Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Эндофитные представители бактерий рода Bacillus и их роль во взаимоотношениях с растениями (обзор литературы) 14
1.1. Распространенность представителей Bacillus spp. в тканях растений 15
1.2. Биологическая активность эндофитных штаммов Bacillus spp. по отношению к растениям 18
1.2.1. Влияние бацилл на рост растений 19
1.2.2. Антибиотическая активность бацилл 23
1.2.3. Роль эндофитных штаммов Bacillus в питании растений 26
1.2.4. Участие бактерий Bacillus spp. в адаптации растений к абиотическим стрессовым факторам среды 28
1.3. Взаимоотношения бактерий Bacillus spp. с ассоциативными микроорганизмами высших растений 37
1.3.1. Взаимодействие эндофитных бактерий с грибами, формирующими эндомикоризу 38
1.3.2. Взаимоотношения бактерий Bacillus spp. с микробным сообществом ризосферы 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 48
2.1. Объекты исследований 48
2.2. Питательные среды и условия культивирования 48
2.3. Методика оценки влияния штаммов B. subtilis на рост растений 50
2.4. Оценка альгицидной активности бактерий и их метаболитов 51
2.5. Оценка влияния эндофитов на микробное сообщество ризосферы 52
2.6. Анализ антистрессовой активности эндофитов
2.6.1. Солевой стресс 54
2.6.2. Имитация засухи 55
2.6.3. Действие тяжелых металлов 55
2.7. Методы биохимических исследований 55
2.7.1. Определение активности антиоксидантных ферментов 55
2.7.2. Анализ содержания малонового диальдегида 57
2.7.3. Определение содержания фенольных соединений 57
2.7.4. Определение содержания фитохелатинов и глутатиона 58
2.7.5. Определение содержания фотосинтетических пигментов 60
2.7.6. Определение содержания свободного пролина 61
2.7.7. Определение содержания тяжелых металлов 62
2.7.8. Агрохимический анализ побегов растений 62
2.7.9. Отбор почвенных образцов в поле 62
2.8. Методы гистохимических исследований 63
2.8.1. Методы определения локализации кадмия корнях 63
2.8.2. Определение локализации лигнина в клетках корней растений 63
2.8.3. Количественная оценка микоризации корней 63
2.9. Отбор образцов корней растений в поле 64
2.10. Определение влияния препаратов на микоризацию корней растений 64
2.11. Статистическая обработка результатов 65
ГЛАВА 3. Видовая и сортовая отзывчивость сельскохозяйственных растений на инокуляциюклетками эндофитов 66
3.1. Видовая отзывчивость культур на инокуляцию клетками эндофитов 66
3.2. Сортовая отзывчивость пшеницы на инокуляцию семян клетками эндофитов 72
ГЛАВА 4. Влияние эндофитных представителей b. subtilis на размножение одноклеточных водорослей 77
4.1. Размножение клеток водорослей под влиянием эндофитов 77
4.2. Оценка токсичности метаболитов бактерий и альгицидов для водорослей83
ГЛАВА 5. Ответные реакции растений, инокулированных эндофитами, на действие стрессовых факторов 87
5.1. Протекторный эффект обработки семян эндофитами при действии на растения тяжелых металлов 87
5.1.1. Рост растений при действии тяжелых металлов 87
5.1.2. Биохимические показатели инокулированных эндофитами растений пшеницы при действии тяжелых металлов 94
5.1.3. Устойчивость клеток B. subtilis к тяжелым металлам и способность к биоиммобилизации 105
5.1.4. Анализ содержания тяжелых металлов в побегах растениях 109
5.2. Рост и биохимические показатели бактеризованных растений при почвенной засухе 115
5.3. Повышение устойчивости растений к солевому стрессу при инокуляции эндофитами 124
ГЛАВА 6. Особенности формирования растениями эндомикоризы в сообществе с эндофитными бактериями
6.1. Распространенность эндомикоризы на Южном Урале 134
6.2. Особенности формирования эндомикоризы культурными растениями под влиянием эндофитных штаммов бактерий B. subtilis 143
6.3. Влияние обработки семян различными препаратами на микоризацию корней растений 146
6.3.1. Действие протравителей семян на микоризацию корней сельскохозяйственных культур 146
6.3.2. Влияние регуляторов роста растений на микоризацию 150
6.3.3. Сравнительный анализ влияние биофунгицида на основе штамма B. subtilis 26Д на микоризацию корней растений 153
6.4. Формирование эндомикоризы при абиотических стрессах под влиянием эндофитных бактерий B. subtilis 156
6.4.1. Формирование микоризы растений при дефиците влаги в почве 156
6.4.2. Действие эндофитов на показатели микоризации корней пшеницы при засолении почвы 162 6.4.3. Влияние бактеризации семян на показатели микоризации корней пшеницы в условиях воздействия тяжелых металлов 165
ГЛАВА 7. Изменение численности бактерий в ризосфере пшеницы под влиянием эндофита b. subtilis 26д 168
7.1. Изменение численности почвенных микроорганизмов под влиянием бактерий B. subtilis 26Д 168
7.2. Влияние бактерий B. subtilis 26Д на численность клеток азотофиксатора Azotobacter vinelandii 172
Заключение 175
Выводы 182
Практические рекомендации 184
Список литературы 185
- Роль эндофитных штаммов Bacillus в питании растений
- Оценка альгицидной активности бактерий и их метаболитов
- Сортовая отзывчивость пшеницы на инокуляцию семян клетками эндофитов
- Особенности формирования эндомикоризы культурными растениями под влиянием эндофитных штаммов бактерий B. subtilis
Введение к работе
Актуальность темы. Исследования взаимоотношений между растениями и микроорганизмами значимы как в аспекте получения фундаментальных знаний, так и их применения в практике. Спектр таких взаимоотношений сложный и включает одновременное взаимодействие растений с различными видами микроорганизмов, потенциально действующих как консорциум. Эти многокомпонентные микробные сообщества очень динамичны и представляют собой функциональные группы, поддерживающие устойчивость системы, которая может включать трехсторонние взаимодействия: растение – бактерии – грибы (Dames, Ridsdale, 2012; Farrar et al., 2014).
Открытия явлений благоприятного влияния микроорганизмов на растения привели к промышленному производству различных микробных препаратов для растениеводства, что особенно актуально для решения вопросов загрязнения окружающей среды агрохимикатами. Одними из первых бактерий, успешно применявшихся в качестве агентов биологического контроля патогенов сельскохозяйственных культур и для стимуляции роста растений (PGPB, Plant Growth Promoting Bacteria), были бактерии рода Bacillus (Kumar et al., 2012). Повсеместное распространение бацилл (в почве, воде, на поверхности и во внутренних тканях растений), активный синтез ими метаболитов широкого спектра действия, высокая адаптивная способность к различным условиям окружающей среды позволяют отнести эти бактерии к перспективным объектам биотехнологии (Hirooka, 2014). Особый интерес вызывают эндофитные представители группы Bacillus spp. (PGPEB, Plant Growth Promoting Endophytic Bacteria). Согласно современным русскоязычным определениями «эндофитные бактерии – бактерии, проникающие во внутренние растительные ткани без повреждений, вызванных воздействием других факторов, и способные жить внутри растений, не нанося им вреда» (Хайруллин, Сарварова, 2016).
Эндофиты представляют интерес в первую очередь, как потенциальные агенты, так называемого, системного биоконтроля, так как проникают внутрь растений. Однако эти микроорганизмы способны влиять на физиологические процессы, определяющие устойчивость к действию и абиогенных стресс-факторов среды. В этом аспекте отсутствует понимание механизмов мутуализма эндофитных бактерий и растений (Compant et al., 2010; Dames, Ridsdale, 2012; Farrar et al., 2014). Важной является также оценка влияния бактериальных эндофитов на формирование мутуалистических взаимоотношений растений с другими микроорганизмами, например, грибами, формирующими везикулярно-арбускулярную микоризу (ВАМГ). Сведения об этом пока редко встречаются в научной литературе. В целом, отсутствует комплексный подход в изучении действия эндофитных штаммов бактерий на растительный организм в условиях стрессов и при его взаимодействии с другими микроорганизмами-мутуалистами, в том числе с ВАМГ.
Цель работы – определить характер и механизмы проявления ответных реакций растений в сообществе с эндофитными представителями бактерий B. subtilis на стрессовые факторы среды.
Задачи исследования
1. Определить характер ответа разных видов культурных растений на
инокуляцию клетками эндофитных штаммов бактерий B. subtilis.
-
Исследовать особенности воздействия эндофитов и их метаболитов на одноклеточные водоросли, как на компоненты агрофитоценозов.
-
Определить характер и механизмы проявления ответных реакций растений под влиянием клеток эндофитных штаммов бактерий на действие стресс-факторов (ионов тяжелых металлов, почвенной засухи и засоления).
-
Выявить особенности формирования растениями, инокулированными эндофитными бактериями-антагонистами, везикулярно-арбускулярной микоризы в стрессовых условиях среды.
-
Оценить влияние клеток эндофитного штамма бактерии B. subtilis 26Д на микробиоценоз ризосферы пшеницы.
Научная новизна. Впервые показано одновременное влияние эндофит-ных штаммов B. subtilis на устойчивость растений к различным видам стресс-факторов окружающей среды – тяжелым металлам (ТМ) (кадмий, свинец, никель), соли хлорида натрия, а также почвенной засухе, и установлен защитный эффект обработки семян разных с.-х. культур эндофитами при действии указанных неблагоприятных условий. Установлено, что одними из общих механизмов проявления защитного действия изученных эндофитных бактерий B. subtilis на растения в указанных условиях являются снижение уровня накопления малонового диальдегида (МДА), и, соответственно, перекисного окисления липидов, а также увеличение уровня пролина в растительных тканях. Показано, что в условиях засоления почвы эндофитные бактерии способствуют уменьшению содержания ионов Na+ в побегах растений и препятствуют снижению уровня ионов K+. Другие защитные реакции растений, опосредованные эндофи-тами, включают повышение активности антиоксидантных ферментов перокси-дазы и каталазы, накопление фенольных соединений и фитохелатинов.
Показано, что обработка семян растений клетками бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ приводит к увеличению содержания фотосинтезирующих пигментов, в том числе в условиях действия кадмия, что является одним из вкладов в улучшение питания растений при данном стрессе.
Установлено, что обработка семян с.-х. культур исследованными бактериями B. subtilis влияет на накопление тяжелых металлов в растительных тканях.
Впервые обнаружена способность бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ инги-бировать размножение клеток водорослей Chlorells vulgaris и Scenedesmus quadricauda. Показано, что альгицидная активность эндофитов связана с продукцией ими метаболитов липопептидной природы.
Впервые исследована распространенность везикулярно-арбускулярной микоризы в корневой системе яровой пшеницы и озимой ржи, произрастающих на Южном Урале. Выявлено, что применение регулятора роста растений (До-моцвет), а также фунгицидов для обработки семян (ТМТД, террасил) уменьшает степень микоризации корней пшеницы, овса, гороха. Показано, что в отсутствии действия стресс-факторов обработка семян эндофитами приводит к уменьшению показателей микоризации корней яровой пшеницы, гороха, ячменя. Вместе с тем при действии засухи, ионов тяжелых металлов, а также засолении почвы, инокуляция семян эндофитными бактериями позволяет увеличить интенсивность микоризации корней пшеницы, костреца, гороха, кукурузы. Установлено, что обработка семян эндофитными бактериями B. subtilis штаммов 26Д и 11ВМ влияет на микробиоценоз ризосферы пшеницы, а эндофит B. subtilis 26Д способен подавлять рост хозяйственно-полезных бактерий Azotobacter vinelandii (штамм ИБ-1).
Научно-практическая значимость работы. Показана комплексная биологическая активность эндофитного антагонистического штамма B. subtilis 26Д – основы биологического средства защиты растений Фитоспорин-М, что позволяет расширить спектр применения эндофита в растениеводстве не только как основы биофунгицида, но и как препаратов с антистрессовой активностью при неблагоприятном воздействии на сельскохозяйственные культуры тяжелых металлов, засухи и засоления почв.
Установлено, что применение препаратов на основе эндофитных штаммов B. subtilis 26Д и 11ВМ увеличивает частоту и интенсивность образования эндомикоризы у растений пшеницы в условиях стрессов, вызванных действием тяжелых металлов, засоления и засухи, в связи с чем, для усиления микориза-ции растений при действии этих стресс-факторов рекомендуется инокулировать семена клетками указанных эндофитов.
Выявлено, что обработка семян пшеницы эндофитными бактериями B. subtilis уменьшает содержание кадмия и свинца в надземной части растений. Полученные результаты не позволяют рекомендовать использование препаратов на основе бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ на почвах с высокой концентрацией никеля, так как это приводит к увеличению содержания токсиканта в растениях. При высоком уровне загрязнения почвы тяжелыми металлами обработка растений горчицы указанными эндофитами может быть рекомендована с целью извлечения токсикантов из почвенного покрова.
Способность эндофитных бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ, а также их метаболитов ингибировать рост водорослей является научной основой для создания высокоэффективных альгицидов. Выявлено, что во избежание гибели одноклеточных водорослей в природных водоемах не рекомендуется допускать их загрязнения бактериальными препаратами на основе исследованных штаммов.
Связь диссертационной работы с плановыми исследованиями и на-
учными программами. Исследования по теме диссертации поддержаны Ми
нистерством сельского хозяйства России по теме НИР «Разработка полифунк
циональных биофунгицидов для растениеводства» (Госрегистрация
№01200853490), Стерлитамакским филиалом ФГОУ ВО БашГУ по темам НИР
«Новые высокоэффективные биофунгициды» (2013), «Биологические особен
ности эндофитных штаммов Bacillus subtilis и их практическое применение»
(2014-2016 гг).
Основные положения, выносимые на защиту
-
В сообществе с исследованными эндофитами у культурных растений повышается устойчивость к стрессам, вызванным различными факторами – действием тяжелых металлов, почвенной засухи, натрий-хлоридного засоления.
-
Одним из общих механизмов протекторного эффекта эндофитных бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ при действии исследованных стресс-факторов является уменьшение в растительных тканях количества МДА – как интегрального показателя уровня перекисного окисления липидов.
-
Под влиянием эндофитных бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ изменяется содержание тяжелых металлов в растительных органах, уменьшение или увеличение которого определяется видом металла и растения. Одним из механизмов повышения устойчивости проростков пшеницы к солевому стрессу, вызванному NaCl, является уменьшение содержания ионов натрия в проростках, инокулированных указанными эндофитами.
4. В условиях воздействия изученных стресс-факторов у растений в сооб
ществе с эндофитными бактериями B. subtilis 26Д и 11ВМ увеличивается часто
та и интенсивность формирования эндомикоризы.
5. Под действием бактерий B. subtilis штаммов 26Д и 11ВМ подавляется
размножение одноклеточных водорослей Scenedesmus quadricauda и Chlorella
vulgaris, что может быть использовано в практических целях.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на пяти Международных научно-практических конференциях «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2010, 2011, 2014, 2015 гг.), IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2009), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2009), VII Международной научно-практической конференции «Тяжелые металлы и радионуклиды в окружающей среде» (Семипалатинск, 2012), Съезде микологов России «Современная микология в России» (Москва, 2012, 2015 гг.), Международной конференции «Физиология и биотехнология микроводорослей» (Москва, 2012), Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 2013), Всероссийских научных конференциях с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013) и «Современные проблемы биохимии и биотехнологии» (Уфа, 2013), Междуна-
родной научной конференции по биологии и биотехнологии (Алматы, 2014), Всероссийской конференции с международным участием «Биотехнология – от науки к практике» (Уфа, 2014), Международной научной конференции «Физиология растений – теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехно-логий» (Калининград, 2014), Международной научной конференции «ЭкоБио-тех-2015» (Уфа, 2015).
Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 33 печатных работах, в том числе в 15 статьях в журналах из перечня ВАК РФ. По теме исследования автором опубликованы 1 монография и 1 учебное пособие.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 252 страницах, содержит 19 рисунков, 42 таблицы и включает разделы: введение; обзор литературы; экспериментальную часть, описывающую объекты, методы и результаты исследований и их обсуждение; заключение, выводы; практические рекомендации; список 584 литературных источников, в том числе 519 зарубежных.
Благодарности. Выражаю глубокую признательность научному консультанту доктору биологических наук, профессору Хайруллину Р.М. за постоянное внимание и неоценимую помощь на всех этапах работы. Искреннюю признательность выражаю к.б.н. Смирновой Ю.В. С особой признательностью и уважением благодарю сотрудников научно-образовательного центра ФГБОУ ВО «Башкирский ГАУ» и лично к.б.н. Уразбахтину Н.А. Выражаю благодарность всем сотрудникам кафедры биологии естественнонаучного факультета Стерли-тамакского филиала ФГОУ ВО «Башкирский государственный университет».
Роль эндофитных штаммов Bacillus в питании растений
Считается, что эндофиты эволюционно появились как промежуточная группа между сапрофитными бактериями и патогенами растений (Menpara, Chanda, 2013), и любое из 300000 видов существующих в мире растений является хозяином одного или нескольких видов эндофитов (Strobel et al., 2004; Chebotar et al., 2015). Тем не менее, в настоящее время наличие эндофитов и их видовой состав достаточно хорошо изучены лишь у нескольких видов растений: это цитрусовые (Arajo et al., 2001), сахарный тростник (Gangwar, Kaur, 2009), кукуруза (Araujo et al., 2000), эвкалипт (Procopio, 2009; Ferreira et al., 2008), клубника (Dias et al., 2009), сахарная свекла, картофель (Dent et al., 2004; Taghavi et al., 2009; Sessitsch et al., 2012; Menpara, Chanda, 2013) и некоторые другие.
Следует отметить, что одно растение может быть колонизировано несколькими видами как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, относящихся к разным родам, таким как, например, Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Brevibacterium, Burkholderia, Chromobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Kocuria, Lysinibacillus, Methylobacterium, Microbacterium, Paneibacillus, Pantoea, Phyllobacterium, Pseudomonas, Rahnella, Rhodanobacter, Stenotrophomonas (Sun et al., 2013; Ma et al., 2012). Однако преобладающее количество видов эндофитных бактерий было выявлено среди родов Streptomyces sp. и Bacillus sрp. (Sun et al., 2013). Эндофиты Bacillus spp. найдены во внутренних тканях разнообразных частей растений: семян, фруктов, стеблей, листьев, корней и клубней, цветков (Russo et al., 2012). Бактерии B. amyloliquefaciens СС09 выделены из здоровых тканей камфорного дерева (Cinnamomum camphora) (Xun-Chao et al., 2013), лекарственного растения Scutellaria baicalensis Georgi (Sun et al., 2006); B. subtilis EDR4 – из фильтрата корней пшеницы (Liu et al., 2010), B. subtilis ZZ120 – из стеблей Prunus mume (семейство: розоцветных) (Li, 2012; Wang, Liang, 2014); B. licheniformis и B. pumilus – из корней ширококольчика цветкового (Platycodon grandiflorum) (Asraful et al., 2010); штаммы B. subtilis, B. thuringiensis и B. pumilus – из клубеньков сои (Bai et al., 2002; Li et al., 2008; Zhang et al., 2012) и из тканей пшеницы (Liu et al., 2009); B. subtilis, B. pumilus и Bacillus sp. – из кукурузы (Rai et al., 2007; Rijavec et al., 2007); B. endophyticus и Bacillus sp. – хлопчатника (Reva et al., 2002; Rajendran et al., 2007; Rajendran, Samiyappan, 2008). Разные виды и штаммы эндофитов (в том числе и Bacillus) выделены из корней и стеблей риса (Nhu, Diep, 2014).
Несмотря на то, что эндофитные бактерии могут колонизировать любую внутреннюю часть растения (Jha et al., 2013), самая высокая плотность эндофитов наблюдаются в корнях, и имеется тенденция уменьшения концентрации клеток от тканей корней к листьям и другим надземным органам (Moore et al., 2006).
Разнообразие эндофитов может зависеть от вида и сорта растений (Ulrich et al., 2008), а плотность заселения – от ткани, стадии развития растения, факторов окружающей среды, например, времени года (Shen, Fulthorpe, 2015; Kuklinsky-Sobral et al., 2004). Эндофитная колонизация зависит от физиологических изменений в растениях и может быть ограничена или замедлена защитными механизмами (Rosenblueth, Martnez-Romero, 2006). У двудольных растений салициловая кислота, этилен, жасмоновая кислота ограничивают колонизацию (Iniguez et al., 2005; Mich et al., 2006). На колонизацию растений эндофитами могут влиять удобрения. Так под влиянием азотных удобрений уменьшается концентрация сахарозы, используемая эндофитами, и их проникновение в растения ухудшается (Hallman et al., 1997). Антимикробные пептиды, синтезируемые некоторыми растениями, такими как рис и кукуруза, могут привести к уменьшению степени эндофитной колонизации этих растений (Hurek, Reinhold-Hurek, 2003).
Следует отметить, что выявление эндофитов не всегда удается методами классической микробиологии, поэтому в настоящее время широко стал использоваться ДНК-анализ с «метагеномным» подходом (Sessitsch et al., 2012; Lacava, Azevedo, 2014).
Эндофитные бактерии, по всей видимости, могут «передаваться из поколения в поколение» через семена (Pleban et al., 1995; Adams, Kloepper, 2002), вегетативный посадочный материал (Dong et al., 1994), а также через почву на клубнях (Sturz, 1995; Hallmann et al., 1997; Mahaffee, Kloepper, 1997). За исключением семян, в которых уже присутствуют бактерии, потенциальные эндофиты колонизируют поверхность корня перед входом в растения. Эндофиты, как считается, могут находить своих хозяев путем хемотаксиса, электротаксиса или случайного столкновения. Входными воротами в растения для эндофитных бактерий чаще всего являются раны (поранения, повреждения (Sprent, de Faria, 1998; Preito et al., 2011; Reinhold-Hurek, Hurek, 2011)). Проникновение эндофитных бактерий в растения может происходить, как через корневую систему (Chi et al., 2005; Hardoim et al., 2008; Jha et al., 2013), так и через воздушное зоны побега (Sharrock et al., 1991), возможно проникновение через устьица и чечевички (Kluepfel, 1993). Эндофитные бактерии после проникновения в растения через корни активно распространяются в надземной части благодаря продукции умеренного количества таких ферментов, как пектиназы и целлюлазы (Jha et al., 2013).
Эндофиты могут жить в пределах межклеточного пространства (ePGPR, extracellular PGPR) где питаются апопластическими веществами, как непатогенные микроорганизмы (Bacon, Hinton, 2002; Chanway, 1998; McCully, 2001), но могут присутствовать и внутри клеток (iPGPR, intracellular bacteria или в сосудистой системе (Hallmann et al., 1997; James et al., 1998; Reinhold-Hurek, Hurek, 1998; Sturz et al., 2000; Rosenblueth, Martnez-Romero, 2006; Gai et al., 2009; Lacava, Azevedo, 2014; Kumar et al., 2012). Анализ данных литературы показывает чрезвычайно большое видовое разнообразие эндофитных бактерий, их локализацию в различных растительных органах и тканях, однако далеко не все виды растений исследованы на наличие эндофитов. Остается открытым вопрос и о механизмах функционирования симбиоза растений с эндофитами бактериями.
Оценка альгицидной активности бактерий и их метаболитов
Объектами исследования служили следующие виды сельскохозяйственных растений: яровая мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) сортов Омская 35 и Казахстанская 10, озимая пшеница сорта Волжская качественная; озимая рожь (Secаle cereаle L.) сорта Чулпан-7, ячмень (Hordeum vulgare L.) сорта Прерия, подсолнечник (Helianthus annuus L.) сорта Енисей, кукуруза (Zea mays L.) сорта РИК-340, горох (Pisum sativum L.) сорта Чишминский 95, овес (Avena sativa L.) сорта Победа, горчица белая (Sinapis alba L.) сорта Рапсодия. В работе исследовались также растения костреца безостого (Brоmopsis inеrmis L.).
В качестве тест-объектов служили чистые культуры водорослей Scenedesmus quadricauda (Turpin) Brеbisson, Chlorella vulgaris Beyer, предоставленные Стерлитамакским подразделением Государственного учреждения Управления государственного аналитического контроля Министерства экологии и природных ресурсов Республики Башкортостан.
В экспериментах использовали два штамма Bacillus subtilis Cohn.: 26Д (коллекция ВНИИСХМ С.-Пб.-Пушкин, №128), 11ВМ (ВНИИСХМ №519). Первый штамм выделен из поверхностно стерилизованных тканей растений хлопчатника (Недорезков, 2003), второй – мягкой яровой пшеницы (Егоршина и др., 2011). Штамм бактерий A. vinelndii ИБ-1 был любезно предоставлены д.б.н., проф. Логиновым О.Н. (УИБ РАН, г. Уфа), за что автор выражает ему глубокую благодарность. subtilis использовались следующие питательные среды (состав г/л): 1) Мясо-пептонный бульон (МПБ): мясная вода (отвар 0,5 кг мяса в 1 л воды), пептон («Panreac», Испания) – 10, NaCl – 5, агар микробиологический («Panreac», Испания) - 15. 2) Мясо-пептонный агар (МПА): МПБ с добавлением агара 20. 3) Картофельно-глюкозный агар (КГА): картофельный отвар (0,2 кг картофеля в литре воды), глюкоза («Экрос», Россия) - 20, агар-агар - 15. Устойчивость бактерий к ТМ оценивали по их росту на МПА в чашках Петри при 37С в течение 24-48 ч, обогащенном солями: Cd(N03)2-4H2Oj Pb(N03)2, МС13-4Н20, (эти и указанные далее соли поставлены компанией «Экрос», Россия).
Для определения биоиммобилизации металлов бактерии выращивали в среде с пониженным В работе для хранения, размножения и поддержания культур эндофитных штаммов B. образованием комплексных соединений с ТМ, г/л (Белимов и др., 2004): глюкоза - 1, сахароза - 1, пептон - 1, дрожжевой экстракт («Экрос», Россия) - 1, NKtNCb - 0,5, MgS04-7H20 - 0,2, NaCl - 0,1, СаС12 - 0,02, FeCl3 - 0,01, рН 6,8-7. Бактерии культивировали при температуре 37оС, используя шейкер лабораторный ПЭ-6410 («Экрос», Россия) при скорости вращения 180 об/мин Через 18 ч культуру центрифугировали 20 мин при 8000 об/мин (СМ-50, «Elmi», Латвия). В надосадочной жидкости и осадке клеток определяли содержание кадмия. Для этого осадок промывали центрифугированием в дистиллированной воде (1:15, мл:мл) и оценивали содержание ТМ как описано далее. Коэффициент распределения кадмия между биомассой бактерий и питательной средой рассчитывали как соотношение концентраций в сухой биомассе и супернатанте (мкг Cd/мг) (Белимов, 2004).
В экспериментах с водорослями суспензии клеток В. subtilis получали выращиванием на шейкере в жидкой полусинтетической среде (Недорезков, 2003). Вначале в асептических условиях замеряли объем культуры. Клетки бактерий собирали центрифугированием (5 мин при 12000 об/мин). Клетки промывали еще раз 0,05%-ным раствором КС1, центрифугируя их, как описано выше. Супернатанты объединяли для экспериментов. Отмытые клетки суспендировали в растворе КС1 объемом, равном первоначальному объему культуры. Инактивирование клеток бацилл вместе с культуральной жидкостью проводили в автоклаве при температуре 120оС и давлении 1,1 атм. в течение 60 мин.
Азотфиксирующие бактерии выращивали 48 ч при 24-26С в чашках Петри на среде, содержащей (г/л): сахароза – 10; KH2PO4 – 1,0; MgSO47H2O – 0,2; ацетат NaСН3СОО – 0,2; цитрат кальция – 0,2; NaCl – 0,1; FeSO47H2O – 0,01; Na2MoO42H2O – 0,001; агар микробиологический – 20, рН 7,5 (Практикум по микробиологии, 2005). Водоросли выращивали на светоплощадке в колбах объемом 1 л на жидкой минеральной среде Прата (Жмур, Орлова, 2007) при температуре 25оС и освещенности 3000 лк.
Сортовая отзывчивость пшеницы на инокуляцию семян клетками эндофитов
Характер ростстимулирующего эффекта бактерий может зависеть не только от вида, но и сорта сельскохозяйственной культуры (Li et al., 2016). В представленной нами работе отзывчивость пшеницы на инокуляцию семян клетками бактерий оценивали с использованием трех сортов: Омская 35, Волжская качественная и Казахстанская 10. Результаты представлены в таблице 2.
Наиболее отзывчивыми на инокуляцию эндофитами оказались растения сорта Омская 35. Так, при обработке семян бактериями в концентрациях 106 кл./мл длина побегов увеличивалась на 28,6% при обработке клетками штамма 26Д и на 40% – штамма 11ВМ в сравнении с контрольными растениями. Стимуляция роста надземной части была сильнее, чем корней. Сорт был отзывчив в широком диапазоне концентраций клеток в бактериальном препарате.
Волжская качественная Побеги 14,3 2,8 2,9 0 -28,6 Корни 5,1 10,5 -1,4 0 -17,0 Различия между показателями обработанных и необработанных бактериями растений достоверны при P 0,05
Проростки пшеницы сорта Казахстанская 10 отзывались в более узком диапазоне концентраций - 105-108 кл./мл штамма 26Д и 105-106 кл./мл штамма 11ВМ. Стимуляция роста корней при обработке семян в концентрации 106 кл./мл была сильнее по сравнению с сортом Омская 35. При превышении концентрации клеток штамма 11ВМ более 108 кл./мл рост проростков подавлялся. Наименьшей отзывчивостью на обработку семян бактериями отличались растения озимой пшеницы Волжская качественная; оба штамма подавляли рост проростков при использовании препаратов с концентрацией 109 кл./мл. Таким образом, в этом эксперименте проявилась различная отзывчивость сортов на инокуляцию разными штаммами эндофитов.
Известно, что органы растений растут согласованно и во взаимной связи, если какой-либо орган поврежден или недоразвит, это компенсируется усилением роста аналогичного органа или возникновением новых органов (Шапошников и др., 2016). Логично полагать, что преобладающий над побегом рост корня у проростка позволяет растению обеспечить его потребности в воде, как основного необходимого компонента для дальнейшего строительства организма, поэтому соотношение показателей длины или массы корень/побег в сторону преобладания корня, согласно цитируемым выше авторам, может служить одним из показателей потенциала адаптации растения при действии неблагоприятных факторов.
Анализ соотношения длин корня и побега у проростков пшеницы (табл.3) выявил, что при обработке семян клетками бактерий штамма 11ВМ в концентрации 109 кл./мл показатель соотношения длин корень/побег у всех сортов увеличивался в сравнении с контрольными растениями и был больше в сравнении со штаммом 26Д. Это согласуется с ингибированием роста проростков пшеницы сортов Казахстанская 10 и Волжская качественная при использовании высокой концентрации клеток бактерий (табл. 2). Таким образом, этот факт согласуется с мнением цитируемых выше авторов и может служить еще одним подтверждением более «жесткого» действия клеток штамма 11ВМ в сравнении со штаммом 26Д, а также признаком включения реакции координации физиологических процессов при наступлении неблагоприятных условий среды, в данном случае увеличении плотности клеток бактерий в инокулюме.
При выращивании растений в почве и использовании оптимальной нагрузки клеток бактерий на семена (106 кл./мл) выявилась закономерность стимуляции роста проростков (табл. 4), сходная с полученной в опытах в чашках Петри. Таблица 3 Соотношение средней длины корня к длине побега у пятисуточных проростков пшеницы при обработке семян клетками эндофитов
При обработке семян пшеницы сорта Омская 35 бактериями B. subtilis штаммов 26Д и 11ВМ длина побегов увеличивалась на 10-12%, длина корней на 41% и 18%, соответственно, в сравнении с контрольными растениями. У растений сорта Волжская качественная бактерии стимулировали рост побегов на 10%, корней – на 24,9% и 18%, соответственно. Длина побегов пшеницы сорта Казахстанская 10 достоверно не отличалась при обработке семян бактериями от показателя у контрольных растений. Обработка семян клетками штамма 26Д стимулировала рост корня на 18%, а 11ВМ – всего на 2%. Стимуляция роста корней при обработке бактериями у всех сортов была сильнее, чем побегов.
В отличие от экспериментов с пятисуточными проростками в чашках Петри, озимая пшеница сора Волжская качественная также хорошо отвечала стимуляцией роста корней, как и яровая культура сорта Омская 35, тогда как разница между обработанными и контрольными проростками сорта Казахстанская 10 в размерах побегов практически отсутствовала, и наблюдалась только стимуляция роста корней.
Особенности формирования эндомикоризы культурными растениями под влиянием эндофитных штаммов бактерий B. subtilis
У необработанных бактериями растений горчицы кадмий в концентрации 10 мг/кг почвы оказывал слабое ингибирующее действие на рост побегов (побеги были, примерно, на 7% короче, чем у контрольных растений в чистой почве), не влияя на рост корней. Отсутствие стимулирующего эффекта у кадмия в небольшой концентрации может быть объяснено способностью этого растения к биоаккумуляции металлов (Pohonu, 2015). При концентрации металла 200 и 500 мг/кг рост побегов ингибировался на 10% и 44%, корней – на 29,7% и 72%, в сравнении с необработанными растениями, растущими в чистой почве (без металла).
При наличии кадмия в почве, хотя и наблюдали ингибирование роста обработанных бактериями B. subtilis 26Д растений по отношению к инокулированным растениям, выросшим в чистой почве (относительный контроль), но по отношению к растениям абсолютного контроля (необработанные и выросшие в почве без металла) отчетливо прослеживалась стимуляция роста. При обработке семян клетками B. subtilis 11ВМ такого эффекта не наблюдали, но при воздействии металла показатели у инокулированных растений были больше, чем у неинокулированных растений. При концентрации металла 200 мг/кг почвы размеры обработанных проростков приближались к таковым у растений, растущих в чистой почве. Дальнейшее увеличение концентрации кадмия в почве вызвало ингибирование роста и побегов, и корней, несмотря на инокуляцию эндофитами. Также как и у растений пшеницы кадмий сильнее подавлял рост корней, в сравнении с побегами.
Растения горчицы оказались более чувствительны к действию свинца, чем растения пшеницы, что, вероятно, связано с относительно небольшой массой проростков этой двудольной культуры, в сравнении с однодольной. С другой стороны, накопление свинца может быть одной из особенностей горчицы, что было выявлено в наших дальнейших экспериментах. Рост корней горчицы вне зависимости от обработки эндофитами ингибировался, в среднем на 30%, уже при концентрации 1500 мг/кг, а при концентрации ионов металла 3000 мг/кг – на 70%, в то время как у растений пшеницы при этой концентрации – на 35%. Обработка семян клетками бактерий штамма 26Д оказывала больший протекторный эффект в сравнении со штаммом 11ВМ.
Горчица была менее устойчива к действию никеля в сравнении с пшеницей, так же, как и менее устойчива к действию свинца. Более значительное превышение средней длины органов во всех вариантах (без обработки и с обработкой семян) в сравнении с контрольными растениями (небработанными, растущими в чистой почве) при действии никеля в концентрации 10 мг/кг было выявлено у пшеницы (увеличение на 34,4%), тогда как у горчицы этот показатель составил 17,6%. В концентрации 200 мг/кг ионы никеля подавляли рост корней горчицы, тогда как у пшеницы наблюдалось превышение показателя длины корней у обработанных проростков, в сравнении с необработанными. Если на проростки пшеницы оба штамма оказывали примерно одинаковое протекторное влияние при действии никеля в концентрации 200 мг/кг, то для растений горчицы обработка семян штаммом 11ВМ может быть предпочтительней, чем штаммом 26Д, так как длина побегов в сравнении с контролем была больше именно в этом варианте опыта.
Выявленный ростстимулирующий эффект небольших концентраций металлов согласуется с данными литературы. Известно, что металлы в низких концентрациях могут стимулировать, а в высоких оказывать негативное действие на рост растений (Квеситадзе и др., 2005; Chibuike, Obiora, 2014). Отсутствие стимулирующего эффекта ионов кадмия в экспериментах с растениями Sinapis alba, может быть объяснено способностью этого вида к биоаккумуляции металлов (Pohonu, 2015) и проявлением токсического эффекта кадмия на рост при более активном его поступлении в растения. Способностью к биоаккумуляции может быть объяснена и большая по сравнению с растениями пшеницы, чувствительность горчицы к действию свинца и никеля. Корневая система у всех исследованных растений была более чувствительной к действию ТМ в сравнении с побегами, что согласуется с мнением других исследователей: при выращивании растений в присутствии тяжелых металлов их токсическое действие в бльшей степени проявляется в отношении роста корней, поскольку именно в них задерживается и инактивируется значительная часть поступивших в растение токсичных ионов (Титов и др., 2014; Liu et al., 2008). Торможение роста побегов наблюдается, как правило, при более высоких концентрациях тяжелых металлов, чем корней (Титов и др., 2014).
Растения, семена которых были предварительно обработаны клетками эндофитов B. subtilis 26Д и 11ВМ, оказались более устойчивыми к действию ТМ, что, вероятно, связано со способностью этих бактерий продуцировать различные биологически активные вещества, в том числе и фитотогормоны – стимуляторы роста (Архипова и др., 2006; Мелентьев, 2007), а также улучшать минеральное питание растений (Хайруллин и др., 2007). Известно, также, что PGPB способны повышать устойчивость растений к действию тяжелых металлов благодаря снижению уровня окислительного стресса, усилению активности антиокислительных ферментов (Cho, Seo, 2005; Iannone et al., 2010; Hassan, Mansoor, 2014; Титов и др., 2014; He et al., 2014). Если фитогормон-подобная активность эндофитных штаммов B. subtilis 26Д и 11ВМ была ранее изучена (Иванчина, 2010; Лукьянцев, 2010;. Егоршина и др., 2012), то практически не исследованным оставался вопрос влияния этих эндофитов на антиоксидантную систему защиты растений при действии стрессовых факторов. В связи с этим далее мы оценивали активность каталазы, пероксидазы, накопление фенольных соединений, уровень малонового диальдегида – как косвенного свидетеля процессов сохранения целостности клеточных мембран через предотвращение перекисного окисления липидов, в тканях необработанных и инокулированных эндофитами проростков пшеницы.