Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современные представления об особенностях сигнального обмена между бобовыми растениями и микроорганизмами при формировании cимбиотических отношений (обзор литературы) 15
1.1. Избирательность взаимодействия растений с микроорганизмами определяется способностью растений распознавать на молекулярном уровне отличительные особенности микроорганизмов 15
1.2. Сигнальный обмен между бобовыми растениями и микроорганизмами на ранних этапах формирования симбиотических отношений 18
1.2.1. Развитие азотфиксирующих клубеньков у бобовых растений является результатом тонкой координации процессов в эпидерме и коре корня бобовых растений 23
1.2.2. Гены, контролирующие развитие бобово-ризобиального симбиоза 26
1.2.3. Представители семейства LysM-рецепторных киназ необходимы для контроля взаимодействия растений с симбиотическими микроорганизмами
1.2.4. Комплексы LysM-рецепторных киназ могут быть вовлечены в контроль
ответных реакций бобовых растений на действие Nod-факторов 35
1.2.5. Роль внеклеточных доменов LysM-РПК в различении структурных особенностей Nod-факторов 41
1.2.6. Математическое моделирование взаимодействия LysM-РПК c Nod-факторами 42
1.2.7. Минимальные изменения в киназном домене LysM-рецептор-подобных киназ связаны с дивергенцией сигнальных путей, ведущих к развитию симбиоза и патогенеза 46
1.3. Характеристика компонентов «общего сигнального пути» у бобовых растений, активируемого Nod-факторами 48
1.3.1. Компоненты сигнального каскада, необходимые для развития инфекции и органогенеза клубеньков 53
1.3.2. Регуляция выхода бактерий из инфекционных нитей и развития симбиосом у бобовых растений 61
1.3.3. Гены, вовлеченные в контроль органогенеза клубеньков бобовых растений 65
1.4. Участие фитогормонов ауксинов и цитокининов в контроле органогенеза клубеньков бобовых растений 68
1.4.1. Особенности регуляции транспорта ауксинов у растений 69
1.4.2. Ключевые регуляторы биосинтеза цитокининов у растений 74
1.5. В регуляцию органогенеза клубеньков у бобовых растений может быть вовлечен комплекс регуляторов пролиферации и дифференцировки клеток 76
1.5.5. Участие транскрипционных факторов KNOX и WOX семейств в процессах морфогенеза у растений 81
Заключение 83
Глава 2. Методические подходы 87
2.1.Штаммы микроорганизмов 87
2.2. Растительный материал 87
2.3. Условия выращивания растений 87
2.4. Получение растительных экстрактов 88
2.5. Вестерн-блот-анализ 88
2.6. Трансформация бактерий 88
2.7. Выделение плазмидной ДНК 89
2.8. Выделение растительной ДНК 89
2.9. Количественный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени 90
2.10. Анализ взаимодействия белков при кратковременной экспрессии влистьях Nicothiana benthamiana 91
2.11. Клонирование фрагментов ДНК для синтеза внеклеточных доменов и полноразмерных рецепторов гороха 91
2.12. Анализ связывающей способности рецепторов с Nod-факторами 92
2.13. Конструирование векторов для эктопической экспрессии генов и РНК-интерференции 92
2.14. Трансформация растений с помощью Agrobacterium rhizogenes 93
2.15. Анализ активности репортерного белка бета-глюкуронидазы в трансгенных тканях растений 94
2.16. Выделение и анализ цитокининов 95
2.17. Статистические методы и компьютерные программы 95
Глава 3. Результаты и обсуждение.
Часть 1. Изучение сигнального обмена между горохом P. sativum L. и
клубеньковыми бактериями на начальных этапах развития симбиоза 96
1.1. Поиск молекулярных маркеров, экспрессия которых могла быть связана с активацией разных сигнальных путей у гороха при рецепции Nod-факторов
1.1.1. Анализ экспрессии генов ранних нодулинов PsEnod5 и PsEnod12a у симбиотических мутантов гороха 100
1.1.2. Анализ участия рецептор-подобных киназ Sym10 и Sym37 в активации сигнальных путей у гороха 106
1.2. Изучение биохимической функции рецептор-подобных киназ гороха Sym10 и Sym37, необходимых для развития симбиоза 110
1.2.1. Синтез внеклеточных доменов рецептор-подобных киназ Sym10 и Sym37 гороха в бактериальной системе и анализ связывающей способности с лигандом 110
1.2.1.1. Конструирование векторов, обеспечивающих внутриклеточный синтез белков-рецепторов Sym10 и Sym37 в бактериях E. coli 111
1.2.1.2. Оптимизация условий наработки рекомбинантных белков-рецепторов в штамме E. coli С41 113
1.2.1.3. Очистка рекомбинантных белков Sym10-ECD и Sym37-ECD методом металлохелатной аффинной хроматографии 114 1.2.1.4. Анализ связывающей способности внеклеточных доменов Sym10 ECD и Sym37-ECD, полученных при гетерологичной экспрессии в бактериях, с Nod-факторами 117
1.2.2. Синтез полноразмерных белков-рецепторов Sym10 и Sym37 в листьях N. benthamiana и анализ их связывающей способности с Nod-факторами 119
1.2.2.1. Изучение связывающей способности синтезированных в растениях полноразмерных рецепторов с Nod-факторами 122
1.3. Выявление новых кандидатов на роль рецепторов к Nod-факторам у гороха и оценка их способности контролировать развитие симбиоза 125
1.3.1. Компьютерное моделирование связывания LysM-РПК К1 c Nod-факторами Rh. leguminosarum bv. viciae NodRlv-IV, V, C18:4, Ac 125
1.3.2. Синтез внеклеточного домена рецептор-подобной киназы К1 в бактериях E. coli и анализ связывания с NodRlv-IV, V, C18:4, Ac 129
1.4. Фенотипический анализ мутантов по гену k1 у гороха 129
1.5.1 Анализ способности рецептор-подобных киназ гороха P. sativum L. формировать олигомерные комплексы при ко-экспрессии в листьях N. benthamiana 131
1.5.2. Изучение взаимодействия между рецепторами Sуm10, К1 и Sym37 при ко-экспрессии в листьях N. benthamiana 131
Заключение по части 1 137
Часть 2. Поиск у гороха потенциальных рецепторов к хитоолигосахаридам с разной степенью полимеризации, необходимых для развития симбиоза и активации защитных систем растения 139
2.1. Поиск и изучение потенциальных рецепторов к хитоолигосахаридам с разной степенью полимеризации у гороха P. sativum L. 140
2.2. Анализ участия рецепторной-киназы Lyk9 в контроле развития симбиоза с грибами арбускулярной микоризы 143
2.1. Анализ влияния рецепторной-киназы Lyk9 на развитие устойчивостигороха к фитопатогенным грибам 147
2.4. Получение хитоолигосахаридов с разной степенью полимеризации с помощью биологического синтеза 149
2.4.1. Конструирование векторов, обеспечивающих синтез хитоолигосахаридов (n = 5 и 6) в бактериях E. coli 150
2.4.2. Анализ биологической активности хитоолигосахаридов, полученных биосинтетическим способом 152
Заключение по части 2 154
Часть 3. Анализ взаимодействия компонентов сигнального каскада, активируемого Nod-факторами с фитогормонами и основными регуляторами пролиферации и дифференцировки клеток при симбиозе 155
3.1. Локализация ответа на цитокинины и ауксины у растений гороха с помощью цитокинин- и ауксин-регулируемых репортерных конструкций pRR4::GUS и DR5::GFP 159
3.2. Поиск у гороха генов первичного ответа на цитокинины (RR А- и B-типа), а также генов, контролирующих биосинтез цитокининов и их переход в активное состояние (IPT и LOG), экспрессия которых возрастает при развитии симбиоза 166
3.2.1. Выявление и анализ экспрессии генов гороха, активация которых происходит при рецепции растениями фитогормонов цитокининов(регуляторов «первичного ответа» гороха на цитокинин) 166
3.2.2. Выявление генов IPT и LOG, контролирующих биосинтез цитокининов и их переход в активное состояние у гороха 167
3.2.3. Анализ содержания различных форм цитокининов в корнях гороха при инокуляции Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM1026
3.3. Идентификация генов гороха, контролирующих биосинтез (TAR) и транспорт ауксинов (PIN) 175
3.4. Анализ взаимодействия между компонентами сигнального каскада, активируемого Nod-факторами, и регуляторами фитогормонального ответа178
3.4.1. Изучение влияния экзогенного цитокинина БАП на регуляторы цитокининового ответа и основные транскрипционные факторы сигнальногокаскада, активируемого Nod-факторами, у гороха 178
3.4.2. Сравнительный анализ экспрессии генов, контролирующих биосинтез/ активацию цитокининов и цитокининовый ответ у мутантов гороха 180
3.4.3. Локализация ответа на цитокинины и ауксины у мутантов SGEFix- -2, SGEFix- -5 (sym33) с помощью репортерных конструкций pRR4::GUS и DR5::GFP 184
Заключение по части 3 187
Часть 4. Изучение роли гомеодомен-содержащих транскрипционных факторов KNOX и WOX семейств в формировании клубеньков у гороха . 190
4.1 Изучение роли генов KNOX при развитии клубеньков у гороха P. sativum L. 193
4.1.1 Идентификация генов семейства KNOX, играющих существенную роль в контроле формирования клубеньков у гороха 193
4.1.2. Анализ влияния транскрипционного фактора KNOX3 на уровень экспрессии генов, контролирующих метаболизм цитокининов у гороха 196
4.2. Идентификация и анализ генов WOX у гороха, а также изучение их роли в процессе формирования симбиоза 200
4.2.1. Анализ экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньков у гороха 202
4.3. Локальный анализ экспрессии гена WOX5 при органогенезе клубеньков и изучение влияния ауксинов на экспрессию гена WOX5 204
4.4. Анализ влияния транскрипционного фактора WOX5 на регуляторы цитокининового ответа RR А-типа у гороха 206
Заключение по части 4 208
Часть 5. Изучение сигнального обмена при системном регулировании бобовыми растениями числа формирующихся клубеньков (авторегуляция симбиоза) 212
5.1. Изучение роли CLE-регуляторных пептидов в контроле органогенеза клубеньков у гороха 217
5.1.1. Идентификация CLE-пептидов у гороха, вовлеченных в систему авторегуляции симбиоза 217
5.1.2. Анализ экспрессии гена PsCLE13 у растений дикого типа и мутантов sym9 (CCaMK), sym33 (IPD3/CYCLOPS), sym7 (NSP2), sym35 (NIN),
кодирующих компоненты сигнального пути, активируемого Nod-факторами у гороха 218
5.2. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на развитие клубеньков у трансгенных растений гороха 219
5.3.1. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на
клубенькообразование гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов гороха с нарушением побеговой системы авторегуляции P88 (sym 29) и P64 (sym 28) 221
5.4. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на экспрессию генов, кодирующих рецептор Sym10 и транскрипционный фактор NIN, (компонент сигнального каскада, активируемый Nod-факторами) 223
5.5. Изучение взаимодействия гена WOX5 и компонентов системы CLAVATA при развитии клубеньков у гороха 224
5.5.1. Изучение экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньков у растений гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов 224
5.5.2. Анализ экспрессии WOX5 у супер-клубенькообразующих мутантов гороха 225
5.5.3. Анализ локализации экспрессии гена WOX5 у гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов sym29 и sym28 с нарушением системы CLV 226
Заключение по части 5 229
Заключение
- Представители семейства LysM-рецепторных киназ необходимы для контроля взаимодействия растений с симбиотическими микроорганизмами
- Вестерн-блот-анализ
- Анализ экспрессии генов ранних нодулинов PsEnod5 и PsEnod12a у симбиотических мутантов гороха
- Выявление генов IPT и LOG, контролирующих биосинтез цитокининов и их переход в активное состояние у гороха
Представители семейства LysM-рецепторных киназ необходимы для контроля взаимодействия растений с симбиотическими микроорганизмами
Как регулируется процесс выхода кальция из внутриклеточных депо и генерация Ca2+-волн в клетках бобовых растений остается не ясным, но он может быть сходен с тем, который наблюдается в клетках животных. В клетках животных активация рецепторов, сопряженных с G-белками, приводит к диссоциации тримерной молекулы G-белка на две функциональные субъединицы: aльфа-субъединицу, содержащую GTP, и бета, гамма-комплекс. Далее aльфа-субъединица взаимодействует с ферментами фосфолипазой С и фосфолипазой Д, которые гидролизуют находящийся в мембране фосфатидилинозитол с образованием диацилглицерола (ДАГ) и инозитол-1,4,5-трифосфата (IФ3). Появление этих вторичных мессенджеров приводит к связыванию с внутриклеточными рецепторами, находящимися на поверхности внутриклеточных депо кальция и, как следствие генерации периодических выбросов кальция - Ca2+-волн. Отдельные факты, подтверждающие эту гипотезу, были получены для бобовых растений. Так эксперименты с ингибиторами показали, что G-белок, фосфолипаза С и фосфолипаза Д могут быть вовлечены в активацию кальциевого сигнального каскада при симбиозе (den Hartog et al., 2001; D Haeze and Holsters, 2002). Вероятно, в процессе изменения внутриклеточной концентрации участвуют пока не идентифицированные регуляторы внутриклеточных депо кальция. Однако следующий компонент, который определяет изменения кальция уже в ядре, идентифицирован у бобовых растений. В формировании Ca2+ - волн в ядре клеток важную роль играет АТФ-регулируемая кальциевая помпа MCA8 (АТФаза SERCA-типа) (Capoen et al., 2011), локализованная в ядерной оболочке и калиевые каналы CASTOR и POLLUX у L. japonicas. Ортологом LjPOLLUX у M. truncatula является MtDMI1 (DOES NOT MAKE INFECTION 1) и PsSym8 у гороха (Catoira et al., 2000; Ane et al., 2004; Imaizumi-Anraku et al., 2005; Riely et al., 2007). Наличие участков связывания с другими белками (пролин-богатыми), позволяет рассматривать данные катионные каналы как составную часть многокомпонентного комплекса.
К развитию Ca2+ - волн также имеют отношение белки нуклеопорины, образующие ядерную пору и выявленные у L. japonicus. По аналогии с клетками животных в состав ядерной поры должны входить несколько белков. К настоящему времени выявлены несколько таких белков – NUP133 (Kanamori et al. 2006), NUP85 (Saito et al. 2007) и NENA (Groth et al. 2010) (рисунок 11). Мутации по генам Nup85, Nup133 и NENA блокируют изменения в концентрации внутриклеточного кальция, которые активируются при запуске Nod-фактор - зависимого сигнального каскада, тем самым демонстрируя, что эти белки играют важную роль в генерации кальциевого сигнала. Анализ транскриптома растений M. truncatula (ранние стадии после инокуляции), позволил также выявить существенное увеличение экспрессии генов MtNup85 и MtNup133, что подтверждает их участие и у данного бобового растения в передаче сигнала от Nod-факторов (Larrainzar et al., 2015).
Изменения в концентрации Са2+ в ядре активируют кальций, кальмодулин - зависимую протеинкиназу (CCaMK - calcium/ calmodulin – dependent protein kinase) (Levy et al., 2004; Mitra et al., 2004; Gleason et al., 2006). У Medicago этот белок кодируется геном MtDMI3 (DOES NOT MAKE INFECTION 3), ортолог этого гена найден и у гороха PsSym9 (Levy et al., 2004; Mitra et al., 2004; Tirichine et al., 2006). Известно, что CCaMK действует на развилке путей, ведущих к развитию бобово-ризобиального симбиоза и арбускулярной микоризы (Catoira et al., 2000; Parniske, 2004; Kistner et al., 2005). Активированная CCaMK фосфорилирует транскрипционный фактор CYCLOPS (рисунок 11). Ортологом гена LjCYCLOPS является MtIPD3 у Medicago, а у гороха – PsSym33 (Ovchinnikova et al., 2011). После этапа, контролируемого CYCLOPS, в сигнальный каскад вовлекаются компоненты, которые участвуют в дальнейшей передаче сигнала от Nod-фактора, но не относятся к «общему сигнальному пути». Вероятно, именно они осуществляют активацию транскрипции генов в ядре клеток растений, являющихся мишенями индуцированного Nod-фактором сигнального пути. У Lotus и Medicago, а позднее у гороха были клонированы и охарактеризованы гены NSP1 (NODULATION SIGNALING PATHWAY 1) и NSP2 (NODULATION SIGNALING PATHWAY 2), кодирующие транскрипционные факторы семейства GRAS, названного так после выявления первых трех представителей: GIBBERELLIC-ACID INSENSITIVE (GAI), REPRESSOR of GAI (RGA) and SCARECROW (SCR) (Kalo et al., 2005; Smit et al., 2005; Heckmann et al., 2006; Murakami et al., 2006; Dolgikh et al., 2011). Полномасштабный анализ транскрипционных изменений в экспрессии генов у растений при симбиозе показал, что активность NSP1 и NSP2 необходима для индукции экспрессии большинства симбиоз-специфичных генов (Mitra et al., 2004; Smit et al., 2005; Hirsh et al., 2009). Кроме того, CСaMK также активирует транскрипционный фактор ERN1 (ERF required for Nodulation), относящийся к классу ERF (Ethylene Responsive Element Binding Factor), который вовлечен в активацию экспрессии генов ранних нодулинов (Middleton et al., 2007; Andriankaja et al., 2007). NSP1 и NSP2 формируют гетеромерный комплекс, в котором NSP1 непосредственно связывается с ДНК, а NSP2 необходим для инициации сборки комплекса (Hirsch et al., 2009). В промоторе гена нодулина MtENOD11 найдена последовательность, с которой непосредственно связывается комплекс NSP1/ NSP2 (Hirsch et al., 2009), при этом дополнительный сайт связывания найден в промоторе этого гена для транскрипционного фактора ERN1 (Hirsch et al., 2009).
Среди генов, активируемых транскрипционными факторами NSP1 и NSP2, ген NIN (NODULE INCEPTION), который кодирует транскрипционный фактор и необходим для инициации и дальнейшего развития инфекции (формирования инфекционной нити в эпидерме) и органогенеза клубенька (Schauser et al., 1999; Borisov et al., 2003; Smit et al., 2005; Marsh et al., 2007; Oldroyd и Downie 2008). Детальный анализ мутантных растений по этому гену показал, что ген NIN не требуется для ранних этапов развития симбиоза, но может быть вовлечен в контроль инфекции и органогенеза клубеньков (Tirichine et al., 2006; Marsh et al., 2007).
Вестерн-блот-анализ
Симбионты гороха ризобии Rh. leguminosarum bv. viciae выделяют состоящие из 4-5 мономерных остатков Nod-факторы, содержащие ацетил на невосстанавливающем конце и жирную кислоту C18:4 и C18:1 - NodRlv - IV,V, Ac, C18:4, C18:1. Выполненные ранее исследования по изучению влияния на горох мутантных штаммов ризобий Rh. leguminosarum bv. viciae nodL, nodFEL-, nodO-, выделяющих измененные по структуре Nod-факторы (NodRlv - IV,V, C18:1), показали, что активация ранних симбиотических реакций (таких как, деформации корневых волосков, осцилляции Са2+) у этого бобового растения не зависит строго от структурных особенностей Nod-факторов. Напротив, рост инфекционных нитей и внутриклеточное распространение инфекции, а также формирование примордиев клубеньков – специфично по отношению к структуре заместителей на этих молекулах (наличию ацетила и жирной кислоты C18:4 на невосстанавливающем конце Nod-фактора) (Spaink et al., 1991; Walker and Downie, 2000). Сходная картина наблюдается у модельного растения люцерны слабоусеченной M. truncatula, также как и горох формирующего клубеньки недетерминированного типа. Эти представления нашли отражение в теории, согласно которой у люцерны, формирующей клубеньки недетерминированного типа, в связывание Nod-факторов могут быть вовлечены два типа рецепторов – «сигнальный» рецептор (от англ. signaling receptor), который работает на самых ранних этапах симбиоза, и рецептор «проникновения» (от англ. entry receptor), контролирующий развитие инфекции (Ardourel et al., 1994).
На основании анализа влияния на горох мутантных штаммов ризобий, можно предположить, что в связывание Nod-факторов у этого вида бобовых растений также вовлечены два разных по специфичности рецептора. Действительно, выявление у гороха двух LysM-РПК Sym10 и Sym37, а также данные о блокировании у мутантов по этим генам различных процессов при развитии симбиоза (начальных этапов развития симбиоза и инфекционного процесса), указывали на возможность участия в контроле развития симбиоза двух типов рецепторов. При этом наличие у Sym10 «нефункционального» киназного домена (Madsen et al., 2003) предполагает возможность взаимодействия с «дополнительной» рецепторной киназой. Это соответствует представлению о работе олигомерного рецепторного комплекса (сигнального рецепторного комплекса), а не отдельной рецепторной киназы. Действительно, анализ существующих в литературе данных о работе мембранных рецепторов позволяет сделать вывод о том, что активационный механизм работы таких рецепторов связан с формированием гомо- или гетероолигомерных комплексов белков, что приводит к активации киназных доменов и распространению сигнала (Antoln-Llovera et al., 2012; Miyata et al., 2014; Cao et al., 2015).
Такой дополнительной рецепторной киназой в комплексе с Sym10 маловероятно может быть Sym37. Изучение мутантов по гену sym37 ясно указывает на то, что ранние этапы развития симбиоза у них не блокируются, как у мутантов по гену sym10, что делает маловероятной возможность участия рецептор-подобной киназы Sym37 в инициации развития симбиоза (Madsen et al., 2003; Zhukov et L., 2008). С рецептором Sym37 может быть связана способность растений гороха различать структурные изменения в лиганде (то есть проявлять специфичность по отношению к структуре Nod-факторов), что делает его возможным кандидатом на роль «рецептора проникновения» (Li et al., 2011). Работает ли при этом рецептор Sym37 в виде гомоолигомера или образует комплекс с другой рецепторной киназой (формирует гетероолигомер) также остается неизвестным. Выполненные ранее генетические исследования показали, что белок, кодируемый геном
Sym2, определяет способность растений гороха различать разные по структуре Nod-факторы и контролирует развитие инфекции (Geurts et al., 1997). Следовательно, в состав рецепторного комплекса, контролирующего развитие инфекции, может также входить несколько белков. Это означает, что у гороха, вероятнее всего, два олигомерных рецепторных комплекса контролируют развитие начальных стадий и инфекционный процесс при симбиозе.
Однако экспериментальных данных (кроме характеристики двух мутантов по генам LysM-рецепторов), которые подтверждали бы возможность последовательной активации у гороха двух рецепторных комплексов при связывании Nod-факторов, до настоящего времени получено не было. Кроме того, поиск «дополнительных» новых рецепторов, которые работают на ранних этапах развития симбиоза в составе комплекса с Sym10, а также в комплексе с Sym37 при развитии инфекции представляет значительный интерес. В связи с этим, на первом этапе нашей работы необходимо было получить доказательства активации разных рецепторов/рецепторных комплексов и путей передачи сигнала при развитии симбиоза. С этой целью мы попытались найти маркеры, активация которых была бы связана с индукцией разных сигнальных путей при связывании Nod-факторов. Вместе с тем, актуальной задачей являлся поиск и характеристика у гороха ранее не известных рецепторных киназ, контролирующих рецепцию Nod-факторов в комплексе с уже известными «потенциальными рецепторами» - рецептор-подобными киназами Sym10 и Sym37. Наконец, необходимо было показать, что известные LysM-РПК Sym10 и Sym37 обладают способностью связывать Nod-факторы, то есть изучить биохимическую функцию этих рецепторов.
Анализ экспрессии генов ранних нодулинов PsEnod5 и PsEnod12a у симбиотических мутантов гороха
При клубенькообразовании у бобовых растений параллельно протекают события в разных типах тканей – эпидермисе (инициируется бактериальная инфекция) и коре корня (стимулируются деления клеток, что приводит к органогенезу клубенька). Генетический анализ показывает, что эти события взаимосвязаны, но контролируются разными наборами генов (Borisov et al., 2000; Tsyganov et al., 2002). В связи с тем, что Nod-факторы остаются связанными с клеточной стенкой клеток корневых волосков и не проникают в клетки коры корня (Goedhard et al., 2000), была предложена гипотеза «вторичного мобильного сигнала», который активируется в процессе передачи сигнала от Nod-факторов в клетках эпидермиса и передается в клетки коры (Oldroyd and Downie, 2008; Hirsch and Oldroyd, 2009). Роль таких мобильных сигналов могут выполнять гормоны, а также транскрипционные факторы, которые действуют не клеточно-автономным образом (могут перемещаться).
Важную роль в передаче сигнала от Nod-факторов после компонентов «общего сигнального пути» играют транскрипционные факторы: MtIPD3/LjCYCLOPS/ PsSym33, MtNSP1/LjNSP1/PsSym34, MtNSP2/LjNSP2/ PsSym7, MtNIN/LjNIN/PsSym35, MtNF-Y1(HAP2)/ LjNF-YA1 и MtNF-Y2/LjNF-Y2 (CAAT-бокс связывающие ТФ), MtERN1 и MtERN2 (Schauser et al., 1999; Kal et al., 2005; Smit et al., 2005; Andriankaja et al., 2007; Marsh et al., 2007; Middleton et al., 2007; Yano et al., 2008; Ovchinnikova et al., 2011; Soyano et al., 2013; Singh et al., 2014; Laloum et al., 2014). Необходимость этих регуляторов для контроля симбиоза была подтверждена на основании анализа мутантов растений по генам транскрипционных факторов, характеризующихся нарушением способности формировать клубеньки (Nod-фенотип), либо имеющих нефункциональные клубеньки (Fix- фенотип).
Долгое время доминировала точка зрения о том, что только комплекс транскрипционных факторов, активируемых в ходе передачи сигнала от Nod-факторов необходим и достаточен для контроля клубенькообразования. Однако были получены убедительные доказательства участия в контроле клубенькообразования и эндогенных регуляторных молекул самого растения – фитогормонов. На основании этого возникает вопрос, как взаимодействуют между собой компоненты сигнального пути, активируемые Nod-факторами и фитогормонами, а также каким образом осуществляется передача сигнала от Nod-фактора в клетки корня с участием фитогормонов.
Роль цитокининов и ауксинов в развитии симбиотических клубеньков Экспериментальные данные указывают на важную роль цитокининов и ауксинов в регуляции процесса формирования клубеньков, что было отмечено нами в главе «Обзор литературы» (Libbenga et al. 1973; Gonzalez Rizzo et al., 2006; Tirichine et al., 2007; Rightmyer and Long, 2011; Heckmann et al., 2011; Plet et al., 2011, Ferguson and Mathesius 2014). Наиболее важным доказательством участия цитокининов явилось получение мутантов cre1 и lhk1 с выключением функции генов MtCRE1 и LjHK1, кодирующих рецептор к цитокининам, у которых наблюдали значительное снижение количества формирующихся симбиотических клубеньков. Напротив, мутации, вызывающие спонтанную активацию рецептора к цитокининам MtCRE1/ LjLHK1 (доминантно позитивная мутация в гене рецептора), приводили к развитию клубенько-подобных структур (спонтанных клубеньков), формирующихся в отсутствии ризобий. При этом экспрессия активируемых цитокининами генов первичного ответа А-типа (type-A Response Regulators, RR A-типа) значительно возрастает при инокуляции, что указывает на то, что цитокининовый ответ является частью сигнального каскада, активируемого ризобиями (Gonzalez-Rizzo et al., 2006; Op den Camp et al., 2011; Plet et al., 2011). В соответствии с этим цитокинины активируют экспрессию генов, кодирующих транскрипционные регуляторы, такие как NSP1, NSP2, ERN1 и NIN (Plet et al., 2011).
Ранее мы отмечали, что важную роль в контроле клубенькообразования играют также и ауксины. При этом Nod-факторы оказывают влияние на баланс ауксинов в растении при клубенькообразовании, активируя ингибиторы ПАТ. Действительно, в ранних работах с использованием генетических конструкций, содержащих ауксин-регулируемые промоторы GH3::GUS, DR5::GUS, слитые с репортерными генами, было показано, что ауксины непосредственно влияют на закладку примордиев клубеньков у бобовых растений (Mathesius et al., 1998; Huo et al., 2006). При этом у бобовых, формирующих недетерминированные клубеньки (Trifolium repens, Medicago truncatula), нарушается ПАТ и ауксины накапливаются в месте инокуляции ризобиями. Результатом этого может являться перенаправление потока ауксинов в клетки эндодермы и паренхимы, что локально стимулирует пролиферацию клеток.
Причиной ингибирования ПАТ в месте инфекции может быть накопление флавоноидов, синтез которых активируется под влиянием Nod-факторов (Wasson et al., 2006; Mathesius, 2008). Вместе с тем, на транспорт ауксинов могут оказывать влияние цитокинины. Было показано, что экспрессия некоторых генов MtPIN, кодирующих белки-переносчики ауксинов, увеличена у мутантов cre1 М. truncatula, по сравнению с диким типом (Plet et al., 2011; Xiao et al., 2014). Это позволяет предположить, что цитокинины могут влиять на накопление ауксинов посредством подавления экспрессии генов PIN (Plet et al., 2011).
Выявление генов IPT и LOG, контролирующих биосинтез цитокининов и их переход в активное состояние у гороха
Наряду с механизмами локального контроля, в процесс формирования клубеньков у бобовых растений также вовлечены и системные механизмы (так называемая система авторегуляции клубенькообразования, AON – от англ. autoregulation of nodulation). Растениям необходимо регулировать численность клубеньков, в которых осуществляется азотфиксация, поскольку такой процесс является затратным по потреблению энергии. С помощью системы авторегуляции растение ингибирует дальнейшее формирование клубеньков на корнях после того, как уже появились первые клубеньки (Caetano-Anolles and Gresshoff, 1991). Ранее выполненные исследования показали, что в авторегуляцию у бобовых растений вовлечены несколько рецепторов с лейцин-богатыми повторами во внеклеточных доменах. Среди них CLAVATA1 (CLV1)-подобный и CLAVATA2 (CLV2) рецепторы, демонстрирующие высокий процент сходства с CLV1 и CLV2, работающими в апикальной меристеме побега (ПАМ) у арабидопсиса (Searle et al., 2003). Кроме того, в контроль процесса авторегуляции вовлечена рецептор-подобная киназа KLAVIER (KLV), имеющая достаточно высокий уровень гомологии с рецептор-подобной киназой RECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE 2/ TOADSTOOL 2 (RPK2/TOAD2) Arabidopsis (Oka-Kira et al., 2005; Kinoshita et al., 2010). Эти рецепторы были идентифицированы у ряда бобовых растений (люцерны слабоусеченной, лядвенца, гороха и сои) 212 MtSUNN/LjHAR1/PsSYM29/GmNARK (CLAVATA1), LjCLV2/PsSYM28 (CLAVATA2) и LjKLV (KLAVIER) (Krusell et al., 2002; Searle et al., 2003; Schnabel et al., 2005; Krusell et al., 2011). У арабидопсиса все гомологичные рецепторы CLV1, CLV2, RPK2/TOAD2 формируют различные гомо- и гетероолигомерные комплексы и необходимы для узнавания CLV3 регуляторного пептида, что активирует сигнальный путь, необходимый для поддержания популяции стволовых клеток в ПАМ (Oka-Kira and Kawaguchi, 2006; Bleckmann et al., 2010; Guo et al., 2010; Kinoshita et al., 2010; Miyazawa et al., 2010). Это позволяет предположить, что сигналом, узнаваемым системой рецепторов CLV и KLV у бобовых растений, могут также являться регуляторные пептиды.
У бобовых растений мутации в генах, кодирующих CLV1-подобный и CLV2 рецепторы, а также KLV, приводят к суперклубенькообразующему фенотипу. Эксперименты с прививками показали, что суперклубенькообразующий фенотип таких мутантов определяется побеговой частью растения (Miyazawa et al., 2010; Okamoto et al., 2013). Таким образом, CLV1-подобный и СLV2 рецепторы, а также KLV функционируют в побеге. В общем виде процесс авторегуляции сводится к обмену сигналами, которые действуют на расстоянии, то есть удаленно от места синтеза. Инокуляция растений ризобиями приводит к выработке сигнала в корне (RS, от англ. root signal), который поступает в побег, воспринимается там узнающими системами, что в свою очередь, способствует активации другого сигнала в побеге (SDI, от англ. shoot derived inhibitor), который поступает в корни и ингибирует дальнейшую закладку клубеньков (Oka-Kira and Kawaguchi, 2006; Sasaki et al., 2014). Какова же природа сигналов, выделяемых в корне (RS) и побеге (SDI)? Cигнальными молекулами, вырабатываемыми в корне (RS) и запускающими систему авторегуляции, могут являться CLE-пептиды (CLAVATA3/EMBRYO-SURROUNDING REGION (CLE)). У модельных бобовых растений (M. truncatula, L. japonicus) были выявлены гены MtCLE13, LjCLE-RS1, LjCLERS2, кодирующие CLE-пептиды, экспрессия которых специфично активируется при клубенькообразовании (Okamoto et al. 2009, Mortier et al. 2010). Вероятно, специфичные для клубеньков CLE-пептиды могут взаимодействовать с системой рецепторов в побеге. При этом остается неясным: перемещаются ли CLE-пептиды сами в побег, где связываются с регуляторными рецепторами или взаимодействуют с системой рецепторов, работающими в корне, что способствует выработке дополнительного сигнала, который перемещается в побег и там взаимодействует с рецепторами CLV и KLV.
Вместе с тем, у бобовых растений были выявлены мутанты rdn1, tml, plenty, суперклубенькообразующий фенотип которых определяется корневой частью растения (Schnabel et al., 2011; Novak et al., 2010, 2011; Magori et al., 2009; Yoshida et al., 2010; Takahara et al., 2013). У мутанта rdn1 M. truncatula (его гомологом у гороха является ген PsNOD3) нарушения связаны с белком, который может быть необходим для транспортировки сигнала между корнями и побегами (Schnabel et al., 2011; Novak et al., 2010, 2011). Мутация в другом гене tml у L. japonicus вызывает нарушения в F-бокс-содержащем транскрипционном факторе (Magori et al., 2009; Takahara et al., 2013), а ген, имеющий нарушения у мутанта plenty, еще не идентифицирован (Yoshida et al., 2010). Несмотря на то, что природа самого SDI сигнала остается неизвестной, наиболее вероятно оба компонента, дефектные у мутантов tml и plenty, работают на стадии передачи/ восприятия SDI сигнала уже от активированных рецепторов CLV1, CLV2 и KLV (Takahara et al., 2013). Наличие мутантов с нарушениями в работе как побеговой, так и корневой систем авторегуляции позволяет использовать их в качестве удобных моделей для изучения взаимодействия компонентов этой системы у бобовых растений.
Практически неизученными остаются процессы, которые активируются SDI сигналом при авторегуляции. Однако сходство с CLV3 сигнальным путем может указывать на то, что и мишени действия CLV системы могут быть похожими. В ПАМ взаимодействие между CLV3 и гомеодомен-содержащим транскрипционным фактором WUSCHEL (WUS) необходимо для поддержания пула стволовых клеток (Schoof et al., 2000). WUS работает в организующем центре ПАМ и необходим для поддержания пролиферации стволовых клеток (Mayer et al., 1998; Schoof et al., 2000). При этом взаимодействие между пептидом CLV3 и CLV1, CLV2 рецепторами негативно регулирует экспрессию WUS, тем самым ограничивая размер популяции стволовых клеток в ПАМ (Brand et al., 2000; Schoof et al., 2000). В апикальной меристеме корня (КАМ) функционирует сходная сигнальная система, в которую входит WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5 (WOX5), который синтезируется в покоящемся центре корня и регулирует баланс между пролиферацией и дифференцировкой клеток (Kamiya et al., 2003; Haecker et al., 2004). WUS и WOX5 функционально эквивалентны и могут быть вовлечены в сходные регуляторные пути, которые необходимы для поддержания активности и развития меристем (Sarkar et al., 2007). В частности, в КАМ регуляторный пептид CLE40, а также рецепторная киназа ARABIDOPSIS CRINKLY4 (ACR4) могут влиять на экспрессию гена WOX (Stahl and Simon, 2009). Ранее мы показали, что в процессе клубенькообразования у гороха может значительно увеличиваться экспрессия гена WOX5, представителя семейства WOX генов (часть 4 главы «Результаты и обсуждение»). Необходимо было выяснить, может ли представитель семейства WOX генов (ген WOX5) являться мишенью действия системы комплексов CLV и KLV при авторегуляции клубенькообразования.
В авторегуляцию могут быть вовлечены и гормоны. В частности, цитокинины регулируют экспрессию MtCLE13 у M. truncatula (Mortier et al., 2010). Более того, введение спонтанно активированного рецептора к цитокинину LjLHK1 в мутант har1 (нарушения в CLV1-подобном рецепторе) приводит к развитию большого числа спонтанных клубеньков (Takahara et al., 2013). Это указывает на то, что компоненты AON влияют на развитие клубеньков через подавление работы цитокининового рецептора LjLHK1 (Wopereis et al., 2000; Tirichine et al., 2007; Miyazawa et al., 2010). Было показано, что экспрессия генов CLE индуцируется в ответ на инокуляцию (Okamoto et al., 2009; Mortier et al., 2010). Однако такая активация отсутствует у мутантов по генам cre1 у M. truncatula, что указывает на то, что CLE-пептиды действуют на этапе после активации рецептора к цитокинину CRE1 (Mortier et al., 2012). При этом остается неизвестным, как зависит активация генов, кодирующих CLE-пептиды, от других компонентов сигнального каскада, активируемого Nod-факторами.
Для нас представляло интерес выяснить роль CLE-регуляторных пептидов в контроле органогенеза клубеньков у гороха, а также механизмы взаимодействия этих пептидов с другими регуляторными компонентами системы авторегуляции – рецепторами CLV и возможными мишенями действия этих регуляторных комплексов, контролирующими численность клубеньков при симбиозе.