РАДИОИНДИКАТОРНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ПОГЛОЩЕНИЯ РУБИДИЯ И СТРОНЦИЯ РАСТУЩИМИ И ФУНКЦИОНАЛЬНО-ЗРЕЛЫМИ ЗОНАМИ КОРНЯ КУКУРУЗЫ Евгения, Анатольевна Бибергаль

Введение к работе

Актуальность проблемы. Проблема поглощения веществ корнем^ одна из важнейших проблем физиологии растений. Изучение работы корня интересно тем, что в фазе растяжения происходит формирование морфологического и метаболического аппарата поглощения и ассимиляции неорганических соединений.

Связь метаболизма клетки на различных стадиях роста и развития с процессом проникновения веществ в клетку исследована слабо.

При расчете данных биохимических исследований на «среднюю клетку» картину жизнедеятельности в клетках корня представляется следующей: иеристематическне клетки наиболее метаболически инертны, с переходом к зоне растяжения обмен веществ постепенно усиливается и становится максимально активным у клеток зоны дифференциации.

В отношении поглощения было отмечено, что оно наиболее интенсивно в зонах наиболее интенсивного роста клеток (Обручева, 1965). Наблюдается взаимосвязь между процессом формировании тканей корня и выполнением ими функций поглощения и транспорта веществ. Полное признание единства структуры и функции является методологической основой, большинства современных работ в этой области. Изучение процесса поглощения было связано нами с изучением анатомического строения корня и уточнением границ, зон корня.

При работе с изолированными растительными тканями становится актуальной проблема их «старения» (Kc-marnura, ffirata, 1974; Leouard, Hauson, 1973). Выяснение сущности этого процесса имеет большое значение, поскольку изменения в дыхании клеток и накопление ими ионов могут оказаться либо результатом изменений в меТЬболизме клеток, либо артефактом.

Изучение этих вопросов имеет важное практическое и теоретическое значение.

Цель и задачи исследований.' Цель наших исследований заключалась в изучении следующих вопросов:

1. Изучение формирования поглотительного аппарата клеток корня, а также особенности накопления ионов^КМ iL.Sr²-'

-*>- - *

'.: } 1

клетками различных зон корня двухдневного проростка кукурузы.

1. Изучение накопления ионов Rb⁺ и Sr²⁺ клетками зон разновозрастных корней кукурузы и связи накопления с энергетикой клеток корня.

2. Изучение транспортной деятельности корня,

3. Изучение анатомических особенностей корня кукурузы^

4. Изучение сущности процесса «старения* и его влияния на накопление ионов Rb+ и Sr²*.

Объект исследования. Исследования по изучению накопления ионов проводились на отрезках корней интактных растений кукурузы сорта «Стерлинг» (элита). Кукуруза была выбрана по двум причинам. Во-первых, это широко распространенная полевая культура; во-вторых, чаще всего используемый объект при изучении корневого питания.

Научная новизна работы. Научная значимость результатов исследования заключается в том, что изучение поглощения ионов непосредственно связывается с изучением анатомии корня и четким выделением функциональных зон корня. Новый динамический метод определения поглотительной способности растительного материала позволил обособить процессы накопления, происходящие в отдельных зонах, от процессов транспорта. Использование современного оборудования в-совокупности с современными методами исследования позволило впервые обнаружить изменение механизма поглощения ионов Rb⁺ вдоль по корню двухдневного проростка кукурузы.

Практическая ценность к реализация результатов исследования. Результаты исследования могут быть использованы для построения общей картины изменений в клетках корня в процессе их роста, при разработке методик экспериментов по изучению поглотительной деятельности корня. Данные об изменении скорости поглощения ионов корнями растений различного возраста имеют прикладное значение для обоснования сроков внесення минеральных удобрений.

Апробация работы. По теме диссертации были сделаны доклады на XI конференции молодых ученых и специалистов ВИУА 1J—12 апреля 1977 г. и на II Всесоюзном симпозиуме по ионному транспорту в растениях, г. Черкасы, 1977 г.

Объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, включая II рисунков; 33 таблицы и 3 фотографии. Список литературы включает 246 наименований, в том числе 139 иностранных.

Методики исследований

I. Семена кукурузы стерилизовали. Для равномерного про-эастання их заливали на 5 минут горячей водой при 60 и на ! часа теплой — 45. Проращивали семена в термостате, в тем-

ноте, при 28С, в кювете на фильтровальной бумаге. Замачивание и прорашнванпе проводили на деминерализованной ьоде.

Для изучения поглощения на корнях недельных и двухнедельных растений двухдневные проростки высаживались на парафинированные марлевые сетки в сосуды объемом 2,5 л с 1/10 раствора Кнопа, по 50 растений на сосуд. Смену раствора проводили через неделю, так как соотношение массы корней и раствора было достаточно широким (1 :800). За сутки до эксперимента растения высаживали на деминерализованную воду.

Растения выращивались при 12-часовом световом дне, освещенности 10—12 тыс. люкс, создаваемой лампами Л Б-80, и температуре 20 ± 1.

2. Подсчет числа клеток по участкам корня двухдневного
проростка проводился модифицированным методом Брауна
(Brown, 1951).

Отрезки корня, по 20 штук в каждой из трех повторностей, фиксировали реактивом Бродского {уксусная кислота :фор-мальдегид 10% : спирт 96% = 1 : 10 : 4, в течение часа и маце-рировали в 2 мл 6 н, НО на кипящей водяной бане (1—2 мин.). После встряхивания мацерат разбавляли деминерализованной водой и отмывали от кислоты до рН 4—5 путем многократного центрифугирования. Затем окрашивали красителем «светло-зеленым» (10 мин). После отмыва избытка красителя клетки считали в камере Фукса-Розенталя, Перед началом подсчета объем мацерата доводили до 6 мл. Исходя из объема камеры и объема мацерата, рассчитывали число клеток, приходящееся на один отрезок корня.

3. Подсчет числа корневых волосков основан на определении глубины резкости микроскопа, что позволило вычислить площадь, с которой они просчитывались. Число и длина корневых волосков определялись при помощи объект-микрометра.

4. Анализ анатомического строения корня был основан на определении заложения проводящей системы корня путем последовательного снятия тонких срезов, их окрашивания и фотографирования. Отрезки корня длиной 7 мм и общей длинй 49 мм фиксировались реактивом Бродского (I час), после чего делали проводку до парафина. Толщина срезов — 10 мкм. Срезы, приклеенные к стеклу белком, отмывали от парафина.

Окраска для фотографирования проводилась проционовы-ми красителями. Срезы окрашивают 0,1% раствором ярко-голубого RS в фосфатном буфере рН 5,6—6,0 при 55—60 в течение часа. После этого срезы тщательно прополаскивала несколькими порциями дистиллированной воды и окрашивали 0,1 % раствором проционового ярко-красного 2BS в 1% рас-

творе соды рН 10,5, в течение 20 минут при комнатной температуре. После промывания в дистиллированной воде срезы заключали в бальзам.

Ярко-красным красителем окрашиваются: слой пектиновых веществ, окружающих кончик корня, крахмальные зерна, оболочки клеток, цитоплазма, ядра и ядрышки, то есть углеводы и белки. Проционовый ярко-голубой окрашивает только белки. Поэтому после двух окрашиваний белки имеют лиловый цвет, а углеводы — ярко-красный. Фотографирование проводилось при увеличении ХІ2 и Х46 на черно-белую бумагу для поляроида, тип 107, на микроскопе НУ-2.

5. Определение накопительной (сорбционной) способности растительной ткани проводили динамическим методом в соче^ тании с методом радиоактивных индикаторов. Эксперименты проводились на отрезках корней длиной 1 мм (зоны меристемы, растяжения и корневых волосков). Для загрузки отрезков корней были использованы стеклянные колонки диаметром 7 мм с краном. Толщина стекла — I мм. В колонку, наполненную водой, помещали маленький кусочек ваты, 2 см кварцевого песка и на него растительный материал. Две стеклянные бусины, опущенные сверху, исключали перемещение отрезков корня при смене раствора. Поглощение меченых ионов рубидия (^Rb) и стронция (⁸⁹Sr) происходило из проточного аэрируемого раствора.

Регистрация излучения меченого элемента проводилась при помощи торцового счетчика Т-25-БФЛ с толщиной окна 1,0— 1,2 мг/см². Сигнал со счетчика подавался на радиометр Б-2, интегральную схему ИСС-3 и самописец КСП-4. Состав растворов, из которых осуществлялось поглощение, был следующим: в варианте с рубидием — глюкоза 10 г/л; Rb(^8eRb)Cl 10~⁴М, СаСЬ 10^_4М; в варианте со стронцием—глюкоза 10 г/л, Sr(^8aSr)Cl2 Ю-*М. Присутствие в среде кальция необходимо для поддержания нормального функционирования мембранных структур. Однако присутствие кальция в варианте со стронцием искажало бы картину поглощения последнего в связи с конкуренцией этих ионов за переносчик. На поглощение катиона большое влияние оказывает сопутствующий анион. Поскольку во всех опытах нами были использованы хлористые соли рубидия и стронция, то и для кальция были выбрана эта форма соединения.

Глюкоза использовалась в качестве дыхательного субстрата. Расчет количества элемента, поглощенного клетками корня, проводился по формуле (1):

Н-т» где т_к — количество элемента, в мкг, поглощенного отрезка-

ми корней; Шр — количество меченого элемента, в мкг; содержащегося в объеме колонки перед щелью коллиматора, в отсутствии растительного материала; К — величина калибровки на ленте самописца, в см, соответствующая величине ш_р; Н — величина отклонения пера самописца от прямой, отсекающей (1—d) часть калибровки, и соответствующая количеству элемента, поглощенного корнями, d — доля объема, занимаемого корнями в колонке.

Зная плотность упаковки корней в колонке и объем перед щелью коллиматора, можно рассчитать количество поглощенного вещества в мкг/100 мг сырой массы корней:

где т_к и d— известные величины, V —объем перед щелью коллиматора, находится расчетным путем и в наших условиях равен 0,2 см³.

В результате преобразований формула (1) расчета количества поглощенного элемента в мкг/100 мг сырой массы корней принимает вид: для стронция —

для рубидия —

_D І.ТЬН- 100
^Hi МІС »

где М — масса растительного материала, находящаяся против щели коллиматора и равная M = V*d.

Для сравнения поведения К к Rb изучали кинетику накопления этих ионов клетками зоны корневых волосков в течение трех часов. Состав раствора: глюкоза 10 г/л, СаС1_г 10^-4М К(^4ЇК)СІ- 10~*М. Расчет накопленного элемента проводился по формуле:

D 4,7-Н. 100

6. Определение связи накопления ионов с процессом «старения» проводилось динамическим методом. Отрезки корней выдерживали в течение 3 и 6 часов («старение») в колонках в проточном аэрируемом растворе следующего состава: в варианте с рубидием — глюкоза 10 г/л, СаСЬ ІСММ; в варианте со стронцием — глюкоза 10 г/л, после чего в колонки подавался раствор того же состава, но с меченым элементом. Контролем служили отрезки корня, получившие раствор, с меткой сразу же после отделения. Меченый раствор пропускали в течение 3 часов.

Поскольку одной из вероятных причин «старения» счита-

гот загрязненность растительного материала микроорганизмами, нами был проведен ряд экспериментов в присутствии антибиотиков; пенициллина и стрептомицина — по 30 мг/л и хлорамфеникола — 5 мг/л.

Антибиотики присутствовали в растворах в течение всего времени эксперимента, то есть 3, 6 и 9 часов. Параллельно была проведена серия опытов без антибиотиков.

7. Проводилось определение количества микроорганизмов
на корнях двухдневных проростков кукурузы.

Навеска отрезков корней (1 г) зоны корневых волосков помещалась в колонку по описанной выше методике. В течение 6 часов через одну колонку пропускали аэрируемый раствор глюкозы 10 г/л, СаСЬ— 10^-,М, пенициллина, стрептомицина и хлорамфеникола. Через другую колонку — раствор того же состава, но без антибиотиков. Затем корнн встряхивали 10 мин в конической колбе со 100 млводопроводной воды, отбирали 10 мл в колбу с 90 мл воды, опять встряхивали и т. д. до 4 раз. Из каждой колбы брали по 0,05 мл раствора для посева на крахмало-аммиачный агар в чашках Петри. Состав питательной среды:

(NH₄)₂S0₄ — 2 г СаСОз —3 г

КаНРО* —1 г Крахмал растворимый — Юг

MgS0₄ —1 г Агар —25 г

NaCl — I г Вода — 1 л.

Через 5 дней проводили подсчет колоний.

8. При определении связи накопления ионов Rb⁺ и Sr²⁺ с
метаболизмом различных зон корня были использованы азид
10^_3М, арсенит 2* 10~³М и низкая температура.

При работе с зоной меристемы осторожным обтиранием кончика корня фильтровальной бумагой удаляли корневон чехлнк, так как сорбция на нем сильно искажала картину накопления ионов, кроме того, присутствие чехликов затрудняло фильтрацию раствора через растительный материал.

Отделенные корни выдерживали два часа в колонках в проточном, растворе с ингибитором, после чего подавался меченый раствор (также с ингибитором).

Поскольку ионы Na*, присутствующие в растворе, могут оказывать ингибирующее действие на накопление Rb⁺ и Sr²⁺ клетками корня, мы сочли необходимым установить максимальную концентрацию этого нона, при которой он еще не угнетает поступление Rb⁺ и Sr²⁺ в клетку. С этой целью был введен вариант, где вместо ингибитора использовался NaCl в концентрациях 1Q~^SM и 2- 10~³М. Все растворы готовились на деминерализованной воде. рН 5,6—5,75.

9. Определение поглощения ионов Rb⁺ и Sr²⁺ целыми раз-
6

новозрастными растениями кукурузы проводили по анализу растительного материала и растворов.

Десять проростков в возрасте 2 дня, 7 дней и 14 дней, подобранных по длине корня, помещали на меченый раствор при температуре 22 и 3. Объем меченого раствора— 125 мл. Состав растворов: 1) глюкоза 10 г/л, СаОг— 10^_4М, Rb(^e6Rb)Cl — 10-"М; 2) глюкоза 10 г/л, Sr(⁸⁹Sr)CI₂— 10"⁴M. Корневые чехлики удаляли, а проростки помещали на 3 часа на активный раствор, затем переносили на 3—5 минут на деминерализованную воду для удаления ионов с поверхности и из свободного пространства корня. Проростки делили на побег, зерно и корень. Корни брали целиком, а также разделяли на зоны, высушивали и взвешивали. Активность растертого растительного материала определялась радиометром ПП-8 и счетчиком Т-25-БФЛ. Для расчета количества иона, поглощенного корнями, готовили эталоны. 0,3 мл исходного активного раствора высушивали на фольговой чашечке с растертым нерадиоактивным материалом. Зная удельную активность элемента в эталоне, рассчитывали содержание элемента в образцах. Для контроля проводилось дополнительное определение количества поглощенного иона по убыли активности из раствора.

10. Определение транспорта ионов из различных зон корня проводили путем наложения 1 мм поясков фильтровальной бумаги, смоченной активным раствором. Состав раствора: глюкоза 10 г/л, СаСЬ—10-⁴М, Rb(⁸⁶Rb)CI—10"⁴М. Края пояска смазывали тонким слоем вазелина, чтобы предотвратить передвижение активного раствора по поверхности корня. Поясок накладывали на 15 минут, в течение которых его периодически смачивали. Корень находился в условиях влажной камеры. После снятия пояска корень погружали в деминерализованную воду. Через 3 часа его лиофильно высушивали на лиофилизаторе типа «Криолайзер». Диаграмму распределения радиоактивности вдоль по корню снимали на Актиграфе-3. С части корней после снятия пояска удаляли кору, затем отдельно высушивали кору и стель и снимали диаграммы.

И. Проводилось определение содержания Са и К по зонам корня двухдневного проростка кукурузы. Отрезки корня высушивали.

Навески растертого растительного материала сжигали в кварцевых пробирках с концентрированной азотной кислотой. Соотношение навески и кислоты 1 : 10. По мере озоления в лробиркн добавляли кислоту. Позрачныи раствор выпаривали досуха. Осадок переносили 5% НО в колбы объемом 10 мл. Определение Са и К в исходных и контрольных растворах проводили на атомно-абсорбционном спектрофотометре марки «Unikatm. Весь цифровой материал, полученный в экспериментах, подвергали статистической обработке.