Получение и характеристика 2-дезоксид-Д-глюкоза резистентных мутантов Chlorella с нарушенной системой метаболитной регуляции фотосинтеза Шитова, Лариса Александровна

Введение к работе

Атуальяосшь. Изучение генетического контроля и молекулярных механизмов эндогенной регуляции фотосинтеза с участием различных внутриклеточных мессенжеров (фптогормснов, фнтохромной системы, ненов, метаболитов) кзляется одной из актуальных проблем, которой уделяется большое внимание исследователями различных лабораторий (Мскроносов, 1381: 1382; Семенекко, 1375; 1982: 198-8; StiPenenko et al., 1S84; Пронина, 1992:. Ладыгин, 1994; Chiie, 1988; Sheen 1S90). Интерес к этой проблеме, находящейся на стыке физиологии и генетики фотосинтеза, обусловлен тем, что многие внутренние факторы и регуляторкые системы в растении лежат в основе адаптивных свойств растения и могут ограничивать функцию фотосинтеза и продуктивность растений. Особый интерес представляет выяснение регуляторного действия в хлоропласте конечны:-: продуктов фотосинтетическсго восстановления углерода. С помощью стереохпмических аналогов (2-дезок-си-Д-глккоез, 3-0-метидглккоза) показано,что глккеза вкгьшает в хлоропласте глубокое, но полностью обратимое подавление синтеза рРНК, ряда ферментов цикла Кальвина, а также ключевых белков, участвующих в организации фотохимических систем и 5ТЦ хлоропласта (Seir;ener.ko et al., 1S84; Зверева, 1930; Купцова, 1993).

В последнее Еремя на примере ряда ключевых генов фотосинтеза ГрзЬА и р=ЬП генов), показано (Lefcedeva, Senenenko, 1S92), что глюкоза вызывает специфическое педавление экспрессии (образование первичного транскрипта) psbA и pstD генов в отличие от экспрессии нефотссинтетических генсз (desA гена).

Глюкозный эффект негативной метабслитной регуляции экспрессии генома хлоропласта является, таким образом, эндогенным регуляторним механизмом, который ограничивает сверхсинтез структурных компонентов хлоропласта и продуктов фотосинтеза. 3 физиологическом смысле этот механизм выполняет важную функцию, игран рель кенцево-. го исполнительного механизма донерно-акцепторных отношений между фотосинтетическим аппаратом и аттрагпрукщими органами растении (3eir,er.enko et al., 1384).

Вместе с тем молекулярные механизмы регуляторного действия

глюкозы в хлоропласте остаются неясными. В связи о этим представляет бсльЕой интерес исследование возможности создания селективней системы отбора и получение мутантов с нарушенной системой метаболитной регулящіи экспрессии генома хлоропласта.

Такие мутанты, - с -нарушенным feed- back механизмом регуляции фотосинтеза, представляют интерес, как модельные объекты для выяснения молекулярной организации регуляторного действия глюкозы з хлоропласте и как объекты биотехнологии.

Цель и задачи исследования. Целью работы яелялось получение мутантов с нарушенной системой метаболитной регуляции фотосинтеза конечными продуктами фотосинтетического восстановления углерода (глюкоза) и изучение их физиолого-биохимических свойств . Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод и получить мутанты Chlorella устойчивые к действию стереохимическогс аналога глюкозы (гдезокси-Д-глюкоза) (2дДР^Кез- мутанты).

2. Исследовать, способность 2дДГ^Кеэ мутантов к гетеротрофному росту на среде с глюкозой и выявить мутанты с нарушенной системой метаболитной регуляции фотосинтеза (2ддТ^КезС1?3- мутанты), а также мутанты с нарушенной системой транспорта экзогенной глюкозы в клетку (2дДГ^КезБТ- мутанты) -

3. Провести сравнительное изучение активности поглощения экзогенной глюкозы и ее аналогов у исходной формы Chlorella , 2дДГ^ЯвзСК5 и 2дДГ^Кез GT мутантов.

4. Изучить влияние аналогов глюкозы на рост, фотооинтетичес-коє выделение кислорода, синтез пигментов, активность хлорспласт-ной карбоангкдразы у 2дДГ^г-^езСЕ5 мутантов.

5. Исследовать мутанты с нарушенной системой метаболитной регуляции фотосинтеза (2дДГ^Ке!3 CIS - мутанты) на их способность к гипертрофированному накоплению продуктов фотосинтеза.

8. Исследовать стабильность признаков 2дДТ^КезСКЗ мутантов в условиях многократных последовательных пересевов в отсутствии селектирующего (2дДГ) фактора.

Научная вовиава работы. Разработан способ и впервые выделены мутанты Chlorella -с нарушенной системой негативной метаболитной регуляции фотосинтеза конечным продуктом фотосинтетического восстановления углерода ,глюкозой, Chlorella 2дДГ^кез CR3 мутанты. Исследовано поглощение экзогенной глюкозы и ее аналогов в клетки 2дДГ резистентных мутантов Chlorella и впервые показано, что устойчи-

- о -вооть клеток микрсводорослей к репрессирующему действию аналогов глюкозы меже? быть обусловлена мутациями, вызывающий нарушение системы активного транспорта экзогенной глюкозы а клетку (2дДГ^КезиТ-мутанты) и нарушением "глюкозного эффекта" метаболитной регуляции экспрессии генов хлоропласта (2дДТ^аезСйЗ-мутзнтсЕ). Показано, что в отлички от исходного штампа у дДТ^ЕезСЕЗ мутантов аналог глюкозы не Еыгывает полного подавления синтеза пигментов, активности хлорсплзстной карбоангидразы и фотссинтеткческого выделения кислорода- Впервые показано, что нарушение в системе метабс-лпткой регуляции фотосинтеза конечными продуктами восстановления углерода приводит к гипертрофированному накоплению зесимилятов в хлоропласте, что позволяет рассматривать эти мутанты как суперпродуценты зесимилятов. Исследована стабильность признаков 2дДГ^Нез CFS мутантов и показано, что все свойства изначально присущие зтим мутантам, устойчивы я сохраняются без селектирующего (2лДГ) фактора в условиях многократных последовательных пересевов культур.

Пракгичеспая давность рзбелш. Подученные результаты могут быть использованы для развития исследование з области молекулярных механизмов эндогенной регуляции фотосинтеза, а также представляют интерес для бпотехнолегических целей: селекции форм растений, отличающихся высокой Фотссинтетическсй продуктивностью.

Лпробвиця работ. Результаты работы докладывались на международной 15 конференции ФЕБ'О (Москва, 1984), на 2, 3 Всесоюзных конференциях молодых ученых по физиологии растений (Москва, 1985; Петрозаводск, 1988), на Всесоюзной конференции молодых ученых "Современные проблемі; биохимии и физико-химической биологии" (Москва, 19В6), на 3 съезде Всероссийского обсеотза физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), на 5-ой Международной конференции по прикладной альгологии (Тржебон, 1993).

Пубтиащт. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзоре литературы, из 4 глав экспериментальной части, заключения, списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 21 рисунок и 7 таблиц.

Б качества объекта исследования использовали зеленую одноклеточную водоросль Chiorella_vvulgaris Beiger. var. vulgaris IPPAS C-1 (штамм-Косикова, известен как Chlorella sp.. К) из. коллекции культур одноклеточных водорослей Института физиологии растений РАН - IPPAS (Владимирова, Маркелова, 1983; Семененко, 1991).

Данный штамм относится к термофильным, высокопродуктивным и фотоустойчивым штаммам с хорошо изученными фигиолого-биохимическими характеристиками. Существенным яеляєтся то, что основные результаты по негативной метаболитной регуляции фотосинтеза были выполнены на этом же штамме.

Выращивание водорослей осуществляли в стеклянных сосудах объемом 250 мл и толщиной слоя суспензии 20 мм (Дилов, Семененко и др., 1969) и в специальных стеклянных микроячейках с толщиной слоя суспензии 12 мм (Семененко, Афанасьева, 1972) и объемом 19 мл . В качестве питательной- среды выращивания водорослей использовали среду Таммия (Владимирова, Семененко, 1952). Для посевов на чашки Петри использовали агаризованную среду Таммия Культуру выращивали до плотности 70- 100 млн. мл^-1, после чего вносили аналог глюкозы 2-дезокси-Д-глюкозу (фирмы Merck, Германия) в конечной концентрации 0,25 %. Стерилизацию 2дДГ осуществляли фильтрацией через мембранный фильтр. Отмывание от аналогов проводили двукратным центрифугированием в стерильных условиях и последующим ресуспендировани-ем клеток в свежую питательную среду Таммия. Эффект действия аналога глюкозы оценивали по изменения скорости роста культур, содержания хлорофилла и интенсивности фотосинтетического выделения кислорода .

Скорость реала культур определяли по изменению численности клеток в популяции микроводорослей посредством пря.\50го счета числа клеток под микроскопом " Ergaval " в камере Горяева, так же нефе-лометркчёски по оптической плотности суспензии на предварительно проградуированном фотоэлектроколориштре ФЭКМ-1954 с зеленым фотофильтром (Владимирова, Семененко, 1962).

Продуктивносте культуры определяли по накоплению сухой биомассы и по оптической плотности суспензии на градуированном " Specol " при 750 нм.

Морфологические изменения клеток контролировали с помощью микроскопа " Ergaval ".

Pasusp клеток и ик распрвделввие по размерам з популяции мик-рСБОдорооли определяли о помощи счетчика Coulter Counter ZM ("Ccultronics France", Франция).

Содержание углБзсдов определяли в сзежесобранной биомассе методом "фенол-серная кислота " (Dubois et al., 1355) 2 модификации.

АктцЕНсапь карбсангидрааы определяли в гомогенате и 20 фракции растворимого белка, полученного после центрифугирования гомогенат а при 3,5,14 к 18 тыс g б течение соответственного 5,10,50 и 60 мин и расчитывали на объем суспензии и единицу белка. Активность карбоангидрзы измеряли электрометрическим методом по изменению начального значения рК в процессе реакции гидратации двуокиси углерода. Активность фермента расчітшал;: в относ, ед. по формуле E-iO (Tq/T-I ), где "о~ время изменения рН зкзиматическсй реакции на мл суспензии или мг белка (Sickly, Ghazarifar et.al., 1364}.

Интэнсизность фотосинтеза определяли по выделению кислорода. Выделение кислорода намеряли непрерывно б течение роста культур с помощью датчика парциального давления растворенного кислорода по открытой схеме на специально разработанной установке (Семенэнко, Опшигкпй и др., 1972). СЕ-тозые кривые фотосинтеза снимали амперо-метрическкм методом по выделению кислорода з широком диапазоне освещенности клеток. Плотность суспензии в измерительной ячейке составляла 18 - 20 10^s млн/мл.

АктиЕяостъ поглощения экзогенной елтаоеы с ее аналогов клет-камп Chlcrella измеряли по описанной ранее методике (Холодова к др., 19S2) о использованием ¹⁴С меченных глюкозы и ее аналогов : З-О-метилглюковы к 2-девокси-Д-глюкозы. Опыты проводили на суспензии клетск микроводорослей, которые предварительно перед экспозицией о мечеными сахараш: зыдердивали в темноте в течение 20-24 чао. на 0,2 мМ растворе CaCia.