Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Молекулярные механизмы формирования устойчивости растений к патогенам (обзор литературы) 12
1.1. Современная концепция взаимоотношений в системе «растение-хозяин -патоген» 12
1.2. Сигнальные молекулы в индукции защитных реакция растений
1.2.1. Салициловая кислота - медиатор НАДФН-оксигеназной сигнальной системы 14
1.2.2. Жасмоновая кислота - медиатор липоксигеназной сигнальной системы 16
1.2.3. Фитопростаноидные оксилипины - элиситоры растительного происхождения 17
1.2.4. Хитоолигосахариды - элиситоры грибного происхождения 19
1.2.5. Метаболиты бактерий как эффективные индукторы защитных реакций растений 20
1.2.6. Участие пероксида водорода в индукции защитного ответа растений 22
1.3. Защитные белки растений 24
1.3.1. Пероксидаза - фермент утилизации и генерации АФК 26
1.3.2. Оксалатоксидаза и кальциевый сигналинг 29
1.3.3. Хитиназа - поставщик экзогенных элиситоров 31
1.3.4. Ингибиторы протеиназ и замедление стресс-индуцированного протеолиза 33
Экспериментальная часть 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Объекты исследований 35
2.1.1. Характеристика возбудителей болезней 35
2.1.2. Обработка индукторами устойчивости 38
2.1.3. Условия проведения экспериментов 40
2.1.4. Фитопатологическая оценка развития патогенов 41
2.2. Методы биохимических исследований 42
2.2.1. Получение белковых экстрактов и измерение активности пероксидазы 42
2.2.2. Измерение активности оксалатоксидазы 42
2.2.3. Измерение концентрации перекиси водорода 43
2.3. Методы молекулярно-биологических исследований 43
2.3.1. Выделение растворимых белков для двумерного электрофореза 43
2.3.2. Количественное определение белка 43
2.3.3. Двумерное разделение растворимых белков 44
2.3.4. Выделение и очистка РНК из растений 45
2.3.5. Измерение концентрации РНК 45
2.3.6. Реакция от-ПЦР на основе матричной РНК и полуколичественный анализ
2.3.7. Полимеразная цепная реакция ДНК 46
2.3.8. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в ПНР 46
2.3.9. Электрофорез нуклеиновых кислот после ПНР в ПААГ и агарозе 47
2.4. Статистическая обработка результатов 48
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 49
3.1. Сигнальные молекулы в регуляции защитного ответа растений в системе «Triticum aestivum - Septoria nodorum» 49
3.1.1. Сравнительная оценка транскрипционной активности генов защитных белков в растениях пшеницы с различной устойчивостью к Septoria nodorum 49
3.1.2. Влияние салициловой и жасмоновой кислот на развитие S. nodorum
3.1.3. Изменение транскрипционной активности генов анионной пероксидазы ТС151917 и оксалатоксидазы AJ556991.1 под воздействием салициловой и жасмоновой кислот и инфицирования возбудителем септориоза 57
3.1.4. Использование 2DE для анализа изменений активности защитных белков в листьях пшеницы при обработке СК и ЖК и инфицировании S. nodorum 60
3.1.5. Влияние ХОС с различной степенью ацетилирования на генерацию Н202 и транскрипционную активность генов защитных белков в растениях пшеницы при инфицировании возбудителем септориоза 62
3.2. Сигнальные молекулы в регуляции защитного ответа растений в системе «Triticum aestivum Bipolaris sorokiniana» 71
3.2.1. Влияние ХОС с различной СА и инфицирования В. sorokiniana на содержание Н202 в корнях пшеницы 72
3.2.2. Влияние ХОС с различной СА на активность оксалатоксидазы в корнях пшеницы при инфицировании В. sorokiniana 73
3.2.3.Влияние ХОС с различной СА на активность пероксидазы в корнях пшеницы, инфицированной В. sorokiniana 75
3.2.4. Изменение транскрипционной активности гена хитиназы АВ029935.1 под воздействием обработки ХОС с различной СА 78
3.2.5. Изменение транскрипционной активности гена ингибитора протеиназы EU 2931
3.2.1 под воздействием обработки ХОС с различной СА 80
3.3. Сигнальные молекулы в регуляции защитного ответа в системе «Solanum tuberosum - Phytophthora infestans» 81
3.3.1. Влияние жасмоновой кислоты, оксилипинов и бактериальных липопептидов на устойчивость клубней картофеля к Phytophthora infestans 83
3.3.2. Влияние жасмоновой кислоты, оксилипинов и бактериальных липопептидов на содержание перекиси водорода в клубнях картофеля при инфицировании Phytophthora infestans 84 З.З.З.Распределение пула белков клубней S. tuberosum по молекулярной массе и изоэлектрической точке 85
3.3.4. Качественные и количественные различия протеома клубней S. tuberosum при обработке сигнальными молекулами и инфицировании P. infestans 87
Выводы 97
Список использованной литературы 99
- Фитопростаноидные оксилипины - элиситоры растительного происхождения
- Фитопатологическая оценка развития патогенов
- Сравнительная оценка транскрипционной активности генов защитных белков в растениях пшеницы с различной устойчивостью к Septoria nodorum
- Изменение транскрипционной активности гена хитиназы АВ029935.1 под воздействием обработки ХОС с различной СА
Введение к работе
Актуальность исследований. Болезни сельскохозяйственных растений, вызываемые микроскопическими грибами, наносят существенный ущерб урожаю и приводят к экономическим потерям. Одним из путей решения данной проблемы является выявление возможных механизмов индуцирования устойчивости растений к патогенам (Тютерев, 2002). В запуске защитных механизмов в ответ на внедрение патогена важным является восприятие растением сигнала о патогенной атаке и его распространение по тканям растения. Предполагается, что ответственными в этом являются мобильные сигнальные элементы, способные распространяться по тканям растения и последовательно формировать в них системную устойчивость к патогенам (Озерецовская и др., 2004). Системная устойчивость растений к болезням, являющаяся неспецифичной, основана на экспрессии множества защитных генов, и прежде всего, PR-белков (Navarrо et al., 2012; Welter et al., 2013; Duarte Sierra et al., 2015).
Можно выделить две формы индуцированный устойчивости: системная приобретенная устойчивость (systemic асquired resistаnсe – SАR) и индуцированная системная устойчивость (induсed systemiс resistаnсe – ISR) (Сhаndа et аl., 2011; Lunа et аl., 2012). Полагают, что при узнавании растением биотрофного патогена происходит синтез и высвобождение салициловой кислоты, которая приводит к экспрессии защитных белков и развитию SAR (Glazebrook, 2005; Тарчевский и др., 2010). При воздействии некротрофных патогенов, фитофагов и эндофитов происходит усиленный биосинтез жасмоновой кислоты и этилена, которые также регулируют экспрессию защитных генов и развитие ISR (Pieterse et al., 2014). Однако это разделение весьма условно и неокончательно, в последние годы появляются данные о наличии других возможных альтернативных ииндукторов и участников в процессах формирования устойчивости к патогенам (Сhаndа et аl., 2011).
Механизмы формирования защитного ответа под воздействием сигнальных молекул остаются до настоящего времени до конца не изученными, поскольку во многом зависят от характеристик обоих партнеров патосистемы. Подобные исследования являются важными в практическом отношении, учитывая широкое распространение грибных заболеваний в агробиоценозах.
Цель работы – выявить роль сигнальных молекул в регуляции активности PR-белков и формировании защитного ответа в растениях пшеницы и картофеля к возбудителям грибных болезней с различным типом трофности.
Задачи исследований:
– провести сравнительный анализ транскрипционной активности генов защитных белков пероксидазы TС151917, оксалатоксидазы АJ556991.1, ингибитора протеиназы EU293132.1 в растениях пшеницы с различной устойчивостью к возбудителю септориоза.
– изучить влияние салициловой и жасмоновой кислот на развитие гемибиотрофа Septoria nоdоrum на листьях пшеницы, генерацию в них Н2О2 и изменение транскрипционной активности генов защитных белков.
– изучить воздействие хитоолигосахаридов с различной степенью ацетилирования на содержание Н2О2 и транскрипционную активности генов PR-белков в здоровых и инфицированных Septoria nоdоrum растениях пшеницы.
– выявить особенности изменения транскрипционной активности генов пероксидазы TС151917, оксалатоксидазы АJ556991.1, ингибитора протеиназы EU293132, хитиназы АB029935.1 в корнях пшеницы при обработке хитоолигосахаридами с различной степенью ацетилирования и заражении некротрофом Bipolaris sоrоkiniаnа.
– исследовать накопление перекиси водорода и изменение экспрессии защитных белков картофеля под воздействием обработки различными сигнальными молекулами и инфицирования оомицетом Phytophthora infestаns.
Научная новизна. Впервые показано, что ХОС, СК и ЖК снижают степень развития возбудителя септориоза S. nоdоrum в результате стимулирующего действия на продукцию Н2О2 и на транскрипционную активность генов PR-белков. Выявлены различия в индуцирующем действии ХОС на транскрипционную активность генов пероксидазы TС151917, оксалатоксидазы АJ556991.1, ингибитора протеиназы EU293132, хитиназы АB029935.1 в растениях пшеницы при инфицировании S. nоdоrum и B. sоrоkiniаnа в зависимости от степени их ацетилирования. Получены приоритетные данные о связи устойчивости пшеницы к возбудителям грибных болезней с уровнем транскрипционной активности генов оксалатоксидазы АJ556991.1, анионной пероксидазы TС151917, ингибитора протеиназы EU293132.1 в инфицированных тканях. Показано, что обработка ЖК, оксилипинами, бактериальными липопептидами снижает степень развития оомицета P. infestаns на клубнях картофеля в результате изменения в дифференциальной экспрессии 39 полипептидов в диапазоне pH 6-7 и 7.5-8.7.
Практическая значимость работы. Результаты исследований могут быть использованы при создании новых экологически безопасных защитных препаратов, стимулирующих естественные механизмы устойчивости растений. Весьма перспективным в этом плане является использование для защиты продовольственных культур от возбудителей грибных болезней препаратов на основе сигнальных молекул, таких как ХОС, СК и ЖК, бактериальные липопептиды, приводящих к длительной активации генов PR-белков в растительных тканях. Научные положения исследований рекомендуется использовать в качестве учебного материала по дисциплинам: физиология и биохимия растений, фитопатология, защита растений.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на:
всероссийской научной конференции с международным участием
«Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва,
2013), VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013),
международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология –
наука XXI века (Пущино, 2013), всероссийской научной конференции
«Факторы устойчивости растений в экстремальных природных условиях и
техногенной среде» (Иркутск, 2013), I международном симпозиуме
«Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013), II
всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Саратов,
2014), 12-ой международной конференции «Современные перспективы в
исследовании хитина и хитозана» (Пермь, 2014), международной научной
конференции «Физиология растений – теоретическая основа инновационных
агро- и фитобиотехнологий» (Калининград, 2014), международной научно-
практической конференции молодых ученых «Проблемы и перспективы
исследований растительного мира» (Ялта, 2014), международной научной
конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов – 2014»
(Москва, 2014), VII Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Новосибирск,
2015), IX международном симпозиуме «Фенольные соединения:
фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2015), III международном микологическом форуме (Москва, 2015).
Конкурсная поддержка работы. Работа поддержана грантами ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 16.740.11.0061, ГК № П339); РФФИ_поволжье_а № 11-04-97037; МОН РФ № 14.604.21.0016 по приоритетному направлению «Науки о жизни».
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 24 работы, в том числе 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 251 источников. Диссертация содержит 2 таблицы и 27 рисунков.
Фитопростаноидные оксилипины - элиситоры растительного происхождения
Сацлициловая кислота (СК) - стрессовый метаболит, сочетающий свойства сигнального интермедиата и фитогормона (Boatwright, Pajerowska-Mukhtar, 2013; Asai et al., 2014; An, Мои, 2014). Салициловая (орто-гидроксибензойная) кислота представляет собой фенольное соединение. В очищенном виде СК впервые была выделена из растений Sаlix piriа в 1838 году. СК обнаруживается в листьях и репродуктивных органах большого числа различных культурных растений (Молодченкова, 2008).
Значительный интерес к СК определяется, прежде всего, ее участием в защитных реакциях растений при инфицировании патогенами. СК запускает в клетках синтез PR-белков, играющих в растениях защитную роль при патогенезе (Nagashima et al., 2014).
Растения отличаются по конститутивному количеству СК: растения табака, огурца и арабидопсиса содержат низкое количество СК, растения риса, сои, томата, картофеля - высокое. Однако, и те, и другие при внесении экзогенной СК показывают индуцирование устойчивости (Васюкова, Озерецковская, 2007).
Известно, что СК накапливается в тканях растения в ответ на инфицирование патогеном или обработку элиситором. Имеются данные, что СК принимает участие в функционировании НАДФ(Н)-оксидазной и NO-синтазной сигнальных систем, а также способна активировать липоксигеназную и МАР-киназную системы. Ряд исследователей классифицируют защитные механизмы растений как СК-зависимый и СК-независимый пути, которые функционируют в растительных тканях, взаимно влияя друг на друга и тем самым составляя комплексную сеть регуляторных взаимоотношений (Панина и др., 2005).
При биотических стрессах СК способствует увеличению содержания АФК в растительных клетках. Полагают, что один из основных механизмов данного действия является ингибированием каталазы (Saruhan et al, 2012), которую рассматривают как рецептор СК (Yan, Dong, 2014). Вследствие ингибирования каталазы повыщается концентрация перекиси водорода, которая передает сигнал к геному клетки для синтеза защитных белков (Gayatridevi et al, 2012). СК также может оказывать влияние на активность других ферментов, причастных к регулированию про-/антиоксидантного равновесия, в частности, НАДФН 16 оксидазы (Dubiella et al., 2013), пероксидазы (Mammarella et al, 2015), супероксиддисмутазы (Song et al., 2014).
Жасмоновая кислота (ЖК) является участником ответных реакций растений на стрессы биотической природы, такими как патогенные грибы и бактерии, а так же с повреждениями, вызываемыми насекомыми-фитофагами (Hyun, Lee, 2008; Лиу и др., 2008; Ладыженская, Кораблева, 2008; Озерецковская и др., 2009; Carvalhais et al, 2015).
Жасмоновая кислота и ее метиловый эфир - низкомолекулярные соединения оксилипиновой природы, образующиеся в результате ряда реакций из ненасыщенных жирных кислот при гидролизе мембранных фосфолипидов фосфолипазой А2. Эти соединения, объединяемые обычно под общим названием жасмонаты, обладают сходной биологической активностью и являются сигнальными молекулами, участвующими в регуляции всех этапов жизнедеятельности растения - от прорастания семян и клубней до созревания плодов и старения листьев. Кроме того, жасмонаты контролируют устойчивость растений к биотическим и абиотическим стрессам (Ладыженская, Кораблева, 2008).
ЖК играет важную роль в обеспечении устойчивости растений к абиотическим и биотическим стрессорам. Поранение индуцирует временное, но существенное увеличение содержания эндогенной ЖК с последующей активацией экспрессии защитных генов. Подобно поранению, экзогенная ЖК увеличивает накопление мРНК защитных генов. Поэтому предполагают, что ЖК выполняет сигнальную функцию в ответе растения на поранение (Лиу и др., 2008; Ладыженская, Кораблева, 2008).
Так, жасмонат и метилжасмонат обладают способностью усиливать экспрессию генов липоксигеназ и, как следствие, многие процессы окислительного метаболизма (Tejeda-Sartorius, 2007; Yan, 2013). Метилжасмонат может вызывать индукцию экспрессии генов десатуразы, катализирующей превращение линолевой кислоты в линоленовую (Kim et al., 2014), являющуюся одним из основных исходных соединений для синтеза жасмоновой кислоты. Промежуточные продукты окислительной деградации полиненасыщенных жирных кислот могут выполнять роль кальциевых ионофоров и активировать кальций зависимые процессы (Gigot et al, 2010).
На мутантах Аrаbidоpsis, отличающихся по способности реагировать на обработку ЖК и образовывать СК, было показано, что СК-зависимый и этилен-ЖК-зависимые сигнальные пути активируются по-разному. Оказалось, что этилен-ЖК-зависимые защитные реакции у растений активируются некротрофными патогенами, которые убивают растительные клетки для своего питания. Напротив, СК-зависимые защитные реакции индуцируются, в основном, патогенами-биотрофами, которые питаются живой растительной тканью. Это обстоятельство позволяет предполагать, что растения включают различные защитные реакции в зависимости от особенностей внедряющегося паразита. Повышенное накопление СК, обеспечивающее устойчивость растений к широкому кругу патогенов, может оказывать отрицательное действие на ЖК-зависимые сигнальные пути, ведущие к повышению устойчивости против насекомых и некротрофных патогенов.
Оксилипины представляют широкое семейство окисленных производных полиненасыщенных жирных кислот и выполняют регуляторную и сигнальную функции в организме животных, растений и грибов. Интерес к метаболизму жирных кислот в растениях в значительной степени связан с успехами в исследовании простагландинов и других оксигенированных Сго-полиеновых жирных кислот. Сигнально-регуляторные функции этих соединений в животных клетках изучены весьма подробно. Для растений более характерными оказались ненасыщенные жирные кислоты октадеканоидного ряда (Чечеткин и др., 2009). К настоящему времени в целом выяснен каскад реакций превращения Cig-жирных кислот, в результате которых образуется широкий спектр различных оксигенированных продуктов, в том числе, фитопростаноидные оксилипины. Однако механизмы активации экспрессии генов продуктами метаболизма Cig-жирных кислот в растительных клетках к настоящему времени известны лишь в общих чертах. Путь биосинтеза оксилипинов у растений включает несколько параллельных ветвей, по названию первого фермента соответствующей ветви различают путь алленоксидсинтазы, гидропероксидлиазы, дивинилэфирсинтазы, пероксигеназы, эпоксиалкогольсинтазы и другие, в которых образуются разнообразные метаболиты, обладающие высокой биологической активностью. Формирование оксилипинов может происходить и без участия ферментов, в результате действия свободных радикалов и активных форм кислорода. Спонтанно образующиеся оксилипины называются фитопростанами. Продукты первичного действия липоксигеназы - гидроперекиси жирных кислот - являются предшественниками таких важных биорегуляторов, как жасмоновая кислота в растениях и лейкотриены у млекопитающих.
Оксилипины не только являются сигнальными медиаторами при передаче преобразованной информации к геному клетки, но и выполняют ряд других функций (Гречкин, Тарчевский, 2000). Так, была показана роль оксилипинов как биорегуляторов, корректирующих действие фитогормонов при стрессе различной природы (Durand et al, 2009). Установлено влияние оксилипинов на синтез вторичных метаболитов (Leoffler et al, 2005). Отмечено, что оксилипны являются элиситорами и образуются в клетках растений в местах инфицирования, вызывая экспрессию защитных генов, синтез соответствующих белков, образование фитоалексинов и, в конечном итоге, способствуют формированию иммунитета растений к патогенам (Karg el al, 2007; Durand et al, 2009; Shimada, Hara-Nishimura, 2015).
Фитопатологическая оценка развития патогенов
Для измереная концентрации перекиси водорода использовали методику в применением красителя ксиленолового оранжевого (Bindschedler et al., 2001). Реагент содержал 0,074% соли Мора в 5,81% растворе серной кислоты и 0,009% раствор ксиленолового оранжевого в 1,82 % растворе сорбита (в соотношении 1:100). Для определения к 500 мкл реагента добавляли 50 мкл супернатанта образца, инкубировали при комнатной температуре 45 мин. Перед измерением образцы центрифугировали при 16000 об/мин в течение 5 мин, затем измеряли оптическую плотность образовавшегося комплекса на спектрофотометре Biospeck-Mini («Shimadzu», Япония) при длине волны 560 нм. Концентрацию Н202 определяли по предварительно построенной калибровочной кривой.
Растительный материал (листья пшеницы или часть клубня картофеля) растирали с жидким азотом и извлекали растворимые белки, используя сахарозный буфер и фенол в соответствие с рекомендациями (Vincent et al, 2006). Пробы центрифугировали 30 мин при 4400 об/мин. Для осаждения белка к супернатанту приливали ледяной раствор ацетата аммония в спирте в соотношении 1:4. Белки выдерживали 1 ч при -20С. Осажденный белок промывали три раза охлажденным спиртом и хранили при -70 С. Белок растворяли в буфере, содержавшем 8М мочевину, 2М тиомочевину, 1% CHAPS, 30 мМ ДТТ, 20 мМ трис основной, 0.3% раствор амфолитов, рН 3-Ю.
Для количественного определения белка к 20 мкл исследуемого образца приливали 1 мл реактива Брэдфорд (10 мг Кумасси G-250 в 5 мл этанола + 10 мл ортофосфорной кислоты и довести до 100 мо дистиллированной водой). Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре Biospeck-Mini («Shimadzu», Япония) при 595 нм через 5 мин, но не позднее 1 часа. Концентрацию белка определяли по калибровочному графику. Для построения калибровочной кривой использовали растворы бычьего сывороточного альбумина с известной концентрацией от 1 до 0,1 мг/мл.
Изоэлектрофокусирование белков проводили на приборе Protean IEF (“Biorad”, США). Для разделения белков в первом направлении (по изоэлектрической точке) использовали готовые 7-сантиметровые стрипы (“Biorad”, США), диапазон рН 3-Ю. Перед фокусированием проводили пассивную регидратацию в течение 12 часов при 20С. Фокусирование проводили при напряжении 4000 В (20000 Вч) в течение 22 часов, затем поддерживали напряжение 500 В до окончания процесса. После изоэлектрофокусирования стрипы выдерживали по 15 минут последовательно в растворах 2%-ного дитиотреитола и 2.5%-ного йодацетамида в буферных растворах с 25%-ным глицерином, затем промывали в 0.025М трис-глициновом буфере, рН 8.3.
Для разделения белков по молекулярной массе проводили SDS-электрофорез в 12%-ном ПААГ по Лэммли. Стрип и маркерные белки на фильтровальной бумаге помещали на полиакриламидный гель и проливали 1%-ной агарозой на трис-глициновом буферном растворе. Электрофорез вели при напряжении 90-120В с помощью источника питания “Эльф” (“ДНК-технология”, Россия) в камере для вертикального электрофореза (“Biorad”, США), гели стабилизировали в 50%-ном этаноле в течение 10 минут, затем окрашивали 0.1%-ным раствором Кумасси G-250 в течение 10 часов при комнатной температуре. Гели отмывали от красителя в растворе, содержащем 8% ледяной уксусной кислоты и 25% этанола. 2.3.4. Выделение и очистка РНК из растений
Для выделения РНК из растений использовали видоизмененный метод Chomezynski (1997). Для этого листья (корни) растений растирали в жидком азоте до гомогенного состояния. К полученному объему добавляли 1 мл тризола. Затем добавляли равное количество водонасыщенного (рН 5,0) фенола и хлороформа, интенсивно перемешивали на встряхивателе типа 358S («Elpan», Польша) и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 минут при 4С. Водную фазу переносили в чистую пробирку с равным объемом водонасыщенного фенола и хлороформа, вновь тщательно перемешивали и центрифугировали при тех же условиях. На последнем этапе выделения добавляли изопропанол и оставляли при -20С минимум на один час для формирования осадка РНК. Перед использованием РНК осаждали центрифугированием, промывали 70% этанолом и растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды, обработанной DEPC. Для более тщательной очистки от примесей ДНК осадок РНК осаждали 8М LiCl в течение ночи. Все процедуры с РНК проводили при 4С.
Сравнительная оценка транскрипционной активности генов защитных белков в растениях пшеницы с различной устойчивостью к Septoria nodorum
Как показали исследования, в ответ на инфицирование возбудителем септориоза через 24 ч после инокуляции S. nоdоrum происходит усиление экспрессии гена оксалатоксидазы (рисунок 12 - 2) и повышение активности фермента (рисунок 11 - 2). В последующем (через 48 и 72 ч после инокуляции) экспрессия гена оксалатоксидазы (рисунок 12 - II, III, 2) и, соответственно, активность фермента (рисунок 11 - II, III, 2) снижаются.
ХОС в зависимости от СА проявляли различное стимулирующее действие на экспрессию гена оксалатоксидазы, как в неинфицированных, так и инфицированных листьях (рисунок 12). Так под воздействием ХОС со СА 65% уровень экспрессии гена оксалатоксидазы и активность фермента превосходили аналогичный показатель инфицированных листьев пшеницы, обработанных ХОС со СА 30%, на протяжении всего опыта (рисунок 11, 12 - 4, 6). Причем, максимальные различия в индукции экспрессии гена оксалатоксидазы и активности фермента между ХОС со СА 65% и СА 30% наиболее контрастно проявлялись в неинфицированных растениях (рисунок 11, 12 - 3, 5).
Повышение активности оксалатоксидазы и усиление продукции перекиси водорода при обработке ХОС со СА 65% показано ранее при инфицировании каллусов пшеницы возбудителем твердой головни (Davoine et al., 2001). В настоящее время известно, что активные формы кислорода, в том числе, перекись водорода, являются важной составляющей ответных реакций на внедрение патогенов. Защитное действие Н202 обусловлено как прямым биоцидным действием на патоген, так и ее участием в сигнальных системах растительных клеток.
В связи с открытием сигнальной и защитной роли активных форм кислорода большое внимание уделяется оксидоредуктазам, регулирующим их уровень в клетке (Francoz et al, 2015). Среди них особый интерес представляют пероксидазы, активность которых коррелирует с развитием устойчивости растений к патогенам (Kawano et al., 2003). Показано, что анионная пероксидаза принимает непосредственное участие в синтезе лигнина, ограничивающего проникновение в ткани растения инфекционных структур гриба (Минибаева, Гордон, 2003). 16
Исследования показали, что в ответ на инфицирование S. nоdоrum происходит усиление тарнскрипционной активности гена анионной пероксидазы (рисунок 13 - 2), и повышается активность фермента (рисунок 13 - 2). Причем, ХОС со СА 30% оказывали незначительный стимулирующий эффект на экспрессию гена анионной пероксидазы в неинфицированных листьях пшеницы (рисунок 14 - 3). Однако при инфицировании S. nоdоrum стимулирующее действие ХОС со СА 30% заметно повышалось (рисунок 14 - 4), что положительно отражалось на активности фермента (рисунок 13 - 4). Так через 48 ч после инокуляции уровень экспрессии гена анионной пероксидазы превышал 400 350 300 250 200 150 100 контрольный вариант в 2 раза, а через 72 ч после инокуляции - в 2,5 раза (рисунок 14 - 4).
Индуцирующий эффект ХОС со СА 65% на экспрессию гена анионной пероксидазы оказался более значительным и продолжительным как в неинфицированных (рисунок 14 - 5), так и инфицированных листьях (рисунок 14 - 6). Так уже через 24 ч после инокуляции у пшеницы, обработанной ХОС со СА 65%, уровень экспрессии гена анионной пероксидазы превышал контрольный вариант в 2,6 раза и оставался высоким на протяжении 72 ч (рисунок 14 - 6), что отражалось на активности фермента (рисунок 13 - 6). Сходный эффект ХОС со СА 65% на активацию пероксидазы был обнаружен при инфицировании растений пшеницы возбудителем корневой гнили Bipоlаns sоrоhmаnа (Huckelboven, Kogel, 2003).
Таким образом, ХОС со СА 65% оказывают более значительное индуцирующее действие на экспрессию генов оксалатоксидазы и анионной пероксидазы по сравнению с ХОС со СА 30%. Возможно, более высокая чувствительность генов оксалатоксидазы и анионной пероксидазы к ХОС со СА 65% объясняется тем, что данные ферменты участвуют в регуляции уровня Н202 на самых ранних этапах инфекционного процесса. Оксалатоксидаза окисляет щавелевую кислоту и оксалаты с образованием перекиси водорода, которую пероксидаза использует в реакциях лигнификации. Учитывая, что хитин входит в состав клеточной стенки грибов, то в процессе его разрушения хитиназами, на начальных этапах патогенеза образуются хитиновые фрагменты с высокой степенью ацетилирования, которые вовлекаются в регуляцию активности ферментов метаболизма АФК. Такой механизм индукции защитного ответа ХОС мог сформироваться в процессе коэволюции системы «растение - грибной патоген».
Изменение транскрипционной активности гена хитиназы АВ029935.1 под воздействием обработки ХОС с различной СА
С точки зрения интересов человека, важным аспектом устойчивости растений является сохранение их продуктивности на фоне пагубного воздействия патогенов. Важным подходом к раскрытию механизмов, обеспечивающих устойчивость к патогенным микроорганизмам, может быть сравнение связанных с ними физиологических показателей у разных сортов пшеницы. Наряду с возможным выявлением механизмов, ответственных за формирование устойчивости к различным типам возбудителей болезней, с помощью этого подхода можно получить ответ на вопрос, имеющий важное практическое значение. В качестве показателей, имеющих отношение к защите растений от заражения, мы оценивали транскрипционную активность генов анионной пероксидазы, оксалатоксидазы, ингибитора протеиназы, хитиназы. Как известно, эти белки относят к связанным с патогенезом (PR proteins) (Passardi et al, 2004; Mazzeo et al, 2014; Naz et al, 2014).
В наших исследованиях выявлено, что устойчивые к септориозу сорта пшеницы показали в большей степени увеличение накопления транскриптов генов защитных белков: пероксидазы ТС151917, оксалатоксидазы AJ556991.1 и ингибитора протеиназы EU293132.1 в инфицированных тканях. Пероксидазам отводится важная роль в защитной реакции растительных клеток на инфицирование (Minibaeva et al, 2009). Благодаря своим свойствам и разнообразию молекулярных форм пероксидазы представляют собою одну из ключевых защитных систем, в том числе, за счет усиления процессов лигнификации (Mika et al., 2004). Неотъемлемой частью защитных реакций растений являются ингибиторы гидролитических ферментов. Защитная роль последних заключается в подавлении активности гидролитических ферментов экзогенного происхождения, включая ферменты патогенных грибов, бактерий, насекомых-вредителей (Конарев, 2002; Ибрагимов и др., 2010; Kalve et al, 2012).
Основной функцией оксалатоксидазы является участие в деградации щавелевой кислоты, которая является фактором патогенности большого числа возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, в том числе S. nodorum (Тарчевский, 2002). Образующаяся при этом Н202, как сигнальная молекула, может индуцировать развитие защитного ответа в растительных клетках.
Сигнальными молекулами, механизм защитного действия которых связан с индукцией генерации АФК в растительных тканях, являются салициловая и жасмоновая кислоты (Wang, Li, 2006; Ладыженская, Кораблева, 2008). Предполагается, что салицилатный сигналинг влияет на устойчивость к биотрофам, а жасмонатный сигналинг определяет развитие устойчивости к некротрофам (Stout et al, 1999; Straus et al, 2010).
В наших исследованиях обнаружено, что обработка семян СК и ЖК снижает степень развития гемибиотрофа S. nodorum на листьях пшеницы, оказывает стимулирующее действие на продукцию Н202 в зоне инфицирования и усиливает в инфицированных тканях экспрессию генов оксалатоксидазы AJ556991.1 и анионной пероксидазы ТС151917. Двумерныйэектрофорез растворимых белков инфицированных листьев выявил как сходство, так и различия изменений протеомов под воздействием СК и ЖК. Можно предположить, что формирование защитного ответа в растениях пшеницы к S. nodorum под воздействием СК и ЖК обусловлено генерацией Н202 и модуляцией экспрессии защитных белков.
Важное направление в защите растений - поиск экологически безопасных препаратов, действие которых основано на индукции естественных защитных механизмов растений. Показано, что эффективными элиситорами защитных реакций растений, являются производные хитина (Озерецковская и др., 2006; Alam et al, 2013). Определенную роль в проявления биологической активности хитина имеет степень его ацетилирования (Falcon et al, 2008; Santos et al, 2008).
Полученные в ходе экспериментов данные свидетельствуют, что ХОС могут повышать устойчивость растений пшеницы к инфицированию возбудителем септориоза S. nodorum, во-первых, за счет усиления экспрессии гена оксалатоксидазы, способствуя накоплению перекиси водорода в местах инфицирования, во-вторых, усиления процессов лигнификации в результате активации анионной пероксидазы (Herrero et al., 2013) и, в-третьих, индуцируя в растительных тканях активность ингибиторов протеиназ, что способствует снижению уровня повреждающего действия возбудителя септориоза. Причем, индуцирующий эффект на экспрессию генов защитных белков растений пшеницы при инфицировании S. nodorum зависит от степени ацетилирования хитоолигосахаридов.
Формирование защитного ответа к патогенам определяется не только их генотипом растения-хозяина, но, и в значительной степени зависит от особенностей патогена (Ramonell et al., 2002; Дьяков и др., 2012). В наших исследованиях показано, что формирование устойчивости растений пшеницы к некротрофу В. sorokimana под воздействием обработки ХОС обусловлено генерацией Н202 в результате усиления траскрипционной активности гена оксалатоксидазы, а также повышения транскрипционной активности генов хитиназы АВ029935.1 и ингибитора протеиназы EU293132.1, зависящей от СА биополимера. Полученные данные указывают на то, что для повышения устойчивости растений пшеницы к В. sorokiniana наиболее оптимально использовать смесь ХОС с различной СА.
В последние десятилетия активно изучаются функции оксилипинов -биологически активных молекул, образующихся в ходе окисления полиненасыщенных жирных кислот (Алаудинова, Миронов, 2009; Капустин и др., 2011). К настоящему времени в целом выяснен каскад реакций превращения Cig-жирных кислот, в результате которых образуется широкий спектр различных оксигенированных продуктов, в том числе, фитопростаноидные оксилипины (Чечеткин и др., 2009). Однако механизмы активации экспрессии генов продуктами метаболизма Сі8-жирньіх кислот в растительных клетках к настоящему времени известны лишь в общих чертах.
Большое значение в сигнальной регуляции устойчивости растений к патогенам отводят также непатогенным ризобактериям, регулирующим рост растений. Большинство из них запускают каскад защитных реакций в растительных тканях за счет выработки различных метаболитов (Тютерев, 2002; Павлюшин, 2005), индуцируя ISR (Vleesschauwer et al, 2008). Особый интерес, среди метаболитов бактерий рода Bacillus sp. представляют циклические низкомолекулярные липопептиды - сурфактин, итурин и фенгицин (Ongena et al, 2007). В частности, сурфактины запускают в растениях табака активную генерацию Н202 и ряд компонентов оксилипиновой сигнальной защитной системы, включая активность липоксигеназ (Cawoy et al, 2014).
В наших исследованиях обработка жасмоновой кислотой, оксилипинами, бактериальными липопептидами снижала степень развития возбудителя фитофтороза Phytophthora infestans на дисках картофеля, вызывала повышение в них концентрации перекиси водорода и изменения в суммарном спектре растворимых белков в диапазоне рН 6-7 и 7.5-8.7. Были выявлены различия в дифференциальной экспрессии 39 полипептидов под воздействием сигнальных молекул и инфицирования патогеном. Причем, максимальный защитный эффект от инфицирования клубней картофеля возбудителем фитофтороза был обусловлен индукцией в тканях защитных белков с Мм/р1 24/5.8; 75/6.45; 68/6.45; 19/6.5; 69/6.3 под воздействием ЖК.
Таким образом, наличие качественных и количественных изменений в экспрессии индивидуальных белков свидетельствует о дифференциальном механизме воздействия сигнальных молекул на защитный потенциал растительных клеток. Возможность искусственного регулирования содержания и активности защитных белковых молекул открывает принципиально новые подходы к поиску и созданию новых экологически безопасных защитных препаратов, стимулирующих естественные механизмы устойчивости растений.