Введение к работе
Актуальность темы. Одно из уникальных свойств растительных клеток, существенно отличающее их от животных, заключается в способности к росту растяжением. Согласно теории "кислого роста" ключевую роль в процессе роста растяжением играет Н+-АТФаза плазмалеммы (ПМ). Активация этого фермента обеспечивает выход протонов из клетки и индукцию изменения пластических свойств клеточной стенки. Показано изменение свойств Н+-АТФазы ПМ при действии целого ряда внешних и внутренних факторов. В настоящее время выяснены структура и свойства Н+-помпы ПМ, а также основные пути регуляции ее активности на пост-трансляционном уровне. Однако при расширении данных о кодировании фермента, очень мало известно о регуляции на транскрипционном уровне. Например, до сих пор не ясно, каким образом регулируется работа этой протонной помпы в ходе онтогенеза, в том числе в ходе роста растяжением.
Многократное увеличение длины клетки сопровождается интенсивной
вакуолизацией, что обусловливается изменением осмотических градиентов между
цитоплазмой и вакуолью. Одну из наиболее значимых транспортирующих систем
тонопласта представляет собой Н+-ATФаза вакуолярного типа широко
распространенный у эукариотических клеток протонный насос внутриклеточных мембран. Она организована как мультисубъединичный комплекс, образованный надмембранным каталитическим и трансмембранным доменами. Показано значительное изменение активности фермента в стрессовых условиях. Однако механизмы регуляции работы фермента, как на транскрипционном, так и посттрансляционном уровнях, еще практически не изучены. Отсутствуют данные о возможности изменения активности данного протонного насоса в ходе роста клетки. Еще один протон-транспортирующий фермент вакуолярной мембраны – Н+-пирофосфатаза (Н+-ПФаза). Она также участвует в генерации протонного градиента на тонопласте, однако использует для этого энергию пирофосфата. Значительный интерес исследователей к изучению этого фермента позволил выявить роль Н+-ПФазы в самых различных физиологических и адаптационных процессах. В тоже время механизмы ее участия при вакуолизации клетки в ходе роста растяжением остаются нераскрытыми.
Перечисленные протонные насосы являются ключевыми элементами системы рН-стата. Активное поддержание уровня рН цитоплазмы в процессе жизнедеятельности – неотъемлемое свойство живой клетки. Можно лишь предполагать, что модуляция работы любой из протон-транспортирующих систем может инициировать изменение работы других.
Цель работы заключается в исследовании активности протонных насосов растительной клетки в ходе роста растяжением на транскрипционном уровне.
В связи с этим были сформулированы следующие задачи исследования:
-
Проанализировать интенсивность экспрессии генов, кодирующих Н+-АТФазу плазмалеммы, Н+-пирофосфатазу тонопласта и субъединицы вакуолярной Н+-АТФазы в ходе роста растяжением клеток этиолированных проростков арабидопсиса и суспензионной культуры клеток табака VBI-0;
-
Оценить изменение содержания белка Н+-помп в составе плазмалеммы и тонопласта в ходе роста растяжением клеток гипокотилей этиолированных
проростков арабидопсиса и суспензионной культуры клеток табака VBI-0 с помощью Western blot-анализа;
-
Выявить динамику гидролитической активности Н+-помп в составе плазмалеммы и тонопласта в ходе роста растяжением клеток суспензионной культуры табака VBI-0;
-
Предложить модель перераспределения роли протонных насосов растительной клетки в ходе роста растяжением.
Научная новизна исследования. Впервые для двух модельных объектов, представленных этиолированными гипокотилями арабидопсиса и суспензионной культурой клеток табака VBI-0 доказано нелинейное изменение активности Н+-АТФазы плазмалеммы. Усиление гидролитической и транспортной активности фермента опосредовано усилением экспрессии нескольких генов семейств AHA у арабидопсиса и PMA у табака, и увеличением Н+-АТФаз в составе ПМ.
Впервые для вакуолярной Н+-АТФазы клеток, растущих растяжением, выявлена
нелинейная динамика гидролитической активности, сопровождающаяся
усилением экспрессии генов, кодирующих субъединицы фермента, увеличением количества этих субъединиц в составе тонопласта. Впервые проведен молекулярно-филогенетический анализ субъединиц фермента, указывающий на различия в путях эволюции вакуолярной протонной помпы.
Установлено, что Н+-ПФаза тонопласта характеризуется постепенным
затуханием гидролитической активности, обусловленным однонаправленным
изменением экспрессии генов, ее кодирующих, и представленностью
соответствующих белков в составе тонопласта.
Впервые для модельных объектов предложена модель перераспределения роли протон-транспортирующих ферментов в ходе роста растяжением от Н+-ПФазы к Н+-АТФазам.
Теоретическая и практическая значимость. Доказана важность регуляции активности протонных насосов растительной клетки в ходе роста растяжением на транскрипционном уровне. Впервые выявлена прямая корреляция динамики экспрессии с последующим изменением активности Н+-АТФаз и Н+-ПФазы. Проведен молекулярно-генетический анализ субъединиц и выявлены различия в эволюционных изменениях кодирования субъединиц Н+-АТФазы V-типа.
Разработан уникальный метод оценки транспортной активности протонной АТФазы ПМ суспензионной культуры табака VBI-0. Этот метод может быть востребован для экспресс-тестирования протон-транспортирующей (закисляющей) активности клеток различных суспензионных культур.
Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, могут быть использованы
в материалах курсов лекций, читаемых на биологическом факультете СПбГУ
(«Сигнальные системы растений», «Физиология растительной клетки»).
Основные положения, выносимые на защиту. 1. Протонные АТФазы ПМ и
тонопласта нелинейно изменяют свою активность с проявлением максимума на
этапе интенсивного роста растяжением; 2. Рост-обусловленное усиление работы
протонных АТФаз сопровождается усилением экспрессии генов, кодирующих
ферменты или их субъединицы, а также увеличением содержания
соответствующих белков в составе мембран; 3. Значение протонной пирофосфатазы тонопласта снижается в ходе роста растяжением.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международной научной конференции «Физиология растений - теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехнологий», Калининград, 19-25 мая 2014 г., International Symposium on Auxins and Cytokinins in Plant Development. Prague, June 29 – July 4, 2014, VIII Съезде общества физиологов растений России «Растения в условиях глобальных и локальных природно-климатических и антропогенных воздействий», Петрозаводск, 21-26 сентября 2015 г., III (XI) Международной ботанической конференции молодых ученых в Санкт-Петербурге, 4-9 октября 2015 г., Годичном собрании общества физиологов растений России «Сигнальные системы растений: от рецептора до ответной реакции организма», Санкт-Петербург, 21-24 июня 2016 г.
По теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из перечня ВАК РФ и цитируемых в РИНЦ.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 137 страницах, состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, который включает в себя 180 источников, в том числе 169 на иностранном языке. Диссертация иллюстрирована 50 рисунками и 13 таблицами.