Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Архитектура корня 9
1.1.1. Рост и развитие первичного корня при дефиците фосфора 11
1.1.2. Развитие боковых корней при низкой доступности фосфора 12
1.1.3. Роль корневых волосков в поглощении питательных веществ 14
1.1.4. Образование корневых кластеров в ответ на доступность фосфора 15
1.2. Внутриклеточный сигналинг при изменении доступности ресурсов 17
1.3. Доступность питательных веществ и воды и локальные гормональные сигналы 22
1.3.1. Цитокинины 22
1.3.2. АБК 24
1.3.3. Ауксины 25
1.4. Передача сигналов из органа в орган при дефиците элементов минерального питания и воды 26
1.4.1. Локальный и системный сигналинг 26
1.4.2. Питательные вещества и передача гидравлических сигналов из органа в орган 28
1.4.3. Гормональный дистанционный сигналинг 31
2. Экспериментальная часть 38
2.1. Материалы и методы 38
2.1. 1. Объекты исследовая 38
2.1.2. Методы исследования 39
2.1.2.1. Экзогенная обработка растений ванадатом натрия, карбонилцианид m-хлорфенил гидразоном и абсцизовой кислотой 39
2.1.2.2. Экстракция, очистка и концентрирование гормонов 40
2.1.2.3. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) 42
2.1.2.4. Метод иммуногистохимической локализации гормонов 43
2.1.2.5. Определение содержания фосфора 44
2.1.2.6. Статистическая обработка данных 45
3. Результаты исследований и их обсуждение 46
3.1. Влияние дефицита фосфора на рост и содержание гормонов у растений арабидопсиса 46
3.1.1. Показатели роста у растений арабидопсиса на бесфосфатной питательной среде 47
3.1.2. Воздействие недостатка фосфора на содержание ИУК, АБК и ЦК 48
3.1.3.Реакция растений на внесение ванадата натрия в питательный раствор 55
3.2. Регуляция ростового ответа у растений ячменя сорта Прерия при дефиците фосфора 60
3.2.1. Рост растений и содержание фосфора 60
3.2.2. Гормональная регуляция 65
3.2.3. Обработка растений ячменя сорта Прерия карбонилцианид м-хлорфенил гидразоном 71
3.3. Особенности ростовой реакции и гормональный сигналинг у растений ячменя сорта Steptoe и мутанта AZ34 77
3.3.1. Ростовой ответ на удаление фосфата из питательного раствора 77
3.3.2. Содержание и динамика АБК, ИУК и цитокининов 82
Заключение 94
Выводы 97
Список сокращений 98
Список литературы 99
- Внутриклеточный сигналинг при изменении доступности ресурсов
- Гормональный дистанционный сигналинг
- Рост растений и содержание фосфора
- Содержание и динамика АБК, ИУК и цитокининов
Внутриклеточный сигналинг при изменении доступности ресурсов
Фосфор. Ответы растений на дефицит фосфатов (неорганический фосфор (Pi)) в растениях включают регуляторные компоненты, транскрипция которых или активизируется, или подавляется низким содержанием Pi [Lei et al., 2011], а также регулируемые ими гены мишени (PSR –phosphate starvation response). Возвращение к норме уровня экспрессии генов PSRs при добавлении неорганического фосфора в среду является подтверждением их участия в реакции на дефицит фосфата [Yang and Finnegan, 2010]. На основании исследований гомологичности, ортологи IPS (индуцируемые при дефиците фосфора некодирующие РНК, которые участвуют в гомеостазе фосфора, например, в регуляции транспортеров фосфатов Pi) были обнаружены у арабидопсиса и у зерновых видов [Huang et al., 2011]. Изменения в экспрессии генов-мишений лежат в основе адаптивных реакций, облегчающих поглощение внешнего Pi, мобилизации внутренних и внешних резервов органического фосфора, ограничении его потребления и адаптации его рециркуляции [Lin et al., 2014].
Эта сложная регуляторная схема, вероятно, согласует многочисленные процессы, связанные с адаптацией растений на изменение в доступности фосфора.
Многочисленные регуляторные компоненты проявляют либо отрицательное (например, убиквитин-коньюгаза PHO2), либо положительное (например, фактор транскрипции WRKY75 и SPX1 белок) влияние на экспрессию генов, участвующих в ответе на дефицит фосфора [Yang, Finnegan, 2010]. Было обнаружено, что PHO2 является мишенью для микро РНК miR399, имеющим сайты-мишени для miR399 в 5 нетранслируемых участках его транскриптов [Yang, Finnegan, 2010]. MYB транскрипционный фактор PHR1 был первым молекулярным компонентом, необходимость которого была показана при ответе на дефицит фосфора. Изменения в экспрессии большинства регуляторных компонентов передачи сигналов о дефиците фосфора и их генов мишеней зависят от PHR1. SUMO E3 лигаза действует до PHR1 и обеспечивает механизм контроля, влияя как отрицательно, так и положительно на различные гены ответа на дефицит фосфора (PSRs) [Miura et al., 2005]. Более поздние данные показывают схожесть ответов на фосфор и азот. NLA (nitrogen limitation adaptation – ген, кодирующих убиквитин лигазу, участвующую в контроле ответов на нитратное голодание) вместе с PHO2 дестабилизируют фосфатный транспортер PHT14 с помощью связанного с убиквитином протеолиза и поддерживают белок на низком уровне, таким образом ограничивая поглощение фосфора и предотвращая дисбаланс между фосфором и азотом при дефиците азота [Park et al., 2014]. В связи с этим рассмотрим в следующем подразделе нитратный сигналинг.
Нитраты. Транскриптомный анализ показал быстрые изменения (в течение нескольких минут) в экспрессии генов в корне после введения раствора нитратов в корневую среду дефицитных по азоту растений [Krouk et al., 2010b]. Первичные нитратные ответы влекут за собой изменения в экспрессии генов ферментов, катализирующих восстановление нитрата и усвоение аминокислот, а также транспортеров нитратов, таких как NRT2 (высокоспецифичный транспортер) [Forde, 2002]. Эти первичные ответы нитратов были обнаружены у мутантов по нитратредуктазе, что говорит о прямой индукции реакции самими нитратами [Wang et al., 2004]. Функция рецепторов нитратов в настоящее время приписывается их транспортерам (так называемые трансцепторы, сочетающие функции рецептора и транспортера). При этом наиболее убедительные признаки функции трансцептора наблюдаются у низкоспецифичных транспортеров нитрата CHL1/NRT1 [Gojon et al., 2011].
Первоначальная активация экспрессии некоторых генов, участвующих в первичном нитратном ответе, в дальнейшем снижалась. Таким образом, уровень транскрипта NRT2.1 повышался после 30 минутного воздействия до 25mM KNO3 и достигал своего пика через 3 часа, а затем снижался до устойчивого уровня [Ho et al., 2009]. Применение ингибиторов усвоения азота (N) показали, что подавление экспрессии гена было опосредованно продуктами восстановления и дальнейшей метаболизации нитратов: аммонием, глутамином и другими аминокислотами [Zhuo et al., 1999]. Следовательно, эффект может быть охарактеризован как пример регуляции по принципу отрицательной обратной связи в результате накопления продуктов метаболизма нитратов. Последние сообщения указывают на участие факторов транскрипции LBD37/38/39 в негативной регуляции первичного ответа на нитрат [Rubin et al., 2009]. С другой стороны, фактор транскрипции NLP7 (охарактеризованный как «главный регулятор» нитрат-индуцированных ответов) и протеинкиназа CIPK8, взаимодействуя с кальцинейрин В-подобным белком (calcineurin B-like, CBL), может позитивно регулировать первичный нитратный ответ [Krapp et al., 2014].
Влияние недостатка нитратов менее изучено, по сравнению с повышением его концентрации в окружающей среде [De Jong et al., 2014]. У растений арабидопсиса экспрессия гена NRT2;1 устойчиво возрастала при недостатке нитратов, вероятно, из-за прекращения ингибирующего действия метаболитов азота по принципу отрицательной обратной связи [Lejay et al., 1999]. Интересно, что экспрессия генов транскрипционных факторов LBD37/38/39, подавляющих поглощение нитратов была крайне низкой в условиях дефицита азота [Rubin et al., 2009]. Кроме того, nlp7 мутанты имели фенотип, типичный для дефицитных по азоту растений, независимо от наличия азота, что свидетельствует о необходимости NLP7 для подавления реакций растений на недостаток азота [Castaings et al., 2011]. Таким образом, взаимодействие факторов, участвующих в реакции на азот [Kudoyarova et al., 2015], дает возможность достаточного поглощения нитрата и его метаболизма в зависимости от его уровня в среде корнеобитания.
Ген NLA (чувствительный к нехватке азота), кодирующий убиквитинлигазу, участвует в контроле ответов на дефицит азота [Peng et al., 2007]. У nla мутантов при старении не происходит ремобилизация азота, что говорит об участии NLA его реутилизации. Данные о контроле поглощения нитратов под влиянием гена NLA отсутствуют, хотя последние данные свидетельствуют об его участии в регуляции активности транспортеров фосфатов [Park et al., 2014].
Вода. Дефицит воды в почве снижает доступность питательных веществ и их последующее поглощение корнями [Hu, Schmidhalter, 2005] и может изменить распределение биомассы корневой системы в результате метаболических изменений в побегах. Это также препятствует транспорту углеводов к корням [Hermans et al., 2006] и распределению питательных веществ в побегах [Hnsch, Mendel, 2009]. С другой стороны, изменения в концентрации макро- и микроэлементов в растении может обеспечить повышение выживаемости растений в условиях стресса [Hu, Schmidhalter, 2005].
Ион Са2+ является вторичным мессенджером на пути передачи сигналов, и, как правило, повышение его концентрации в ответ на сигнал стресса [White, Broadley, 2003; Tuteja, Sopory, 2008] может привести к увеличению концентрации абсцизовой кислоты [Tuteja, Sopory, 2008] устьиц [Schroeder et al., 2001; Wang, Wu, 2010; Burman et al., 2009]. Эти ионы служат осморегуляторами в поддержании тургора растений в условиях засухи [Kozlowski, Pallardy, 2002]. При достаточном поступлении фосфора, но при дефиците воды растения проявляют увеличение фотосинтетической эффективности и активность ферментов оксидативного стресса, что приводит к увеличению биомассы [Burman et al., 2009]. Кроме того, в условиях низкой доступности воды в почве причиной в изменении распределения биомассы в пользу корней может быть и дефицит Mg2+ [Hermans et al., 2010].
В целом продукция активных форм кислорода усиливается, когда растения подвергаются биотическим и абиотическим стрессам, что приводит к оксидативному стрессу [Mittler, 2002; Asada, 2006]. Zn, Cu и Mn являются кофакторами ферментов антиоксидативного метаболизма [Almeida et al, 2007; Hnsch, Mendel, 2009]. Изменения активности этих ферментов, способствующих удалению активных форм кислорода (АФК), увеличивает засухоустойчивость растений [Jiang, Zhang, 2002; Lei at al., 2006; Gill, Tuteja, 2010]. Кроме того, АФК играют важную роль в регуляции экспрессии генов [Carvalho, 2008; Jubany et al., 2010], в восприятии и передаче сигнала [Vanderauwera et al., 2005].
Поиск механизмов, обеспечивающих чувствительность растений к недостатку воды, привел к открытию нескольких предполагаемых осмосенсоров.
Большинство из них аналогичны дрожжевому осмосенсору SNL1, активирующему каскад митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK). Гомолог арабидопсиса SLN1, AtHK1, компенсировал дефекты роста у чувствительного к засолению мутанта дрожжей sln1/sho1 [Urao et al., 1999]. Тем не менее, прямых доказательств роли AtHK1 как осмосенсора в растениях все еще нет. Другая гистидинкиназа, CRE1, которая была идентифицирована как рецептор цитокинина, в присутствии цитокинина также может восстанавливать нормальные свойства у мутанта sln1 [Inoue et al., 2001]. Хотя функциональное значение компонентов осмотического сигналинга было выявлено, в основном, при изучении закрытия устьиц [Baxter et al., 2014], MAPK каскад может участвовать в осмотической регуляции в корне при дефиците воды.
Гормональный дистанционный сигналинг
АБК и цитокинины. Возвращение нитратов в питательную среду растений, растущих при дефиците азота, быстро стимулирует биосинтез цитокининов в корнях и его транспорт по ксилеме в побеги. Кроме того, способность цитокининов, регулировать экспрессию, по крайней мере, некоторых нитрат индуцируемых генов предполагает, что эти гормоны играют важную роль в передаче нитратных сигналов [Sakakibara et al., 2006]. В противоположность этому, разбавление питательного раствора (в том числе 10-кратное уменьшение концентрации нитратов) не оказывает никакого влияния на экспорт цитокининов в корень [Vysotskaya et al., 2009]. Тем не менее, нехватка питательных веществ уменьшила концентрацию цитокинина в побеге, что было связано с активацией цитокининоксидазы. Применение флуридона (ингибитора биосинтеза АБК) у дефицитных растений снимало как увеличение активности цитокининоксидаз, так и снижение содержания цитокининов в побеге [Vysotskaya et al., 2009]. Эти результаты дают основание предполагать, что АБК влияет на цитокининовый статуса побега, что характерно как для дефицита питательных веществ, так недостатка влаги [Davies et al., 2005; Kudoyarova et al., 2007].
Повышенный транспорт АБК по ксилеме из корней при недостатке влаги может предшествовать снижению водного статуса листьев [Zhang and Davies, 1989; Purtolas et al., 2013]. Значение транспорта АБК из корней при засухе и роль этого гормона в передаче сигналов из корней в побеги была продемонстрирована в опытах, показывающих повышение концентрации АБК в листьях, когда большая часть корневой системе была подвержена засухе, независимо от каких-либо изменений водных отношений в листьях [Martin-Vertedor and Dodd, 2011].
Накопление АБК в ответ на недостаток питания зависит от динамики поступления питательных веществ. Резкое удаление нитратов повышало концентрацию АБК в ксилеме [Dodd et al., 2003], в то время как постепенное его истощение не влияло на АБК [Palmer et al., 1996]. Вместе с тем, в некоторых опытах постепенное истощение фосфора повысило концентрацию АБК в ксилемном соке в корне и в листьях в 6 и 2 раза, соответственно [Jeschke et al., 1997]. Выявление влияния отдельных элементов минерального питания и скорости воздействия стресса на АБК и цитокининовый статус в корнях и ксилемный транспорт гормонов заслуживает дальнейшего внимания.
Изменения в транспорте гормонов из корней в побеги регулируют ответы побега на наличие почвенных ресурсов. Хотя закрытие устьиц в ответ на засуху в основном было связано с увеличением концентрации АБК в ксилеме [Davies et al., 2005], важную роль также может играть снижение концентрации цитокининов в побеге и их транспорта из корней [Kudoyarova et al., 2007]. Цитокинины могут непосредственно влиять на открытие устьиц и противодействовать АБК [Davies et al., 2005; Dodd 2005]. Не исключено, что в листьях повышение под влиянием цитокининов экспрессии генов, кодирующих транспортеры нитратов [Kiba et al., 2011], может быть связано с открытием устьиц, так как транспортер нитратов NRT1 регулирует накопление нитрата в замыкающих клетках устьиц [Castaings et al., 2011].
В качестве альтернативы, закрытие устьиц в ответ на дефицит питания коррелировало с повышенной чувствительностью устьиц к АБК [Jeschke, Hartung, 2000], которая может возникнуть у растений при стрессе вследствие подщелачивания апопласта [Wilkinson, Davies, 2008]. При щелочных показателях рН, слабые кислоты, такие как АБК диссоциируют и не могут пройти через клеточную мембрану, в результате чего накапливаются в апопласте и закрывают устьица в результате их связывания с ориентированными наружу рецепторами плазмалеммы [Hartung, 1983]. В закрытие устьиц в ответ на апопластную АБК может быть вовлечен GCR1 рецептор - один из нескольких сайтов восприятия АБК, расположенный в плазматической мембране и позитивно регулирующий сигналинг АБК [Wang, Zhang, 2008]. Поглощение нитратов по механизму симпорта анионов вместе с протонами [Santi et al., 2003] объясняет подщелачивание апопласта при высокой концентрации нитрата [Wilkinson, Davies, 2008]. Подщелачивание ксилемного сока при удалении нитрата может также привести к закрытию устьиц и не зависит от какого-либо увеличения концентрации АБК в ксилеме, однако в этом случае механизмы изменения рН остаются неясными [Dodd et al., 2003]. Таким образом, изменения устьичной проводимости, связанные с экспортом АБК и цитокининов из корней и их накоплением в побеге, также как и чувствительность устьиц к этим гормонам, являются хорошим примером общей реакции растений на доступность воды и питательных веществ и регуляции водного баланса и потока этих веществ в растениях. Гормональный сигналинг также играет важную роль в контроле роста побега в ответ на изменения в доступности ресурсов. Независимо от источника накопления цитокининов в листьях под влиянием нитратов (повышение экспрессии IPT генов, контролирующих синтез цитокининов в листьях, или транспорт в побеги синтезированных в корне цитокининов), повышенная концентрация этих гормонов может влиять на деление и растяжение клеток, поскольку оба процесса подавляются в растении при недостатке цитокининов [Werner et al., 2003]. Разбавление питательной среды у растений, выращенных на гидропонической культуре, снижало содержание цитокининов и тормозило рост листьев [Vysotskaya et al., 2009], в то время как обработка экзогенными цитокининами предотвращала торможение роста побега в этих условиях [Kuiper et al., 1989].
Краткосрочные эксперименты (1-2 недели) с подсушиванием части корней также показывают важность химических сигналов в корнях и побегах в регуляции роста листьев. Снижение концентрации цитокининов в листьях при дегидратации части корней [Kudoyarova et al., 2007], вероятно способствовало торможению роста листа, за счет снижения деления и растяжения клеток. Таким образом, как и в случае с транспирацией, одновременное повышение АБК и снижение цитокининов в ответ на дефицит воды и питательных веществ может тормозить рост побегов.
Рециркуляция цитокининов и АБК в растении важна для адаптации к доступности ресурсов. Базипетальный флоэмный транспорт цитокининов может ингибировать экспрессию транспортеров, индуцируемых недостатком питания, а также ответы других генов в корнях [Martin et al., 2000; Franco-Zorrilla et al., 2005; Kiba et al., 2011]. Тем не менее, попытки ингибировать реакции фосфорного голодания путем обработки части корней цитокининами привели только к местным, а не к системным реакциям (реакции на дефицит по-прежнему сохранялись в корнях, которые не были обработаны цитокининами) [Franco-Zorrilla et al., 2005]. Тем не менее, сложно интерпретировать результаты манипуляции с концентрациями цитокининов в отдаленных органах растений. Эксперименты с разделенной корневой системой показали, что цитокинины накапливаются только в обработанных корнях, и их содержание не изменяется в части корней, которые не подвергались обработке [Kudoyarova et al., 2014]. В корнях, обработанных экзогенным зеатином, был подавлен транспорт цитокининов в побеги из-за их активного поглощения клетками корня [Kudoyarova et al., 2014]. Этим можно объяснить отсутствие системного ответа на экзогенные цитокинины у растений при дефиците фосфора, но это не означает, что изменения эндогенных цитокининов не являются дистанционными сигналами.
Значение транспорта АБК из побегов в корни в адаптации листьев к дефициту воды (вызванного высокой скоростью испарения воды) было показано путем ингибирования флоэмного транспорта за счет охлаждения основания побега, при котором наблюдалось снижение накопления АБК в корне и также гидравлической проводимости корня [Kudoyarova et al., 2011]. Хотя было высказано предположение о том, что АБК-зависимый сигнальный путь функционирует локально в развивающемся примордии бокового корня [Walch-Liu et al., 2006], дальний сигналинг АБК не может быть исключен, так как АБК транспортируется по флоэме [Jeschke, Hartung, 2000], и изменения в доступности минеральных питательных веществ влияют на транспорт этого гормона по флоэме [Vysotskaya et al., 2008].
Рост растений и содержание фосфора
Во многих работах активно обсуждается роль ауксинов, цитокининов и АБК в регуляции роста растений при разных уровнях доступности фосфора. Вместе с тем роль ауксинов в регуляции роста корней хорошо известна. При изменении доступности фосфора ростовой ответ не всегда можно связать с общим содержанием ауксина в корне [Perezorres et al., 2008], зачастую дефицит фосфора вызывает перераспределение этого гормона в самом корне. Это подтверждает участие ауксинов в регуляции ростового ответа растений на недостаток фосфатов [Nacry et al., 2005]. Известно также, что мутантные растения со сниженной чувствительностью к ауксинам могут демонстрировать ростовой ответ корня, характерный для дефицита фосфора [Lpez-Bucio et al., 2002]. Несомненно, что цитокинины участвуют в регуляции ростовой реакции корней [Martin et al., 2000, Franco-Zorrilla et al., 2005, Hammond, White, 2008]. Как уже отмечалось, обработка растений цитокинином может подавлять индуцированную дефицитом фосфора экспрессию генов, [Martin et al., 2000]. Из этого наблюдения логично предположить, что в ответ на недостаток фосфора может происходить снижение содержания ЦК. Сегодня существуют доказательства участия в регуляции эффекта увеличения соотношения корень/побег при дефиците воды и питания такого гормона как АБК [Saab et al., 1990, Vysotskaya et al, 2008]. Но роль этого гормона редко изучали при фосфатном голодании, которое также может вызывать перераспределение массы в пользу корней. Также не часто встречается изучение взаимодействия этих гормонов в регуляции ростового ответа на дефицит фосфора.
Еще один аспект, на который мы уже обращали внимание в обзоре литературы, это разнообразие ростовых ответов растений на дефицит фосфора [Linkohr et al., 2002; Tian et al., 2005, Little et al., 2005, Xiong et al., 2006, Ito et al., 2006]. Пока нет какого-нибудь единого понимания механизмов формирования архитектуры корня (отсутствие или наличие активации роста корня в длину и его ветвления) при фосфатном голодании. Связано ли это с разными условиями выращивания и моделирования недостатка фосфора или с видовыми особенностями?
В дальнейших исследованиях мы использовали в качестве объекта ячмень, который относится к однодольным растениям и является важной с/х культурой. Важно также то, что в результате предварительных исследований нами было обнаружено, что для растений ячменя, как и для арабидопсиса, оптимальным для выращивания в выбранный нами экспериментальный отрезок является модифицированный 10%-ный раствор Хогланда-Арнона. Для исследований были выбраны два сорта ячменя: районированный в Башкирии сорт Прерия и культивируемый в Северной Америке сорт Steptoe. На основе Steptoe был отобран мутант AZ34 [Mulholland et al., 1996] со сниженной способностью к синтезу АБК, работа с которым, по нашим представлениям, также была перспективной в плане изучения роли АБК и взаимовлияния ИУК, цитокининов, АБК в регуляции ростового ответа растений на дефицит фосфора.
В этом разделе рассмотрим результаты исследований с растениями ячменя сорта Прерия. Выращивание растений в течение 5 суток после удаления фосфата из питательной среды привело к тому, что масса побегов стала меньше, чем у растений с фосфатсодержащей среды, но масса корней в обоих вариантах была одинакова: растущие на фосфатсодержащей среде (Р+) и растения, растущие на среде без фосфата (Р-) (рис.3.2.1.1). В данном случае мы констатируем увеличение соотношения масс корень/побег у растений, растущих на среде без фосфора. При этом существенно не отличалась суммарная длина всех корней (далее - длина корня) у (Р-) и (Р+) растений (рис.3.2.1.2), соответственно, не было ни подавления, ни активации роста корня в длину. Таким образом, в результате воздействия дефицита фосфора у растений ячменя сорта Прерия относительная активация роста корней проявлялась не только в способности растений накапливать такую же биомассу корня как и у растений, которые не испытывали дефицита питания, но и в способности поддерживать скорость удлинения корней на уровне контроля.
Оказалось, что, несмотря на еще сохраняющуюся, хоть и несколько истощенную зерновку, уже через сутки после переноса растений на питательный раствор без фосфора снижалось его содержание в корнях и побегах, и существенно изменялся гормональный баланс растений. Концентрация фосфора уменьшалась на 10 и 20% в побегах и корнях, соответственно, у растений, которые в течение суток росли на (P-) среде (рис. 3.2.1.4).
Содержание и динамика АБК, ИУК и цитокининов
Данный этап исследований посвящен изучению содержания гормонов (АБК, ИУК, цитокининов) у растений ячменя сорта Steptoe и мутанта AZ34, генотипы которых отличаются только по одному гену, но которые проявили очень разные ростовые ответы на питательных средах, содержащих и не содержащих фосфат. Сравнение результатов анализа уровня АБК в растениях двух генотипов (AZ34 и Steptoe) на полной питательной среде подтвердило ожидаемое достоверно (р0,05, n=9) более низкое содержание этого гормона у растений мутанта AZ34 (34,0±2,8 и 21,0±1,9; Steptoe и AZ34, соответственно). При этом в количественном выражении различия по концентрации АБК были, в основном, небольшими (порядка 40%), что согласуется с данными литературы [Walker-Simmons et al., 1989]. Видимо, с этим связано то, что мутант не требует особых условий для выращивания, в том числе и очень высокой влажности, как это необходимо для хорошо известного дефицитного по АБК мутанта томатов flacca.
Что касается влияния дефицита фосфора на уровень АБК, как и в случае с растениями арабидопсиса, у растений AZ34 и Steptoe через сутки воздействия дефицита фосфора нами не было замечено значимых изменений концентрации этого гормона (рис. 3.3.2.1а). Тем не менее, ее накопление в корнях у растений ячменя сорта Steptoe было обнаружено через 4 суток после удаления фосфата из питательного раствора, которое отсутствовало у мутанта (рис. 3.3.2.1б) и которое можно было связать с регуляцией ветвления корня. Этот гормональный сигнал предшествовал обнаруженному через 7 суток уменьшению числа боковых корней (рис. 3.3.1.4б). В пользу того, что АБК в данном случае выступала в качестве стимула, подавляющего ветвление, свидетельствовали результаты, представленные нами ранее. Так, на полном питательном растворе воздействие АБК на корни растений Steptoe вызывало уменьшение числа боковых корней (рис. 3.3.1.4а), а у растений ячменя сорта Прерия подавлению ветвления при дефиците фосфатов (рис. 3.2.1б) предшествовало накопление этого гормона в корнях (рис. 3.2.1.7). Напротив, у растений арабидопсиса при дефиците фосфора активации ветвления корня (табл. 3.1.1.1) предшествовало снижение в них концентрации АБК (рис. 3.1.2.1).
На первый взгляд, самые ранние ростовые ответы растений Steptoe на дефицит питания (рис. 3.3.1.1, 3.3.1.3а, 3.3.1.4а) не были связаны с накоплением АБК, как это было у растений ячменя сорта Прерия (рис. 3.2.1.7, 3.2.1.8). В то же время участие АБК в регуляции роста растений на самых первых этапах влияния дефицита фосфора было очевидным, поскольку мутант со сниженной способностью к синтезу АБК не проявлял увеличения отношения масс корень/побег, как это происходило при дефиците фосфора у полноценно синтезирующих АБК растений Steptoe (рис. 3.3.1.2). Скорее всего, следовало ожидать, что снижение концентрации гормона АБК в тканях мутанта AZ34 могло сказаться на уровне других гормонов, поэтому важно было сравнить содержание не только АБК, но также ИУК и цитокининов у растений ячменя AZ34 и Steptoe в условиях полной питательной среды и среды, не содержащей фосфор.
Прежде всего, рассмотрим динамику цитокининов, учитывая известный факт их неоднозначного влияния на рост побегов и корней. Это мнение сложилось довольно давно, прежде всего исходя из результатов обработки растений цитокининами, которые стимулировали рост побега, но подавляли рост корней [Beck, 1996]. В дальнейшем эти знания были расширены и сегодня не дискутируются так однозначно [Higuchi et al., 2004; Werner et al., 2010]. Кроме того, цитокинины довольно часто изучают в связи с дефицитом минерального питания [Sakakibara et al., 2006].
При удалении фосфата из питательной среды наиболее заметным было быстрое (уже к концу первых суток) снижение общего содержания цитокининов (суммы зеатина, его рибозида и нуклеотида) в побегах растений Steptoe (рис. 3.3.2.2). У контрольных, не испытывающих дефицит фосфора растений AZ34 содержание цитокининов в побегах было ниже, чем у растений их исходного генотипа, а удаление фосфатов из питательной среды не влияло на уровень этого гормона в побегах мутантных растений.
Ранее было показано для растений пшеницы, что снижение содержания цитокининов в побегах может способствовать относительной активации роста корней [Дедова и др., 2011]. Более того, в двух предыдущих разделах данной работы были представлены результаты о том, что у растений арабидопсиса и ячменя сорта Прерия отсутствие фосфатов вызывало относительную активацию роста корней (увеличение отношения масс корень/побег), которой также предшествовало снижение содержания цитокининов в побеге. Таким образом, отсутствие снижения содержания цитокининов в побегах мутанта AZ34 могло быть связано или даже быть причиной неспособности проявления характерной для дефицита питания ростовой реакции, приводящей к увеличению массовой доли корней.
С чем может быть связан разный характер изменений содержания цитокининов в ответ на недостаток фосфора? Ранее была показана способность АБК к снижению уровня цитокининов путем активации цитокининоксидазы, катализирующей распад цитокининов [Vysotskaya et al., 2009]. Хотя мы не зарегистрировали повышения уровня АБК у растений Steptoe под влиянием дефицита фосфора в течение первых суток, перераспределение и повышение локального уровня этого гормона могло способствовать снижению уровня цитокининов, зарегистрированного нами в побегах растений Steptoe под влиянием дефицита фосфора.
Вместе с тем, требовал объяснения тот факт, что в отсутствие дефицита фосфатов (Р+) уровень цитокининов в побегах растений AZ34 был ниже, чем у растений Steptoe, а при этом соотношение массы корней к массе побега у AZ34 было не выше, чем у Steptoe (Рис. 3.3.1.2в). Что же могло помешать проявлению активации роста корней у контрольных (P+) растений AZ34 с пониженным уровнем цитокининов, по сравнению с исходным генотипом? Как известно, относительной активации роста корней может способствовать как пониженный уровень цитокининов, так и накопление АБК [Vysotskaya et al., 2009]. Как отмечалось выше, растения AZ34 отличались более низким уровнем АБК, по сравнению со Steptoe. Можно также заметить, что в относительно более поздний период воздействия дефицита фосфора к концу 4-х суток у растений Steptoe в ксилемном экссудате начинала концентрироваться АБК (рис. 3.3.2.1), которая также могла выступать в качестве регулятора соотношения масс корень/побег. Очевидно, что механизмы, связанные с накоплением АБК, не могли быть задействованы у мутанта AZ34 в связи с его ограниченными возможностями синтезировать и транспортировать АБК в побег. Соответственно, на протяжении всего семидневного периода воздействия дефицита питания у мутанта не было обнаружено характерного для дефицита питания перераспределения массы в пользу корней. Таким образом, сравнение особенностей распределения биомассы между побегом и корнем у растений дефицитного по АБК мутанта и его родительской формы, свидетельствует о важности изменений уровня обоих гормонов (как снижения цитокининов, так и накопления АБК) для регуляции соотношения масс побега и корня.