Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Механизмы устойчивости растений к фитофагам 11
1.1.1 Феномен устойчивости растений к фитофагам 11
1.1.2 Биохимические основы индуцированных защитных реакций растений в ответ на повреждение фитофагами 21
1.2 Участие про-/антиоксидантной системы в защите растений от фитофагов 25
1.3 Фитогормоны в системной индуцированной устойчивости растений к фитофагам 33
1.4 Роль бактерий рода Bacillus в индукции устойчивости растений к фитофагам 43
Глава 2. Материалы и методы 49
2.1 Объекты исследований 49
2.2. Условия проведения экспериментов 51
2.3 Методы изучения типов устойчивости к тлям 51
2.3.1 Тест на антибиоз 51
2.3.2 Тест на афицидность штаммов 52
2.3.3 Тест на выносливость растений 52
2.4 Методы гистохимических исследований 53
2.4.1 Локализация Н2О2 с помощью ДАБ 53
2.4.2 Локализация оксалатоксидазы 53
2.4.3 Выявление автофлуоресценции лигнина 54
2.4.4. Выявление фенольных соединений 54
2.5 Биохимические методы исследований 54
2.5.1 Получение белковых экстрактов 54
2.5.2 Определение активности оксидоредуктаз 55
2.5.3 Изоэлектрофокусирование 56
2.5.4 Измерение уровня пероксида водорода 57
2.5.5 Измерение активности ингибиторов протеиназ 57
2.6 Молекулярно-биологические методы 58
2.6.1 Выделение и очистка РНК из растений 58
2.6.2 Реакция от-ПЦР и полуколичественный анализ экспрессии гена 59
2.6.3 Полимеразная цепная реакция ДНК 60
2.6.4 Электрофорез РНК в полиакриламидном геле 60
2.6.5 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 61
2.7 Статистическая обработка результатов 61
3. Результаты и их обсуждение 62
3.1 Устойчивость различных видов пшеницы к обыкновенной злаковой тле Schizaphis graminum Rond. 62
3.2 Роль изопероксидаз растений в становлении устойчивости пшеницы к обыкновенной злаковой тле Schizaphis graminum 71
3.3 Бактерии рода Bacillus в регуляции устойчивости пшеницы к обыкновенной злаковой тле Schizaphis graminum Rond. 75
3.4 Влияние бактерий Bacillus spp. на образование фенольных соединений и лигнина при развитии устойчивости мягкой яровой пшеницы к обыкновенной злаковой тле Schizaphis graminum 86
3.5 Роль СК- и ЖК-зависимых сигнальных путей в развитии устойчивости растений пшеницы к обыкновенной злаковой тле S.graminum, индуцированной бактериями Bacillus spp. 89
3.6 Рекомбинантный штамм Bacillus subtilis 26ДCryChS с инсектицидной активностью 95
Заключение 102
Выводы 105
Список литературы 107
- Феномен устойчивости растений к фитофагам
- Роль бактерий рода Bacillus в индукции устойчивости растений к фитофагам
- Роль изопероксидаз растений в становлении устойчивости пшеницы к обыкновенной злаковой тле Schizaphis graminum
- Рекомбинантный штамм Bacillus subtilis 26ДCryChS с инсектицидной активностью
Феномен устойчивости растений к фитофагам
Растения реагируют на атаку вредителей через сложную и динамичную систему защиты, включающую структурные барьеры, конститутивно и индуцированно синтезирующиеся токсичные химические вещества низкомолекулярной природы, индуцируемые белки и привлечение естественных врагов целевых вредителей (рис. 1.1) [War et al., 2012; War et al., 2018; Silvia et al., 2018]. В настоящее время выделяют две основные группы защитных реакций растений к вредителям, а именно прямую (direct defense), или внутреннюю (intrinsic), устойчивость и косвенную (indirect defense), или внешнюю (extrinsic), устойчивость, которые в свою очередь могут быть как конститутивными, так и индуцированными повреждением [Буров и др., 2012].
В связи с многообразием способов обитания вредителей на растениях и их использования в качестве пищевого ресурса могут возникать сложности в предсказании характера защитных реакций растений, индуцируемых ими. Так, если большинство листогрызущих вредителей питается на растениях не избирательно, то повреждения, наносимые тлями, белокрылками и трипсами, строго приурочены к определенным типам растительных тканей, чаще всего проводящих пучков [Шапиро и др., 1986; War et al., 2018]. Вместе с тем, и здесь обнаруживаются различия в характере наносимых повреждений. Например, питание имаго и личинок бахромчато- крылых (трипсов) или паутинными клещами [Blaazer et al., 2018] связано с высасыванием содержимого клеток паренхимы, вызывающим их лизис и гибель, существенно сближающее характер наносимых повреждений с результатом действия на растение ряда патогенов из группы некротрофов. В то же время, питание тлей и белокрылок обеспечивается путем использования жидкостей, присутствующих в проводящей системе растений. При этом характер повреждений, наносимых растению и этими флоэмососущими насекомыми, различается между собой и, отражается на Рис. 1.1 Механизмы индуцированной устойчивости растений к насекомым [War et al., 2012]. POD - пероксидаза; PPO - полифенолоксидаза; PAL - фенилаланинаммиаклиаза; TAL - тирозиналанинаммонийлаза; LOX-липоксигеназа; SOD - супероксиддисмутаза; APX - аскорбатпероксидаза; HIPVs (Herbivore induced plant volatiles) –летучие вещества продуцируемые растениями на воздействие насекомыми. характере защитных реакций растения [Шапиро и др., 1986].
Выявлено большое разнообразие ответных реакций растений на повреждения, вызываемые разными видами фитофагов, связаное с многообразием характера и типов наносимых повреждений и составом вводимых фитофагами в ткани повреждаемых растений метаболитов [Ali, Agrawal, 2012]. Вместе с тем, триггерами специфических защитных реакций растений, приводящих к биосинтезу de novo многообразных вторичных метаболитов с разными типами биологической активности против фитофагов, являются специфические сигнальные паттерны насекомых, ответственные за запуск каскадов определенных биохимических реакций, регулирующих в растениях, связанных с процессами запрограммированной гибели клеток, продукции патоген и инсекто-токсичных вторичных метаболитов, морфологическими перестройками, связанными с укреплением клеточных стенок растений и др. [Hahn, 1996; Silvia et al., 2018].
Существенно, что различные группы фитофагов, вызывающих разные типы повреждений, могут индуцировать появление разных типов молекулярных паттернов, запускающих в растениях защитные реакции как эндогенного (хозяйского), так и экзогенного (вредителя) происхождения [Ali, Agrawal, 2012; Simon et al., 2015; Tagar, Arora, 2017]. В частности, реакции растений в ответ на повреждения, вызываемые листогрызущими вредителями, как правило, имеют сходство с реакциями на простое механическое повреждение. В то же время фитофаги, вызывающие сравнительно незначительные механические повреждения определенных тканей (многие флоэмо- и ксилемососущие виды), индуцируют появление своеобразных наборов эндогенных молекулярных паттернов [Schilthuizen et al., 2016]. Так, реакции растений на повреждения, вызываемые тлями или белокрылками, имеют сходство с реакциями на заражение некоторыми патогенами и отличаются от таковых под воздействием листогрызущих насекомыми [Буров и др., 2012; Frstenberg-Hgg et al., 2013], что, впрочем, экспериментально доказано еще в конце 80-х гг. прошлого века [Шапиро и др., 1986].
Прямая устойчивость растений к вредителям характеризуется возникновением новых или резким усилением ранее существовавших (врожденных, т.е. конститутивных) защитных реакций, направленных непосредственно на фитофага, наносящего повреждение. Как правило, она может проявляться или в уменьшении степени заселяемости растения вредителями вплоть до полного их отказа от питания, или в увеличении их смертности и смертности их потомства, а также в снижении репродуктивного потенциала. К настоящему времени феномен формирования прямой устойчивости растений к фитофагам можно считать присущим всему растительному царству. Он продемонстрирован на растениях более 40 различных семейств и количественно оценен более чем на 100 экспериментальных моделях «растение-фитофаг» [Meijer et al., 2016]. Наиболее детальные работы в этом направлении осуществлены на таких моделях растение-вредитель, как «хлопчатник – паутинный клещ, Tetranychus urticae» [Omer et al., 2000], «томаты – совка Helicoverpa zea» [Stout et al., 1998], «виноградная лоза – клещи Eotetranichus willamette и T. pacificus» [English-Loeb et al., 1998], «табак – совка Heliothis virescens [De Moraes et. al., 2001], «пшеница – оранжевый комарик Sitodiplosis mossellana» [Ding et. al., 2000], «пшеница – злаковая тля Sitobion avenae» [Leszczynski, Dixon, 1990] и др. Удалось показать, что повреждения растений пшеницы злаковыми тлями (Homoptera, Aphididae) вызывают значительные изменения состава продуцируемых ими вторичных метаболитов, оказывающих, в свою очередь, отрицательное влияние на предпочитаемость тлями этих растений [Leszczynski, Dixon, 1990]. Аналогичные результаты получены на примере системы «томаты – виды белокрылок семейства Aleurodidae», включая Bemisia argentifolii и Trialeurodes vaporariorum [Van de Ven et al., 2002; Мокроусова, 2006].
Прямая защита включает в себя морфологические и биохимические компоненты устойчивости. Такие структурные особенности растений, как шипы, трихомы, восковой налет, толщина клеточной стенки образуют первый физический барьер для насекомых-вредителей. Вторичные метаболиты действуют как токсины, а также влияют на рост, развитие и пищеварительную систему насекомых, образуя тем самым следующий барьер и защиту растений от последующих атак вредителей [War et al., 2012].
Морфологические структуры. Первая линия защиты растений от насекомых-вредителей - это создание физического барьера либо путем образования восковой кутикулы, либо посредством развития шипов, щетинок и трихом. Такие морфологические структуры как шипы и колючки, трихомы (опушение), уплотнение и отвердение листьев (склерофиллы), включение гранул минералов в растительные ткани и др. играют ведущую роль в защите растений к фитофагам. Склерофиллы уменьшают повреждение за счет снижения вкусовых качеств и усвояемости листьев. Трихомы играют роль как физического, так и химического барьера в защите растений от многих насекомых-вредителей. Плотность трихома отрицательно влияет на яйцекладку, развитие личинок и питание насекомых-вредителей. Кроме того, плотные трихомы оказывают механическое воздействие и мешают движению насекомых и других членистоногих на поверхности растения, тем самым уменьшая их доступ к эпидермису листьев. Трихомы могут быть прямыми, спиральными, крючкообразными, разветвленными или неразветвленными и могут быть железистыми и нежелезистыми. Железистые трихомы могут выделять вторичные метаболиты, такие как флавоноиды, терпены и алкалоиды, являющиеся токсинами или репеллентами для насекомых, формируя, таким образом, комбинацию структурной и химической защиты.
Роль бактерий рода Bacillus в индукции устойчивости растений к фитофагам
Исследования последних лет показали, что микроорганизмы, связанные с растениями или насекомыми, играют важную роль в растительно-микробных взаимодействиях. Микробные сообщества, связанные с растениями, богаты разнообразием, и их структура значительно отличается между подземным и надземным уровнем. Микробные сообщества, связанные с вредителями вегетирующих растений, обычно имеют более низкое разнообразие и могут находиться в разных частях тела своих хозяев, включая бактериоциты, гемолимфу, кишечник и слюнные железы [Sugio et al., 2014; Сорокань и др., 2017].
Во всех агросистемах необходимым условием сбора высоких урожаев является объединенная защита посевов от болезней и вредителей, охватывающая селекционные, организационно-хозяйственные и агротехнические мероприятия, применение химических средств защиты растений (ХСЗР) и биопрепаратов. Мировая тенденция сокращения доз внесения агрохимикатов определяет возрастание необходимости использования в растениеводстве новых, вспомогательных зон минерального питания и биологических средств защиты растений.
Все большее внимание ученых в последнее время приковано к созданию биопрепаратов, основу которых составляют стимулирующие рост растений бактерии (СРРБ) (или PGPB от Plant Growth Promoting Bacteria), среди которых особый интерес вызывают эндофиты, формирующие с растениями прочные мутуалистические ассоциации [Максимов и др., 2018]. На данный момент из литературных источников известно, что защиту растений с подержкой СРРБ объединяют c: (1) их соперничеством с фитопатогенной микрофлорой за питательные вещества и соответствующую нишу для колонизации; (2) образованием ими различных метаболитов с антибиотической активностью; (3) синтезом гидролаз; (4) способностью запускать у растений СИУ и СПУ; (5) ингибированием развития эндосимбионтов вредителей и патогенов.
Активация СИУ в растениях под действием СРРБ. Отличительной особенностью СИУ, опосредованной СРРБ, служит отсутствие прямого запуска экспрессии PR-генов и формирования устойчивости по механизму прайминга [Conrath et al., 2006]. СИУ, вызываемая СРРБ, эффективна против грибов, оомицетов, вирусов и бактерий, и даже насекомых и травоядных животных. Иммуные ответы при развитии СИУ, опосредованной СРРБ, обуславливаются ранним и быстрым накоплением АФК. Штаммы B. subtilis AF1 и P. aeruginosa 7NSK2 запускали синтез ФАЛ в горохе [De Meyer et al., 1999]. Штаммы P. chlororaphis PA23 и B. subtilis BSCBE4 увеличивали активность ПО и ПФО, катализирующих финальные реакции биосинтеза лигнина в проростках перца, зараженных Pythium aphanidermatum [Nakkeeran et al., 2006]. При формировании СИУ, индуцированной СРРБ, возрастание АФК в растениях может отрицательно сказываться при формировании эффекта прайминга [Conrath et al., 2006].
СРРБ в защите растений от насекомых – вредителей. В растениях томата штамм B.subtilis BEB-DN индуцировал СИУ к табачной белокрылке Bemisia tabaci [Zhao et al., 2016], а штаммы B. subtilis EPCO 16 и EPCO 102 эффективно защищали растения от тлей в условиях теплицы. Эндофитные штаммы B. thuringiensis выделены из озимой пшеницы в Китае [Tao et al., 2014], из тканей вайи орляка (Pteridium aquilinum) [Seo et al., 2012]. Продуцирующие ауксин эндофитные штаммы В. thuringiensis обнаружены в листьях лекарственного растения Withania somnifera из Индии [Ali et al., 2014]. Из растений касcавы Manihot esculenta совместно со штаммом В. amyloliquefaciens P5, выделен штамм В. thuringiensis С3 [Monteiro et al., 2008]. Большинство исследований защитного действия СРРБ против насекомых затрагивает именно способность штаммов синтезировать инсектотоксичные Cry-белки. Не смотря на достаточное количество недавно опубликованных данных, в литературе мало информации об индукции СИУ бактериальными детерминантами у однодольных растений (зерновых культур).
B. subtilis. Данные бактерии синтезируют липопептиды трех семейств: фенгицины, сурфактины и итурины. К числу важных свойств этих соединений можно причислить способность понижать коэффициент поверхностного натяжения воды и создавать гели со сложно растворимыми гидрофобными веществами, повышая их усвояемость для корней растений, а также образовывать на поверхности корней и филоплана биопленки. Все это, с одной стороны, защищает бактериальные клетки от всевозможных внешних факторов среды, но с другой, - от патогенов. Выявлена их определенная антибиотическая избирательность. Так, сурфактины проявляют гемолитическую, антивирусную, антимикоплазную и антибактериальную, но не антигрибную активность, в отличие от фенгицинов и итуринов, строго проявляющих именно последнюю. Антагонизм с другими микроорганизмами циклические липопептиды проявляют благодаря в первую очередь своей способности связываться с липидным бислоем плазматической мембраны и менять проницаемость или разрушать его структуру, образуя в нем поры, как в случае фенгицина и итурина, или растворяя его, как в случае сурфактина [Ongena et al., 2010]. Кроме того, показано, что сурфактин и фенгицин, но не итурин, индуцировали в растениях СИУ против ряда патогенов [Ongena et al., 2010]. В культуре растительных клеток фенгицин индуцировал фенилпропаноидный метаболизм [Ongena et al., 2010; Falardeau et al., 2013], а сурфактин вызывал Са-зависимое подщелачивание среды и накопление АФК [Garca-Gutirrez et al., 2013]. Эти данные предполагают, что путь СПУ, запускающийся СК, также может быть вовлечен в механизмы индукции защитной системы, опосредованные циклическими липопептидами.
B. thuringiensis. Данная бактерия была впевые выделена в Германии немецким ученым Berliner в провинции Турингия [Berliner, 1915]. В 1902 г. в Японии без его участия была обнаруженна бактерия Bacillus sotto, являющаяся разновидностью B. thuringiensis. Изучение инсектицидной активности B. thuringiensis (его штаммов) в 20-х гг. XX-го столетия показало, что белковые кристаллы способны убивать насекомых-фитофагов. Эффективная инсектицидность исследованных штаммов еще в 30е годы позволила соэдать во Франции первый коммерческий продукт семейства Битоксибацилинов, названный “Sporene”. С этого времени учеными выделено из насекомых огромное количество патоваров данного вида бактерий [http://www.lifesci.sussex.ac.uk /home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2. html]. В 50е годы микробиолог Иркутского университета Е.В. Талалаев, исследуя бактериальные болезни сибирского шелкопряда, обнаружил штамм бациллы, названный впоследствии Bacillus dendrolimus. Основываясь на данном штамме в СССР разработан препарат дендробацилин, эффективно применяющийся для защиты лесов от насекомого-фитофага - сибирского шелкопряда [Заянчковский, 1966]. В 70-х годах прошлого столетия исследователь из Америки Dulmage из особей гусениц хлопковой моли Pectinophora gossypiella Saund., умерших во время природной эпиозотии, выделил штамм B. thuringinensis var. alesti HD-1, показавший почти 20-ти кратную эффективность, в сопоставлении с устаревшими биопрепаратами, что дало старт в 1983 г. для создания биопрепарата «Лепидоцид». Приблизительно в 1980 г. Gonzalez совместно с коллегами установил, что гены, кодирующие кристаллический протеин находятся в плазмидах и, применив их, Schnepf и Whiteley [1981] первыми сделали клонирование и исследовали гены, кодирующие данные белки у штамма B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1. Это помогло понять, что гены токсинов B. thuringiensis необходимо применять в генно-инженерных задачах и в наше время с применением генов токсинов исследованной бациллы постоянно делаются и внедряются в производственный процесс генно-модифицированные сорта растений устойчивые к насекомым-вредителям [Викторов и др., 2008].
Пептидные токсины бацил, синтезирующиеся во время споруляции, формируют параспоральные кристаллы [Durmaz et al., 2016]. -эндотоксины B.thuringiensis, обуславливающие инсектицидную активность бацилл, подразделяются на Cry- и Cyt белки. Все токсины подразделяют на четыре класса в соответствии с их инсектицидной активностью: CryI (для чешуекрылых), CryII (для чешуекрылых и двукрылых), CryIII (для жесткокрылых) и CryIV (для двукрылых).
Cry-токсины — это комплексы белков, собранные в А–В бинарные структуры. А-субъединица, оказывает токсичный эффект в клетке, образуя разветвленную пептидную структуру. В-субъединица – имеет два домена: транслокационный и рецептор-связывающий. Первый проводит А-субъединицу через липидный бислой. Второй осуществляет рецепторную и транспортную функции.
Препараты на основе B. thuringiensis var. kurstaki оказывают влияние на следующие поколения насекомых: изменяется также пропорция полов и понижается плодовитость самок. [Durmaz et al, 2016].
О влиянии бактерий B. thuringiensis на компоненты фитоиммунной системы известно мало, хотя в научной литературе, как показано выше, и фиксируются данные о способности ряда штаммов этого вида бактерий проникать в ткани растений и эндофитно сосуществовать в них [Rais et al., 2017]. Итак, современные данные говорят о том, что существуют штаммы бактерий, обладающие энтомоцидностью. Данное природное свойство способствоует дальнейшему составлению высокоэффективных композиций штаммов или их генно-инженерному усовершенствованию и использованию в производственной практике в качестве компонентов в высокоэффективных биопрепаратах.
Роль изопероксидаз растений в становлении устойчивости пшеницы к обыкновенной злаковой тле Schizaphis graminum
Окислительный взрыв при заражении тлями является характерной реакцией формирования устойчивости растений к вредителю, но тем не менее часто ведет к смерти клетки [Koch et. al., 2016]. Удаление чрезмерных количеств АФК и сохранение гомеостаза между утилизацией и генерацией АФК является отличительной чертой толерантных растений [Koch et. al., 2016]. Выяснено, что в них принимает участие ряд про-/антиоксидантных ферментов, среди которых присутствует ПО [War et. al., 2012]. Активирование апопластных ПО может играть основную роль в формировании устойчивости растений к тлям благодаря утилизации излишних количеств АФК посредством синтеза фенольных соединений и лигнина [War et. al., 2012; Koch et. al., 2016]. ПО индуцируются во многих растениях при атаке насекомыми и являются главным элементом непосредственной реакции растений на поранение, так как контролируют ряд процессов опосредовано или напрямую связанных с устойчивостью растений к насекомым-фитофагам [War et. al., 2012].
Пероксидазы III класса самые многочисленные ферменты растений, сосредоточенные в клеточной стенке, апопласте и вакуоли [Максимов и др. 2011]. По типу связывания с клеточной стенкой их делят на – свободно-растворимые, слабосвязанные и ионно или ковалентно связанные. Также ПО классифицируют по изоэлектрофоретической подвижности на анионные, катионные и нейтральные [Kukavica et. al. 2012]. Главной функцией ПО является защита растения от воздействия АФК, формирующегося при фотосинтезе и дыхании [Максимов и др. 2011]. Однако ПО способны принимать участие в процессах образования АФК, при этом они образуют токсичный супероксид радикал. В свою очередь отдельные апопластные ПО имеют НАДФН-оксидазную и ИУК-оксидазную активности [Максимов и др. 2011]. Физиологические роли ПО разнообразны и каждая из них имеет связь с отличительной изоформой фермента, тем не менее очень сложно установить точную функцию каждой изоформы in vivo [Kukavica et. al. 2012].
Анализ ИЭФ спектра ПО в свободнорастворимой фракции белка показал, что сорта пшеницы вида T. aestivum отличались от образцов T. timopheevii к-58666 и T. monococcum к-39471 как спектром анионных, так и катионных ПО (рис. 3.4) [Румянцев и др., 2018]. Так у образцов диких пшениц к-58666 и к-39471 отсутствовала изоПО с pI 4.8. Заселение растений тлями изменяло спектр ПО у всех образцов. Нейтральные изоПО с pI 6.8 и 7.1 проявляли активность только у образцов T. timopheevii к-58666 и T. monococcum к-39471 [Румянцев и др., 2018]. Заселение тлями устойчивых фенотипов (Омская 35, T. timopheevii к-58666 и T. monococcum к-39471) индуцировало активность анионной изоПО с pI 5.8 и ингибировало изоПО с pI 5.2 у образца T. monococcum к-39471 через 2-ое сут. инфицирования (рис. 3.4) [Румянцев и др., 2018].
У сорта Жница в то же время инфицирования наблюдали активацию изоПО с pI 5.2 и ингибирование активности изопероксидазы с pI 5.8, т.е. реакцию противоположную устойчивому образцу к-39471 (рис. 3.4). Интересно, что через 6 сут. после заселения тлей изоПО с pI 5.2 показывала наибольшую активность у устойчивого образца T. monococcum к-39471. Генерация Н2О2 менялась обратно пропорционально индукции данной изоПО с pI 5.2 (рис. 3.1, рис. 3.4). Также необходимо отметить смену в активности двух катионных изоПО с pI 9.0 и 9.6 [Румянцев и др., 2018]. Устойчивые фенотипы отличались увеличением, а восприимчивые понижением активности изоПО с pI 9.6 через 1 и 2 сут. после заселения тлей. В этот же период инфицирования активность изоПО с pI 9.0 понижалась у устойчивых и возрасталп у восприимчивых фенотипов. Следовательно, активация генерации Н2О2 у устойчивых фенотипов коррелировало с активацикй изоПО с pI 5.8, 6.8, 7.1 и 9.6. У восприимчивых фенотипов активировались изоПО с pI 5.2, 9.0 и ингибировались изоПО с pI 5.8, 6.8, 7.1 и 9.6 [Румянцев и др., 2018]. Наши данные согласуются с данными литературы о том, что анионные ПО способны утилизировать АФК и принимают участие в синтезе лигнина и суберина, а катионные ПО участвуют в продукции Н2О2 и обладают НАДФН-оксидазной активностью [Kukavica et. al. 2012].
Следовательно, показано, что толерантные растения характеризовались повышенным уровнем Н2О2 на начальном этапе инфицирования. Далее уровень АФК снижался, скорее всего, за счет активации ПО и усиления синтеза фенольных соединений и лигнина. Судя по изменению профиля пероксида водорода в инфицированных растениях (рис. 3.1) наиболее вероятно, что нейтральные изоПО с pI 6.8 и pI 7.1, а также катионная изоПО с pI 9.6 могли генерировать АФК, а анионная изоПО с pI 5.2 – утилизировать [Румянцев и др., 2018].
Рекомбинантный штамм Bacillus subtilis 26ДCryChS с инсектицидной активностью
Среди биоинсектицидов известны препараты на основе бактерий B.thuringiensis, синтезирующие белковые -токсины [Бурцева и др., 2001; Roh, 2007], что позволяет использовать их как основу для создания эффективных и экологически безопасных СЗР от вредителей. На рынке они представлены не менее 100 наименованиями и составляют 5-8% от общего объема средств защиты растений или 80% от всех микробных биопестицидов [Jouzani et al., 2017; Damalas et al, 2018]. Однако использование биопрепаратов на основе В.thuringiensis сдерживается в связи с их неспособностью воздействовать на внутритканевых вредителей, быстрой инактивацией их действующего начала (снижение инсектицидной активности) под влиянием ультрафиолетового облучения [Sansinenea, 2012; Maghsoudi, Jalali, 2017]. Кроме того, ряд штаммов В.thuringiensis способны вызывать у людей и животных кишечные расстройства и/или аллергические реакции [Fernandes, 2016], что связывают с продукцией ими термостабильного экзотоксина [Roh et al., 2010].
Создание рекомбинантных микроорганизмов может являться современным и эффективным способом улучшения свойств целевых штаммов [Mahaffee et al., 1994; Дебабов, 2015]. Так, внедрение гена Btcry1Ab в геном ризосферной бактерии Pseudomonas fluorescens, способствовало защите растений кукурузы от подгрызающих совок Agrotis ipsilon [Obukowicz et al., 1986а], табака от гусениц табачного бражника Manduca sexto [Obukowicz et al., 1986б]. Интересны данные с внедрением BtcryIA(b) гена в геном гриба Trichoderma harzianum [Gao, Yang, 2004], ряд штаммов которого эндофитны [Ownley et al., 2010].
В нашей лаборатории создана и депонирована рекомбинантная линия B. subtilis 26ДCryChS (Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ОСХН РАН (ВКСМ) под номером RCAM04928) на основе эндофитного штамма B. subtilis 26Д и гена, кодирующего инсектотоксичный белок Сry1Ia, из штамма B. thuringiensis В-5351 (идентификационный номер в GenBank X62821.1). Рекомбинантная линия B. subtilis 26ДCryChS проявила инсектицидную активность по отношению к тле, сопоставимую с клетками бактериального штамма B. thuringiensis В-5351 (табл. 3.3). Тля не размножалась на отрезках листьев восприимчивого сорта Салават Юлаев, выдержанных в суспензии клеток линии B. subtilis 26ДCryChS и клеток штамма B. thuringiensis В-5351, в отличие от тли, кормившейся на отрезках листьев выдержанных в суспензии клеток B. subtilis 26Д (табл. 3.3). При опосредованном влиянии бактериальных штаммов (инокуляция семян) самый высокий защитный эффект против злаковой тли проявила линия B. subtilis 26ДCryChS (табл. 3.3).
При инокуляции семян клетками штамма B. thuringiensis В-5351 число тлей на одном растении пшеницы и коэффициент их размножения снижались незначительно (табл. 3.3).
Из полученных данных следует, что рекомбинантная линия B. subtilis 26ДCryChS, приобрела свойство инсектицидности по отношению к злаковой тле по сравнению с материнским штаммом B. subtilis 26Д. Важно и то, что свойство сдерживать размножение насекомых сохранялось на растениях, выросших из семян, обработанных линией B. subtilis 26ДCryChS, что в малой степени показано для донорного штамма B. thuringiensis В-5351 (табл. 3.3).
Штамм B. subtilis 26Д снижал коэффициент размножения популяции злаковой тли в условиях непосредственного кормления на отрезках листьев, поддерживающих рост на суспензионной бактериальной культуре. Интересно, что и при опосредованном использовании этого штамма, путем предпосевной обработки семян, также можно наблюдать снижение степени выживаемости целевых вредителей. Кроме того, мы наблюдали снижение степени их размножения, что можно объяснить тем, что штамм B. subtilis 26Д: а) негативно влиял на жизнедеятельность микросимбионтов вредителя, подобно тому, как наблюдали с эндосимбионтами колорадского жука [Sorokan et al., 2016]; б) синтезировал сурфактины [Лукьянцев, 2010], обладающие афицидностью [Yang et al., 2017]; в) индуцировал общие неспецифические защитные системы растений и формировал у них устойчивость к вредителю, подобно тому, как это происходило в растениях картофеля [Максимов и др., 2015].
Снижение жизнеспособности обыкновенной злаковой тли на растениях пшеницы, обработанных бактериями Bacillus spp., может быть связано как с выработкой ими сурфактинов и белков-инсектотоксинов, так и СИУ [Pieterse et al., 2014; Garcia-Cristobal et al., 2015]. Для оценки этого в растениях, предварительно обработанных бактериями Bacillus spp. и заселенных злаковой тлей S.graminum, анализировали транскрипционную активность генов Tapr1, TaChiI, Ta-PI и TaPrx, кодирующих, соответственно, белок PR-1 (маркер салицилатного сигнального пути), белок PR-3 (хитиназа), PR-6 (ИП, маркер развития жасмонатного сигнального ответа) и PR-9 (ПО).
Обработка растений изученными штаммами и рекомбинантной линией индуцировала СИУ, что подтверждается нашими результатами о накоплении транскриптов генов PR-белков (рис. 3.13). В растениях пшеницы, необработанных бактериями и заселенных злаковой тлей было обнаружено незначительное накопление мРНК гена TaChiI (рис. 3.13), являющегося «маркерным» геном сигнального пути ЖК [Бурханова и др., 2017], что говорит о формировании у растений ответа на заселение тлями. В растениях, обработанных клетками штамма B. subtilis 26Д, а затем заселенных насекомыми, наблюдали более чем двукратное накопление транскриптов гена Tapr1, предполагающее индуцирование СК-сигнального пути, в то время как бактерии B. thuringiensis В-5351 на экспрессию гена Tapr1 не влияли, но повышали накопление транскриптов генов TaChiI и TaPI – «маркеров» ЖК-сигнального пути (рис. 3.13). В растениях, обработанных клетками рекомбинантной линии B.subtilis26ДCryChS и заселенных тлей было обнаружено накопление транскриптов генов Tapr1, TaPI и TaChiI по сравнению с контролем, что говорит об индукции как СК- так и ЖК-сигнальных путей. Транскрипты гена TaPrx многократно накапливались в обработанных клетками бактерий B. subtilis 26Д, B. thuringiensis В-5351 и линией B.subtilis26ДCryChS и заселенных тлями растениях пшеницы, что говорит об индукции СИУ в таких растениях. О способности белка Сry1Ia запускать в растениях СИУ по ЖК-сигнальному пути говорят факты накопления транскриптов генов TaChiI и TaPI в растениях обработанных рекомбинантной линией B.subtilis26ДCryChS и заселенных злаковой тлей (рис. 3.13).
Ране показано, что ряд штаммов бактерии B. thuringiensis индуцируют в растениях пшеницы экспрессию несколько иных PR-белков, чем штамм B. subtilis 26Д [Бурханова и др., 2017], накопление которых, согласно литературным данным, регулируется по ЖК- сигнальному пути, ответственному за формирование СИУ против некротрофных патогенов и вредителей [Van der Ent et al., 2009; Pieterse et al., 2014]. То есть, бактерии B. thuringiensis кроме непосредственного инсектицидного эффекта, связанного с выработкой инсектотоксинов семейства Cry, обладают индуцирующим защитные системы растений свойством. Например, бактерия B. cereus штамма AR156, близкородственная бактерии B. thuringiensis, на плодах персика снижала развитие гнили, вызванную грибом Rhizopus stolonifer, через механизм праймирования СИУ [Niu et al., 2011, Wang et al., 2013, Niu et al., 2016].