рапса 16
1.3.2 Сорта трансгенного рапса и их распространение 17
1.3.3 Перспективы генной инженерии рапса и возможные риски 18
1.3.4 Гены-регуляторы клеточного деления и роста клеток растяжением 23
1.4 Переопыление трансгенного рапса с родственными растениями рода Brassica 25
1.4.1 Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Brassica napus 25
1.4.2 Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Brassica rapa 27
1.4.3 Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Brassica oleracea 31
1.4.4 Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Brassica juncea 31
1.4.5 Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Brassica nigra 33
1.5 Переопыление трансгенного рапса с родственными растениями других родов семейства Brassicaceae 33
1.5.1 Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Raphanus raphanistrum 34
1.5.2 Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Hirschfeldia incana 36
1.5.3 Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Sinapis arvensis 37
1.5.4 Вероятность гибридизации ГМ-рапса с Erucastrum gallicum 38
1.6 Дикие родственники рапса на территории Республики Башкортостан 39
1.7 Заключение к обзору литературы 40
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1 Объекты исследования 43
2.2 Бактериальные штаммы и векторы . 44
2.3 Приготовление компетентных клеток бактерий 45
2.4 Трансформация бактерий 45
2.5 Выделение плазмидной ДНК 46
2.6 Выделение ДНК из бактерий методом кипячения 47
2.7 Агробактериальная трансформация семядольных черешков и гипокотилей рапса. 47
2.8 Агробактериальная трансформация методом погружения цветков 48
2.9 Селективный отбор трансгенных проростков
2.10 Совместное культивирование трансгенных и нетрансгенных растений 50
2.11 Морфологический анализ 51
2.12 Выделение растительной ДНК методом солевой экстракции 52
2.13 Выделение тотальной РНК рапса 53
2.14 Полимеразная цепная реакция 53
2.15 Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени 54
2.16 Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении ПЦР 55
2.17 Агарозный гель-электрофорез 56
2.18 Реактивы и материалы 56
2.19 Составы использованных стандартных растворов 57
Глава 3. Результаты и обсуждение 58
3.1 Выбор целевого гена для трансформации рапса на примере табака 58
3.1.1 Искусственное переопыление табака, сверхэкспрессирующего ген ARGOS-LIKE, с нетрансгенными родственными растениями и сравнительный морфологический анализ трансгенных гибридов
3.1.2 Искусственное переопыление табака, сверхэкспрессирующего ген ARGOS, с нетрансгенными родственными растениями и сравнительный морфологический анализ трансгенных гибридов
3.2 Создание трансгенных растений с увеличенным размером органов 62
3.2.1 Создание генно-инженерной конструкции с целевым геном ARGOS- LIKE
3.2.2 Агробактериальная трансформация семядольных черешков и гипокотилей рапса 64
3.2.3 Получение трансгенных растений рапса методом погружения цветков и их морфологический анализ 65
3.2.4 Получение трансгенных растений амаранта методом погружения цветков и их морфологический анализ 75
3.3 Совместное культивирование трансгенных растений рапса и нетрансгенных родственных растений на двух различных участках 81
3.3.1 Моделирование условий для выращивания исследуемых растений в разграниченных посевах
3.3.2 Моделирование условий для выращивания исследуемых растений в смешанных посевах
3.4.1 Поиск гибридных растений 85
3.4.2 Сравнительный морфологический анализ родительских растений и их гибридов 90 3.5 Оценка экологической безопасности использования трансгенного рапса с конститутивной экспрессией гена ARL в сельском хозяйстве
Заключение 113
Выводы 115
Список литературы
- Амарант как сельскохозяйственная культура
- Бактериальные штаммы и векторы
- Искусственное переопыление табака, сверхэкспрессирующего ген ARGOS-LIKE, с нетрансгенными родственными растениями и сравнительный морфологический анализ трансгенных гибридов
- Получение трансгенных растений амаранта методом погружения цветков и их морфологический анализ
Амарант как сельскохозяйственная культура
На сегодняшний день наиболее распространенным методом получения трансгенного рапса является агробактериальная трансформация семядольных черешков (Moloney et al., 1989; Князев и др., 2010) и гипокотилей (Cardoza et al., 2003; 2006). Хотя за более чем десять лет использования данного метода частоту трансформации удалось повысить до 25%, он остается довольно сложным и ресурсоемким из-за необходимости работы в культуре in vitro, в частности, регенерации побегов из недифференцированной ткани, поэтому при трансформации разных сортов рапса каждый раз приходится подбирать оптимальное сочетание фитогормонов.
Так, лучше всего отработаны методы трансформации рапса сорта Westar, который более не используется в производстве, успешность же трансформации других сортов существенно ниже, например, сорт Hanna удавалось трансформировать с успешностью 4,4% (Радчук, 2000) и 0,3% (Schroder, 1994) при селекции на канамицине и 1,8 % при использовании гигромицина в качестве селективного антибиотика (Князев, 2010). В качестве более экономичной и обеспечивающей большую производительность альтернативы был предложен метод погружения цветков рапса («floral dip») в агробактериальную суспензию, осуществляемый in vivo (Wang et al., 2003). Этот метод впервые был применен для получения трансгенного A. thaliana (Clough, Bent, 1998), а позднее стал использоваться и для других растений, в том числе и рапса. Несмотря на то, что первоначально достигнутая частота трансформации составила только 2-3% (Li et al., 2010), благодаря отсутствию необходимости манипуляций в культуре in vitro можно получать большое количество трансгенных растений в короткие сроки (Verma et al., 2008). Успешность трансформации других видов растений методом погружения цветков существенно различалась: от 0,2-1,8% для амаранта (Munusamy et al., 2013) и 2-3% для A. thaliana (Martinezrujillo et al., 2004) до 50-60% для льна (Bastaki, Cullis, 2014). Таким образом, изменение состава агробактериальной суспензии для погружения цветков может повысить эффективность метода, вплоть до уровня, достигаемого при трансформации семядольных черешков и гипокотилей.
К 2014 году трансгенные растения выращивались в 28 странах уже на 1,8 миллиардах га, а стоимость рынка ГМ-семян составила 15,6 миллиардов долларов США (James, 2014). В 2015 году под ГМ-культурами было занято несколько меньшая площадь - 179,7 миллионов гектар (James, 2015) Количество стран, возделывающих ГМ-растения, в период с 2011 по 2013 год сократилось с 29 до 27 (James, 2013). Рынок ГМ-растений, стоимость которого составляет 15,6 миллиардов долларов США, увеличивается в основном благодаря странам-лидерам по их производству: США, Бразилии, Аргентине, Индии и Канаде, на которые приходится 90% площадей, занятых под ГМ-культуры.
Четверть возделываемого в мире рапса представлена трансгенными сортами, притом в США и Канаде его доля превышает 90%. В 2014 году ГМ-рапс выращивался на 8 млн га в Канаде, 729 тыс га в США и 342 млн га в Австралии, а также в других странах (James, 2015). На данный момент лишь 7 из 38 одобренных к коммерческому возделыванию за рубежом сортов рапса имеют улучшенный состав (два сорта с повышенным содержанием лауриновой кислоты, пять сортов с улучшенной способностью связывать фосфор), тогда как 31 сорт отличается устойчивостью к гербицидам: глифосату и глюфосинату (ISAAA s GM Approval Database). Вероятно, это связано с тем, что все зарегистрированные сорта ГМ-рапса принадлежат крупным компаниям, производящим также средства защиты растений: 25 сортов создано компанией Bayer, 6 сортов — компанией Monsanto, 5 сортов — компанией BASF и два — компанией DuPont. Для сравнения, все 4 зарегистрированных сорта ГМ-папайи, устойчивые к вирусу кольцевой мозаики, были созданы в различных университетах.
Тем не менее, первыми зарегистрированными сортами рапса (одобрены к коммерческому возделыванию с 1994 г. в США и 1996 г. в Канаде) стали как раз сорта с повышенным содержанием лауриновой кислоты, созданные компанией Monsanto. С 1995 года в Канаде и США начинают возделываться устойчивые к гербицидам сорта под торговыми марками Roundup Ready, Liberty Link, InVigor, которые затем были одобрены к культивированию и в других странах: Японии, Австралии и Чили. Ввоз ГМ-рапса для употребления в пищевых и кормовых целях разрешен в Европе, Китае, Мексике, Новой Зеландии, Южной Корее, ЮАР, Тайване, Сингапуре и на Филиппинах. Новые сорта, впервые зарегистрированные в период с 2010 г., например, Optimum Gly и TruFlex, имеют признак устойчивости к глифосату, что говорит о том, что коммерческие биотехнологии в области генной инженерии рапса с 1994 года не получили существенного развития, так как продолжают создаваться сорта, устойчивые к гербицидам, тогда как сортов с новыми хозяйственно-ценными признаками не появляется.
Бактериальные штаммы и векторы
Процесс выделения плазмид осуществляли при помощи специального набора, предназначенного для выделения плазмидной ДНК из культуры E. coli (Цитокин, Россия). Для этого вначале в пробирке собирали бактериальную культуру, добавляли экстрагирующий буфер 1, а затем лизирующий буфер 2. На стадии лизиса происходит разрушение мембран бактериальных клеток, в условиях позволяющих сохранить плазмидную ДНК неповреждённой. Реакцию лизиса останавливали при помощи нейтрализующего буфера 3. Далее плазмидную ДНК сорбировали на силиконовом носителе спин-колонки, тогда как примеси (различной природы) отделялись отмыванием. На последней стадии плазмидную ДНК элюировали с носителя при помощи элюирующего буфера. Метод позволяет получить до 25 мкг плазмидной ДНК с одной спин-колонки из 1-10 мл культуры E. сoli.
Для быстрого выделения бактериальной ДНК с целью их дальнейшего ПЦР-анализа использовали 0,5% раствор тритона Х-100 с добавлением небольшого количества сорбента Chelex (Bio-Rad, США). Отбирали бактерии с чашки Петри в микропробирку, добавляли в зависимости от количества материала от 30 до 50 мкл 0.5%-ного раствора тритона-Х100 с добавлением неионного детергента Chelex (ионообменная смола Chelex удаляет ионы тяжёлых металлов и другие ингибиторы ПЦР). Далее бактериальную культуру взбалтывали так, чтобы материала не осталось на стенках пробирки и грели при 96С в течение 5 минут, после чего снова перемешивали и центрифугировали 5 минут при 14,5 тыс. об. мин. Надосадочную жидкость использовали в качестве матрицы при ПЦР.
Семена рапса стерилизовали в 70 % спирте в течение 1 мин, затем в 1% растворе гипохлорита натрия с добавлением нескольких капель Твин 20 в течение 20 мин. Простерилизованные семена не менее пяти раз промывали стерильной водой и проращивали на среде МС (Murashige et al., 1962) при температуре 25С и 16-часовом световом дне в климатической камере KBW 240 («Binder», Германия).
Для трансформации семядольных черешков и гипокотилей использовали трансформированные бактерии A. tumefaciens, предварительно выращенные в жидкой среде LB с добавлением рифампицина (100 мг/л) и канамицина (50 мг/л) при температуре 28 С на 150 об/мин. Для трансформации растений культуру агробактерий центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин и ресуспендировали в жидкой среде МС до концентрации 108 КОЭ/мл, контролируя ее плотность на спектрофотометре СФ-46 («ЛОМО», Россия).
Для трансформации использовали семядоли проростков рапса на 4-5 день после появления всходов, а также гипокотили. Экспланты выдерживали в суспензии A. tumefaciens 1-2 минуты, а затем помещали на регенерационную среду МС с 2% содержанием сахарозы и добавлением витаминов В5, инозитола (100 мг/л), поливинилпирролидона (0,5 г/л), MES в качестве буфера (0,5 г/л), гидролизата казеина (200 мг/л) и агарозы (8 г/л). Через 2 сут экспланты переносили на свежую среду того же состава и добавлением AgNO3 (5 мг/л) и цефотаксима (15 мг/л) для обеспечения гибели A. tumefaciens.
Для регенерации побегов был использован гормональный состав сред, подобранный для рапса сорта «Hanna»: 0,3 мг/л тидиазурона и 0,03 мг/л НУК (Князев и др., 2010). Использовалась также среда, содержащая 2 мг/л БАП и 1 мг/л зеатина, для сорта «Hanna» оказавшаяся неэффективной.
Через 20 сут культивирования появившиеся каллусы переносили на свежую селективную среду с добавлением гигромицина (5 мг/л), каждые 10-14 сут увеличивая содержание гигромицина в среде до конечной концентрации 15 мг/л. Дифференцирующиеся зеленые побеги отрезали и помещали на среду без селективного антибиотика, содержащую 0,5 мг/л ИМК для укоренения и антибиотик цефотаксим (15 мг/л).
Трансгенные растения рапса и амаранта получали методом погружения цветков (floral dip) (Clough, Bent, 1998). Рапс сеяли на грунт в теплице в начале мая. Амарант проращивали из семян при искусственном освещении в почвенном грунте в сосудах объемом 450 мл. Трансформацию осуществляли начиная с момента перехода к стадии бутонизации и до наступления периода интенсивного цветения. Агробактерии, содержащие целевую генно-инженерную конструкцию заранее проращивались в течение суток на среде LB при температуре 27С. Далее агробактерии центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин, выливали осветленную питательную среду и осадок ресуспендировали в растворе, содержащем 0,075 мкМ ацетосирингона (Sigma-Aldrich, США), 0,1% сильвета Gold (Chemtura, USA), 100 нг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП) и 30г/л сахарозы. Для трансформации амаранта концентрация реагента Silwet Gold была увеличена в 2 раза по сравнению с составом агробактериальной суспензии, использованной для рапса, так как соцветия амаранта содержат большое количество гидрофобных волосков. Основные изменения состава суспензии, предложенной Ли и др. (Li et al., 2010) в нашей работе коснулись концентрации ацетосирингона и 6-БАП.
Соцветия рапса с бутонами и молодыми цветками погружались в 50 мл емкость с суспензией на 1-2 минуты, затем оборачивались полиэтиленовой пленкой на сутки для предотвращения высыхания суспензии и для обеспечения более оптимальных для проникновения агробактерий условий. После созревания осуществлялся ручной сбор семян.
Искусственное переопыление табака, сверхэкспрессирующего ген ARGOS-LIKE, с нетрансгенными родственными растениями и сравнительный морфологический анализ трансгенных гибридов
Для оценки эффективности трансформации и визуального отбора проводили идентификацию целевого гена ARL и 35S промотора в проростках рапса методом ПЦР (рис. 4). Качество выделения ДНК проверялось путем ПЦР-анализа на наличие гена CBF капустных растений (100 пн) (рис. 4г).
Из проростков, выращенных в условиях климатокамеры трансгенными оказались 59 из 66 отобранных по цвету первых листьев растений сорта «Ратник» и 20 из 25 сорта «Hanna», таким образом, точность визуального отбора в таких условиях составила от 80% для сорта «Hanna» до 89% для сорта «Ратник» (рис. 4а, в). Из 24 отобранных для ПЦР-анализа растений сорта «Ратник», выращенных при естественном освещении, только 3 оказались трансгенными, таким образом, точность выявления составила 13% (рис. 4б), что делает обработку гигромицином неэффективной в данных условиях. В целом было проанализировано ДНК 115 растений, из них 24 были пророщены при естественном освещении и 91 в условиях климатокамеры. Из 100 семян, пророщенных в условиях климатокамеры, трансгенными оказывались в среднем 9 семян сорта «Ратник» при всхожести 74% и 12 семян сорта «Hanna» при всхожести 83%. Таким образом, эффективность метода погружения цветков составила в среднем 10%, что существенно превышает достигнутую нами эффективность трансформации семядольных черешков. Можно предполагать, что метод имеет значительный потенциал и для дальнейшего совершенствования: ранее на примере льна было показано, что эффективность трансформации может достигать 50-60% (Bastaki, Cullis, 2014). Различные модификации состава агробактериальной суспензии, вероятно, могут существенно повысить успешность трансформации рапса. Метод погружения цветков, видимо, подходит и для других видов растений, в частности, применялся для резуховидки Таля (Clough, 1998), хлопчатника (Zhang, Chen, 2012), амаранта (Munusamy et al., 2013) и др.
Оценка эффективности трансформации путем замачивания семян в растворе гигромицина имеет ряд преимуществ перед методами предварительного проращивания семян на селективной среде. Так при этом, например, снижается расход антибиотика, вовсе не требуется стерильных условий, питательных сред, пересадок. К тому же, здоровые растения рапса невозможно вырастить на чашках Петри, поэтому требуется специфическая посуда, большое количество селективной среды и пространства. В оригинальной методике предлагалось дифференцировать трансгенные и нетрансгенные проростки по длине гипокотилей при содержании гигромицина непосредственно в почве в концентрации 100 мг/л (Li et al., 2010), однако этот способ нами не применялся ввиду большого расхода гигромицина и невозможности использования метода в теплице при посадке в грунт без использования специальных емкостей. К тому же, освещенность оказывает значительное влияние на длину гипокотиля, что может сказаться на эффективности отбора.
Электрофореграмма результатов ПЦР-анализа отобранных визуально потенциально трансгенных растений рапса (слева - маркер молекулярного веса (Сибэнзим, Россия)): а - 35S промотора (450 пн) в растениях, выращенных в условиях искусственного освещения; б - гена ARL (386 пн) в растениях, выращенных в условиях естественного освещения; в – гена ARL (386 пн) в растениях, выращенных в условиях искусственного освещения, г – гена CBF (100 пн) Морфологический анализ
Отобранные трансгенные проростки сорта «Hanna» пересаживали в пятилитровые емкости и выращивали при искусственном освещении. Хотя растения этого сорта в таких условиях зацветали, они приобретали карликовые формы и образовывали мало семян. Добиться цветения рапса сорта «Ратник» в условиях искусственного освещения (5000 люкс) не удалось, поэтому для дальнейшего морфологического анализа трансгенные проростки этого сорта пересаживали в грунт во второй неделе мая и культивировали при естественном освещении. Сорт «Hanna» содержался полностью в лабораторных условиях, поэтому для морфологического анализа не использовался.
Для морфологического анализа были выбраны 30 трансгенных растений сорта «Ратник» с высоким уровнем содержания транскриптов гена ARL, подтвержденным методом полуколичественной ОТ-ПЦР. В качестве референсного использовали ген, кодирующий актин рапса (AF111812) (рис. 5а).
Получение трансгенных растений амаранта методом погружения цветков и их морфологический анализ
Поскольку капустные широко распространены на территории России, коммерческое возделывание сортов трансгенного рапса невозможно без оценки их экологической безопасности, в первую очередь заключающейся в исследовании переноса трансгенов к родственным растениям. Нет причин полагать, что увеличение размеров органов, обусловленное экспрессией трансгена ARL, выделенного из родственного растения A. thaliana может давать рапсу конкурентные преимущества. Тем не менее, даже при обратном скрещивании и в отсутствии селективного давления трансгены могут сохраняться у потомков гибридов в течение 5 лет (Darmency, Fleury, 2000; Chevre, 2007). С другой стороны, трансген может теряться в первом же поколении, в зависимости от сорта или популяции материнского растения (Halfhill, 2002). Подобные исследования никогда ранее не проводились на территории России, поэтому любые исследования отечественных сортов и популяций на предмет скрещивания с трансгенным рапсом высокоинформативны, в том числе, и в контексте мирового опыта. Несмотря на то, что каждый новый ГМ-сорт требует проведения новых исследований, анализ имеющихся данных поможет правильнее планировать новые эксперименты и принимать по их результатам взвешенное решение.
Было проведено сравнение полученных нами данных с информацией о частоте переопыления трансгенных и нетрансгенных растений рода Brassica, полученной зарубежными исследователями (табл. 5). Следует отметить, что коммерческое возделывание ГМ-рапса в США, Канаде и других странах до сих пор не приводило к значимым негативным экологическим последствиям, связанным с переопылением рапса со свободнорастущими или культурными родственными растениями (Kwit, 2011; Nicolia, 2014). В мире вероятность образования гибридов с рапсом варьирует в зависимости от региона, сорта ГМ-рапса, популяции дикорастущих родственных растений, а также погодных условий в пределах одной и той же страны, причём разные трансгены могут передаваться с неодинаковой частотой.
Имеет значение также способ постановки эксперимента. Значительная часть исследований переопыления рапса, особенно касающихся гибридизации с другими родами семейства капустных, проводилась в лабораторных условиях, а также теплицах, что повышает чистоту эксперимента, но не позволяет применять полученные данные для агроэкосистем, для которых вероятность переопыления чаще всего снижается, но может отличаться и в большую сторону (Halfhill, 2002; Shen et al., 2006). Исследования проводились в основном на территории США, Канады, Франции и Великобритании, тогда как ГМ-растения выращиваются в 28 странах (James, 2014), поэтому продолжение и расширение географии этих исследований представляет большой интерес.
По нашим данным, трансгенный рапс переопылялся с нетрансгенными представителями своего вида реже, чем в исследованиях, проведенных на территории Канады. Максимальная частота переопыления, наблюдаемая у сорта Heros, сравнима с результатами, полученными в США (0,67 и 0,7% соответственно). С другими же сортами переопыление происходило реже. Поскольку не было обнаружено ни одного гибрида трансгенного рапса с сортом Larissa, из всех исследованных сортов именно этот с наименьшими рисками можно высаживать в непосредственной близости от полученного нами трансгенного рапса. Дальнейшие исследования позволят выявить другие такие сорта, в том числе отечественной селекции.
Вероятность переопыления трансгенного рапса с B. rapa была ожидаемо выше, поскольку данный вид является облигатным перекрестным опылителем. Интересно, что наименьшее и наибольшее значения были получены для растений одной и той же популяции Калининского района г. Уфы, при этом наибольшее значение (14,58%) - в условиях смешанных посевов. С другой стороны, среди семян растений из популяции Кировского района, культивированных в условиях смешанных посевов, не было обнаружено ни одного трансгенного, в условиях разграниченных посевов трансгенных семян также было немного — 0,22%. Более низкая частота гибридизации B. rapa и рапса отмечалась только в исследованиях, проведенных на территории Великобритании.
Среди проростков B. juncea трансгенными были от 0,19 до 0,87% , при этом в условиях смешанных посевов, вне зависимости от расположения по сторонам света, вероятность переопыления была выше, чем в условиях разграниченных посевов. Самой высокой она была у растений, расположенных на большем расстоянии от трансгенгного рапса (в 1 м, а не 0,5 м), что может говорить о меньшей роли механического контакта в перекрестном опылении B. juncea. Также не было обнаружено гибридизации у дикорастущей популяции. Более низкая частота гибридизации с трансгенным рапсом отмечалась только у популяций Канады и Турции (табл. 5).