Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Фотосинтетические пигменты (обзор литературы) 14
1.1. Структура и функции хлорофиллов 16
1.2. Структура и функции каротиноидов 21
1.3. Пигмент-белковые комплексы и фотосинтез 30
1.4. Роль пигментов в устойчивости фотосинтетического аппарата растений 35
1.5. Растительные пигменты как биологически активные соединения 41
Заключение к главе 1 43
Глава 2. Район, объекты и методы исследования 45
2.1. Общая характеристика климатических условий и растительности района исследований 45
2.2. Объекты исследования 49
2.3. Определение содержания и соотношения хлорофиллов и каротиноидов 52
2.4. Характеристика пигмент-белковых комплексов 55
2.5. Изучение уровня конверсии пигментов ксантофиллового цикла 56
2.6. Статистическая обработка данных 58
Глава 3. Фотосинтетические пигменты в растениях и лишайниках природной флоры (эколого-физиологический анализ) 59
3.1. Содержание и соотношение пигментов, особенности пигментной системы наземных растений разных таксонов, жизненных форм и широтных групп 60
3.2. Пигментный комплекс водных и прибрежно-водных макрофитов 74
3.3. Фотосинтетические пигменты в лишайниках таёжной зоны 80
3.3.1. Содержание хлорофиллов и каротиноидов в талломах лишайников 80
3.3.2. Сезонная динамика содержания пигментов в талломах Lobaria pulmonaria L 82
Заключение к главе 3 87
Глава 4. Пигментная система растений, произрастающих при разном световом режиме. Роль пигментов в адаптации растений к световым условиям обитания . 89
4.1. Состояние пигментного аппарата растений Ajuga reptans L. в связи с адаптацией к световым условиям произрастания 90
4.1.1. Содержание и соотношение хлорофиллов и каротиноидов в листьях 90
4.1.2. Влияние светового режима местообитания на динамику и уровень конверсии пигментов ксантофиллового цикла 94
4.2. Влияние светового режима местообитания на состав пигментов и уровень конверсии каротиноидов ксантофиллового цикла у растений Plantago media 100
4.2.1. Содержание и соотношение хлорофиллов и каротиноидов в листьях Plantago media в условиях разной освещенности 103
4.2.2. Влияние светового режима на содержание каротиноидов и функционирование ксантофиллового цикла 104
4.3. Пигментный аппарат растений Gymnadenia conopsea L. из разных ценопопуляций 108
Заключение к главе 4 113
Глава 5. Пигментный комплекс летне-зимне-зелёных трав, вечнозеленых кустарничков и древесных растений 115
5.1. Сезонная динамика содержания и соотношения хлорофиллов и каротиноидов в листьях вечно- и зимне-зеленых видов 116
5.2. Закономерности изменения содержания и состояния пигментов ксантофиллового цикла у летне-зимне-зеленых травянистых и вечнозеленых хвойных в годичном цикле 121
Заключение к главе 5 130
Глава 6. Фотосинтетические пигменты и пигмент-белковые комплексы летне-зимне-зеленых травянистых растений (на примере Ajuga reptans L.). 132
6.1. Пигмент-белковые комплексы листьев активно вегетирующих растений Ajuga reptans L. 133
6.2. Сезонные перестройки структуры пигмент-белковых комплексов листьев и хлоропластов 136
Заключение к главе 6 145
Заключение 146
Выводы 152
Список литературы 154
Приложения 205
- Структура и функции хлорофиллов
- Содержание и соотношение пигментов, особенности пигментной системы наземных растений разных таксонов, жизненных форм и широтных групп
- Влияние светового режима местообитания на динамику и уровень конверсии пигментов ксантофиллового цикла
- Сезонные перестройки структуры пигмент-белковых комплексов листьев и хлоропластов
Структура и функции хлорофиллов
Окраска листьев зеленых растений зависит от присутствия в них доминирующих пигментов – хлорофиллов, пропускающих или отражающих зеленые лучи. Содержание хлорофиллов определяет количество поглощённой фотосинтетически активной радиации (ФАР) и интенсивность фотосинтеза. Именно хлорофилл выполняет функцию главного фоторецепторного пигмента в фотосинтезе. В ассимилирующих органах (листьях) хлорофилл содержится в виде хлорофилловых зёрен, составляет от 0.6 до 1.2% от сухой массы, и представляет собой воскообразное зеленое вещество, которое в воде даёт коллоидальный раствор.
Аминолевулиновая кислота (АЛК), которая у растений и водорослей синтезируется из глутамил-тРНК под действием ферментов (глутамил-тРНК-синтазы и глу-тамил-тРНК-редуктазы), является предшественником хлорофиллов (Porra, 1997; Willows, 2004; Moulin, Smith, 2005; Reinbothe et al., 2010). Вначале происходит конденсация двух молекул АЛК и образуется первичный монопиррол, который впоследствие превращается в коньюгированный и окрашенный порфирин. При включении молекулы железа (Fe) в порфирин образуется железопорфирин (гем), который необходим митохондриям, хлоропластам, цитоплазме. С момента включения молекулы магния (Mg) в протопорфирин начинается магниевая ветвь биосинтеза пигментов; на этом этапе требуется АТФ. В ходе дальнейших преобразований образуется протохлоро-филлид – предшественник хлорофилла. Для фотозависимой трансформации прото-хлорофиллида в хлорофилл требуется формирование комплекса с белком. За биосинтез хлорофилла отвечают 86 ядерных генов. Одни из этих генов контролируют процесс синтеза хлорофиллов, другие – кодируют синтез пигмент-белковых комплексов.
Известно около 100 различных структурных форм хлорофиллов (Porra et al., 2014). Хлорофиллы представляют собой Mg-содержащие порфирины (рис. 1). В составе молекулы Хл четыре пиррольных кольца соединены метиновыми мостиками, образуя макроцикл (порфириновое кольцо). В большинстве фотосинтетических систем расположенный в центре хлорофилльного макроцикла Mg-ион связан через координационные связи с четырьмя атомами азота пиррольных колец. У высших растений и водорослей обнаружены хлорофиллы а, b, с, d. Хл а – наиболее часто встречающийся пигмент фотосинтеза, который содержится во всех фотосинтезирующих растениях, включая водоросли и цианобактерии. Хл b представлен у высших растений, зеленых водорослей и эвгленовых. Он отличается от Хл а тем, что в пиррольном кольце у 3-го углерода вместо метильной (–СН3) находится формильная (–СНО) группа. У бурых и диатомовых водорослей, а также динофлагеллят присутствует Хл с, который отличается от Хл а отсутствием фитольной группы у 2-го атома углерода. В отличие от Хл а, обнаруженный в красных водорослях и некоторых цианобактериях Хл d характеризуется наличием группы (–О-СНО) у 2-го атома углерода в пиррольном кольце. В строматолитах (ископаемых остатках цианобактерий) был обнаружен Хл f, способный поглощать инфракрасное излучение до 720 нм (Chen et al., 2010).
Свойства хлорофилла изучены довольно подробно (Tanaka, Tanaka, 2007). Структура молекулы хлорофилла хорошо приспособлена для выполнения основных функций в фотосинтезе – поглощения, запасания и преобразования энергии.
В перенос электронов при фотосинтезе вовлекается только небольшая часть молекул хлорофилла. Остальные его молекулы входят в состав светособирающего комплекса (ССК) и антенных комплексов фотосистем (ФС). Среди основных пигментов существует две формы хлорофилла а, их обозначают Р690 и Р700. Хл а является компонентом коровых комплексов и периферической антенны фотосистем. Хл b является компонентом периферической антенны фотосистем и входит в состав светосо-бирающего комплекса фотосистемы II (ССКII ФСII). Хлорофиллы выполняют две ключевые функции в фотосинтетических системах: участвуют в поглощении световой энергии и передаче электронов на реакционные центры (РЦ). В этих центрах, которые содержат лишь небольшую часть общего хлорофилла а, осуществляются первичные фотосинтетические реакции.
Максимумы поглощения хлорофиллов расположены в сине-фиолетовой ( 420 нм) и красной ( 670 нм) областях спектра. Благодаря тому, что зеленый свет хлоро-филлами отражается, растения имеют специфическую зеленую окраску. Чтобы эффективно поглощать световую энергию молекулы хлорофилла сгруппированы по несколько сотен и связаны с молекулами мембранных белков, образуя пигмент-белковые комплексы антенны. Это обеспечивает эффективную передачу энергии на реакционные центры фотосистем, где осуществляются первичные процессы фотосинтеза (ППФ) (Рубин, Кренделева, 2003). Вся совокупность ППФ осуществляется за счет функционирования пигмент-белковых комплексов (ПБК), встроенных в мембрану тилакоида. В настоящее время установлено, что для высших растений характерно наличие в хлоропластах четырех типов хлорофилл-белковых комплексов фотосистемы I (ФСI) и фотосистемы II (ФСII) (Anderson, 1986; Ладыгин, 1998). Два из них – это комплексы реакционных центров ФСI и ФСII, которые содержат только хлорофилл а. Остальные два – светособирающие комплексы, функционально связанные с ФСI (ССКI) или с ФСII (CСКII), которые включают в свой состав коротковолновые формы Хл а и весь Хл b (Ладыгин, 1980; Ladygin, 2016).
Частью единого механизма трансформации энергии является электронтранс-портная цепь (ЭТЦ) фотосинтеза, в которой выделяют пять белковых комплексов (рис. 2): 1) комплекс ФСII, в состав которого включены белки пигментной антенны, тесно связанные с РЦ, и система фотоокисления воды; 2) комплекс ФСI, в состав которого входят белки пигментной антенны, и связанный функционально с ферредок-сином и ферредоксин-НАДН-редуктазой; 3) светособирающий хлорофилл-a/b-белковый комплекс, ответственный за образование гран и регуляцию передачи энергии возбуждения между двумя ФС; 4) цитохромный b6/f комплекс с Fe-S-центром Риске; 5) СF0-CF1-комплекс, представляющий АТФазную систему и локализованный в местах контакта мембраны со стромой. Взаимодействие между перечисленными комплексами осуществляется с помощью подвижных переносчиков (пластохиноны, пластоцианин, ферредоксин). Необходимо отметить, что макромолекулярные комплексы (светособирающий комплекс, ПБК ФСII и ПБК ФСI) неравномерно распределены в мембране тилакоида, и не обладают электронтранспортными функциями. Лишь небольшая часть молекул хлорофилла может вовлекаться в перенос электронов при фотосинтезе.
К настоящему времени использование электронной и атомно-абсорбционной микроскопии позволили детально изучить архитектуру и организацию комплексов (ФСII, ФСI, светособирающий хлорофилл-a/b-белковый комплекс, цитохромный b6/f комплекс, АТФазную систему) в интактной тилакоидной мембране (Dekker, Boekema, 2005).
Спектральные формы хлорофилла. Известно, что каждому из хлорофилл-белковых комплексов ФСI и ФСII принадлежат определенные формы хлорофилла (Ладыгин, 1979). Низкотемпературные спектры поглощения хлорофилла позволяют обнаружить все индивидуальные формы хлорофилла пигмент-белковых комплексов (Литвин и др., 1973; Ладыгин и др., 1982). Существует около 10 спектрально различных форм Хл а , четыре из которых считаются универсальными – 661, 670, 678 и 683 нм. Следует отметить, что лучшее разрешение дают исследования на целых листьях, чем на выделенных хлоропластах, поскольку в процессе выделения хлоропластов часть комплексов разрушается и теряется некоторое количество хлорофилла. В наибольшей степени разрушается хлорофилл с максимумом поглощения в области 684 нм (Закржевский и др., 1987). Известно, что формы Хл b при 648 нм и Хл а при 661, 670, 676 и 679 нм принадлежат светособирающим комплексам I и II (ССКI и ССКII); Хл а с полосой поглощения при 684 нм входит в состав антенны реакционного центра ФС II, а формы Хл а при 690, 697 и 708 нм составляют антенну реакционного центра ФСI (Ladygin, Bil, 1981).
Содержание и соотношение пигментов, особенности пигментной системы наземных растений разных таксонов, жизненных форм и широтных групп
Содержание хлорофиллов. Анализ данных выявил, что концентрация зеленых пигментов в листьях исследованных видов наземных растений таежной зоны варьирует в широком диапазоне, от 1.0-17 мг/г (Приложение 1 – табл. 1-3). Распределение видов по содержанию хлорофиллов имеет левосторонний характер (рис. 8). Большая часть видов (57%) характеризуется сравнительно низким накоплением Хл, от 2 до 6 мг/г. У 30% видов величина этого показателя находилась в пределах 6–10 мг/г. Доля видов с очень низким ( 1.9 мг/г) и высоким (12-17 мг/г) содержанием Хл составляла менее 10% всей выборки.
Анализ распределения исследованных видов растений из трех регионов также подтвердил (табл. 4), что содержание хлорофиллов в листьях большей части наземных растений находится в пределах 1-6 мг/г сухой массы.
Установлено, что в первую группу с высоким содержанием Хл (14–17 мг/г сухой массы) вошли 6 видов, четыре из которых произрастают в бассейне среднего течения р. Вычегда (Aconitum septentrionale из сем. Ranunculaceae, Maianthemum bifolium из сем. Liliaceae, Paris quadrifolia из сем. Melanthiaceae, Calla palustris из сем. Araceae), остальные – на Южном Тимане (Leucorchis albida из сем. Orchidaceae) и на Приполярном Урале (Astragalus frigidus из сем. Fabaceae).
Во вторую группу входят виды со средним содержанием хлорофиллов (6.1-12 мг/г сухой массы). С Приполярного Урала (12): сем. Fabaceae: Astragalus norvegicus, Hedysarum arcticum, Amoria repens; сем. Scrophulariaceae: Pedicularis verticillata; сем. Ranunculaceae: Atragene sibirica, Aconitum septentrionale; сем. Asteraceae: Artemisia tilesii; сем. Crassulaceae: Rhodiola rosea; сем. Linaceae: Linum usitatissimum; сем. Caprifoliaceae: Lonicera Pallasii; сем. Orchidaceae: Epipactis atrorubens; сем. Woodsiaceae: Woodsia glabella. На Южном Тимане (20): сем. Ranunculaceae: Aconitum septentrionale, Caltha palustris; сем. Asteraceae: Crepis sibirica, Petasites radiates, Tussilago farfara, Saussurea alpine; сем. Orchidaceae: Cypripedium calceolus, Epipactis atrorubens; сем. Fabaceae: Vicia sylvatica, Astragalus danicus, Lathyrus pratensis, Lathyrus vernus, Vicia cracca; сем. Rosaceae: Geum rivale; сем. Valerianaceae: Valeriana capitata, Valeriana wolgensis; сем. Celastraceae: Parnassia palustris; сем. Polygonaceae: Polygonum viviparum; сем. Plantaginaceae: Plantago media; сем. Primulaceae: Cortusa matthioli. В бассейне среднего течения р. Вычегда (18): сем. Butomaceae: Butomus umbellatus; сем. Polygonaceae: Bistorta major; сем. Fabaceae: Trifolium pratense, Trifoli-um medium; сем. Rubiaceae: Galium boreale; сем. Rosaceae: Rubus chamaemorus, Filipendula ulmaria, Comarum palustre, Rosa majalis, Rubus saxatilis; сем. Plantaginaceae: Veronica longifolia, Plantago media, Plantago major; сем. Ranunculaceae: Thalictrum simplex; сем. Brassicaceae: Rorippa amphibian; сем. Oxalidaceae: Oxalis acetosella; сем. Orchidaceae: Gymnadenia conopsea; сем. Dryopteridaceae: Dryopteris filix-mas.
Третья группа включает виды с низким содержанием хлорофиллов (1.0–6.0 мг/г сухой массы). Сюда вошли виды с Приполярного Урала (33): сем. Pyrolaceae: Pyrola rotundifolia; сем. Orchidaceae: Gymnadenia conopsea, Leucorchys albida, Cypripedium calceolus; сем. Salicaceae: Salix dasyclados, Salix nummularia, Salix reticulate; сем. Athyriaceae: Cystopteris diskieana; сем. Valerianaceae: Valeriana wolgensis; сем. Cyperaceae: Carex aquatilis; сем. Poaceae: Calamagrostis purpurea; сем. Orobanchaceae: Castilleja arctica; сем. Betulaceae: Betula nana, Duschekia fruticosa; сем. Rosaceae: Alchemilla murbeckiana, Penthaphylloides fruticosa, Rubus chamaemorus, Rosa acicularis; сем. Ericaceae: Vaccinium myrtillus, Ledum decumbens, Phylodoce caerulea, Arctous alpina, Vaccinium uliginosum; сем. Scrophulariaceae: Bartsia alpine; сем. Onagraceae: Chamaenerion angustifolium; сем. Asteraceae: Tanacetum bipinnatum, Achillea nigrescens; сем. Pinaceae: Larix sibirica, Picea obovata; сем. Empetraceae: Empetrum hermaphroditum; сем. Lycopodiaceae: Lycopodium annotinum, Lycopodium clavatum; сем. Diapensiaceae: Diapensia laponica. На Южном Тимане низким содержанием зеленых пигментов отличается 26 видов: сем. Orchidaceae: Dactylorhiza fuchsii, Gymnadenia conopsea, Tofieldia pusilla; сем. Rosaceae: Dryas octopetala, Cotoneaster melanocarpa, Sanguisorba officinalis; сем. Poaceae: Calamagrostis purpurea, Melica nutans; сем. Asteraceae: Aster sibiricus, Antennaria dioica, Dendranthema zawadskii; сем. Dryopteridaceae: Dryopteris filix-mas; сем. Pyrolaceae: Pyrola rotundifolia; сем. Cystopteridaceae: Gymnocarpium robertianum; сем. Lycopodiaceae: Diphasium complanatum, Lycopodium annotinum; сем. Woodsiaceae: Woodsia glabella; сем. Equisetaceae: Equisetum palustre; сем. Cupressaceae: Juniperus communis; сем. Saxifragaceae: Saxifraga hirculus; сем. Paeoniaceae: Paeonia anomala; сем. Lentibulariaceae: Pinguicula vulgaris; сем. Scrophulariaceae: Pedicularis verticillata; сем. Lamiaceae: Thymus talijevii; сем. Ericaceae: Vaccinium uliginosum; сем. Pinaceae: Pinus sibirica. В бассейне среднего течения р. Вычегда низким содержанием хлорофиллов характеризуется 26 видов: сем. Crassulaceae: Hylotelephium triphyllum; сем. Cystopteridaceae: Gymnocarpium robertianum, Gymnocarpium dryopteris; сем. Apiaceae: Pimpinella saxifrage; сем. Chenopodiaceae: Chenopodium album; сем. Pyrolaceae: Pyrola rotundifolia; сем. Poaceae: Deschampsia cespitosa, Bromopsis inermis, Elytrigia repens; сем. Asteraceae: Achillea millefolium, Leontodon autumnalis, Taraxacum officinale, Petasites spurious, Antennaria dioica; сем. Rosaceae: Alchemilla sp.; сем. Ericaceae: Vaccinium myrtillus, Vaccinium vitis-idaea, Vaccinium uliginosum, Ledum palustrе; сем. Empetraceae: Empetrum nigrum; сем. Pinaceae: Abies sibirica, Pinus sibirica; сем. Cupressaceae: Juniperus communis; сем. Alismataceae: Alisma plantago-aquatica; сем. Lycopodiaceae: Lycopodium annotinum; сем. Polygonaceae: Polygonum aviculare.
Из 46 семейств, к которым относятся исследованные виды, в 6 семействах изучено от 5 до 14 видов. Эти семейства входят в десятку ведущих семейств флоры Республики Коми. Представленные в табл. 5 семейства различаются по минимальным и максимальным величинам концентрации Хл в 2–4 раза. По содержанию Хл (от минимальных значений к максимальным) изученные семейства располагаются следующим образом: Ericaceae Asteraceae Poaceae Rosaceae Orchidaceae Fabaceae.
Влияние светового режима местообитания на динамику и уровень конверсии пигментов ксантофиллового цикла
Сравнительное изучение пигментного комплекса и оценка состояния деэпокси-дации пигментов ксантофиллового в листьях растений из затененного (полог леса) и освещенного (опушка леса) экотопов позволили установить особенности функционирования КЦ в ФСА растений в разных условиях освещения.
Данные хроматографического анализа пигментов иллюстрируют изменения содержания индивидуальных каротиноидов в листьях растений A. reptans (рис. 21). В листьях С-растений в составе каротиноидов обнаружены Ант и Зеа. В листьях Т-растений эти ксантофиллы наблюдали в следовых количествах. В листьях С- и Т-растений доля -каротина (14–19% от суммы каротиноидов) и ксантофиллов – лю-теина (55–64%) и неоксантина (7–9%) была примерно одинаковой. Т-растения отличались накоплением -каротина и лютеина. Достаточно высокий и стабильный уровень лютеина в пигментном фонде объясняется выполнением структурной функции этого ксантофилла как необходимого элементом периферического звена ССК ФСII, а также его вероятной антиоксидантной функцией. В листьях Т-растений были обнаружены следовые количества лютеин-эпоксида. Накопление лютеин-эпоксида увеличивает эффективность светосбора в антенне ФСII при низкой уровне освещенности под кронами деревьев в лесу.
Процесс деэпоксидации на свету включает превращение виолаксантина (эпок-сиксантофилла) в безэпоксидный зеаксантин, а также изменения в количестве промежуточного соединения – антераксантина (5,6-моноэпоксизеаксантина) (Gilmore, 1997; Latowski et al., 2011; Jahns, Holzwarth, 2012). Реакция деэпоксидации катализируется ферментом виолаксантиндеэпоксидазой, активирование которой происходит при освещении хлоропласта и закислении люмена в присутствии аскорбата (рН 5.2). Оценка степени деэпоксидации (расчётная величина DEPS) является показателем доли зеак-сантина в общем пуле пигментов КЦ. Чем больше величина DEPS, тем большее количество виолаксантина превращается в зеаксантин, который способен диссипировать световую энергию в виде тепла.
При долговременной адаптации к естественному освещению на открытой местности (опушке) С-растения характеризуются накоплением пула ксантофиллов. Увеличение количества Зеа говорит о высоком уровне деэпоксидации пигментов КЦ, до 60%. У Т-растений величина DEPS была на порядок ниже (рис. 22). При том, что величина деэпоксидации пигментов КЦ в листьях С-растений была высокой в течение суток, максимальные значения были отмечены в полуденные часы. По-видимому, у произрастающих на открытой опушке растений A. reptans ФСА лучше защищен от фотодинамического разрушения благодаря высокой активности КЦ и накоплению Зеа, способного рассеивать избыток поглощенной световой энергии в виде тепла еще до передачи в реакционный центр (Demmig-Adams, Adams, 1992а; Kurasova et al., 2002). Известно, что Зеа осуществляет свою протекторную функцию через множественные механизмы такие как нейтрализация активных форм кислорода (АФК), гашение триплетного и синглетного состояния хлорофилла, 1Хл /3Хл (Betterle et al., 2010; Havaux, Niyogi, 1999; Dall Osto et al., 2005, 2012). Зеа косвенно влияет на процесс диссипации энергии, поскольку способствует аллостерическим изменениям в пигмент-белковых комплексах и, тем самым, усиливает нефотохимическое тушение флуоресценции (Eskling et al., 1997; Ruban, Horton, 1999). Зеа замещает Вио в тримерах ССКII и в мономерных комплексах ССК (Caffari et al., 2001; Ahn et al., 2008; Pan et al., 2011). Фотопротекторная роль пигментов КЦ была изучена у некоторых представителей рода Clusia с С3-типом метаболизма (C. multiflora) и С3-CАМ (C. minor), предпочитающих расти в затененных местообитания (Miszalski et al., 2007; Kornas et al., 2014). Тем не менее, сведений о вовлечении ксантофиллового цикла в процессе приспособления теневыносливых растений к избыточной освещенности в литературе немного (Demmig-Adams, Adams, 1992b).
Эксперименты по изучению прямой и обратной реакции КЦ в перезимовавших зимнезеленых (ЗЗ) и летнезеленых (ЛЗ) листьях Ajuga reptans из затенененных и освещенных местообитаний показали (Дымова и др., 2010), что относительное содержание Зеа и Ант (двух пигментов ксантофиллового цикла) увеличивалось в перезимовавших листьях C- и Т-растений при высокой интенсивности света (рис. 23). При этом на свету до 10% пула Вио превращалось в Зеа. У ЗЗ листьев изначально присутствовало небольшое количество Ант. Оно незначительно возрастало при освещении высоким светом, а при последующем затемнении снижалось. У генерации ЛЗ листьев С-растений доля Ант в общем пуле компонентов КЦ была выше, возрастала под действием света и сохранялась на этом уровне при последующем затемнении.
В листьях С-растений под влиянием высокой освещенности уровень деэпокси-дации Вио достигал 30% (рис. 24). В темноте обратная реакция КЦ (эпоксидация) приводила к снижению уровня DEPS в ЗЗ листьях С-растений почти на порядок, в ЛЗ – только в 1.3 раза. Условия освещенности в месте произрастания растений не повли-ли на функционирование КЦ в перезимовавших листьях. ЗЗ листья Т-растений практически не уступали таковым С-растений по активности КЦ. Высокий уровень DEPS в ЗЗ листьях Т-растений обусловлен защитной функцией каротиноидов при низких температурах и высокой освещенности ранней весной. Значительные различия по показателю DEPS отмечены в листья летней генерации Т- и С-растений. В сформировавшихся ЛЗ листьях Т-растений после экспозиции высоким светом величина DEPS оставалась на низком уровне 3–5%. Небольшое количество пигментов КЦ и малая скорость их взаимопревращений обусловлены тем, что каротиноиды летнезеленых листьев Т-растений скорее функционируют как светосборщики, чем фотопротекторы.
Таким образом, листья С-растений накапливали больше каротиноидов в своём пигментном фонде. Среди каротиноидов в листьях доминирующими были -каротин и лютеин, доля которых составляла 20 и 45% от суммы каротиноидов соответственно. -каротин, связанный с РЦ ФСII, участвует в тушении находящегося в триплетном возбужденном состоянии Хл а и образующегося при избытке света синглетного кислорода, с последующей диссипацией тепловой энергии. Лютеин, входящий в состав ССК фотосистем, стабилизирует мембраны и участвует в диссипации избыточной энергии для защиты ФСА от фотоокислительного повреждения (Baroli, Niyogi, 2000; Woitsch, Rmer, 2003; Pinnola, Bassi, 2018).
Как уже отмечалось, фактору «свет» принадлежит ключевая роль в регуляции биосинтеза и накопления пигментов виолаксантинового цикла. Свет активирует формирование зеаксантина путем светоиндуцированной экспрессии гена зеаксантинэпок-сидазы (ЗЭ). Когда листья хорошо освещены, в них снижается содержание эпоксидного виолаксантина и возрастает безэпоксидный зеаксантин. Осуществляется прямая реакция цикла (деэпоксидация). Обратная реакция КЦ происходит в темноте или при низкой интенсивности света, который используется для фотосинтетического электронного транспорта.
На рис. 25 представлены электрофореграммы ПБК хлоропластов листьев растений A.reptans из разных по световым условиям местообитаний. У С-растений среди фракций обнаружена полоса (рис. 25, А), которая указывает на наличие хлорофилл-связывающего белка PsbS (22кДа-белок ФСII). В присутствии Зеа и/или Ант белок PsbS необходим для фотозащитной тепловой диссипации избыточно поглощенной энергии. Как известно, протонирование белка PsbS вызывает конформационные изменения в фотосинтетической антенне, что важно для запуска механизмов нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла (Li et al., 2000; Ruban, 2018).
Можно заключить, что вне зависимости от места произрастания растений A.reptans ФСА летнезеленых листьев С-растений и перезимовавших листьев хорошо защищен от избытка освещенности благодаря высокой активности КЦ. Полученные данные говорят о высоком адаптивном потенциале пигментной системы A. reptans, что даёт возможность теневыносливому виду занимать местообитания с разными условиями освещения.
Сезонные перестройки структуры пигмент-белковых комплексов листьев и хлоропластов
Пигменты. Нами выявлены сезонные изменения фонда фотосинтетических пигментов в листьях A. reptans (табл. 26). Содержание хлорофиллов в листьях снижалось в 4 раза к началу зимы (ноябрь). Заметные, но не столь значительные потери фонда зеленых пигментов продолжались и в течение зимы. В перезимовавших листьях (апрель) оставалось около 18% хлорофиллов. Через 3 недели после выхода растений из-под снега отмечали частичное восстановление фонда зеленых пигментов, в основном за счет синтеза de novo Хл а. Содержание Хл а увеличилось за этот период в 3 раза, а Хл b в 1.8 раз. Летом и во время перезимовки более 70% содержащихся в листьях хлорофиллов принадлежало светособирающему комплексу ФСII. После перезимовки доля хлорофилла в ССК ФСII уменьшилась в 1.4 раза.
Содержание каротиноидов, отнесенное к единице хлорофилла, увеличивалось втрое к началу зимы и оставалось высоким в течение перезимовки (табл. 27). У перезимовавших листьев относительное содержание каротиноидов уменьшалось в результате частичного восстановления фонда хлорофиллов. Соотношение отдельных пигментов КЦ изменялось существенно (рис. 37). Вклад Зеа возрастал ранней весной, тогда как в остальное время превалировал Вио. Уровень деэпоксидации пигментов КЦ был наибольшим у перезимовавших листьев после выхода из-под снега.
Низкотемпературные спектры флуоресценции хлоропластов. Важно отметить, что 77К спектры листьев и выделенных из них целых хлоропластов были практически идентичными (рис. 38), что может свидетельствовать о сохранности изолированных хлоропластов. Благодаря модификации метода выделения хлоропластов, летом нам удалось получить нативные органеллы. Об этом свидетельствует обнаружение в спектрах низкотемпературной (77К) флуоресценции хлорофилла внутренних антенн ФСII (СР43, СР47) и ФСI. Ранее считалось, что лучшее разрешение дают исследования на целых листьях (Закржевский и др., 1987; Ладыгин, Семёнова, 1999).
Спектры флуоресценции хлоропластов, выделенных из листьев летом (июль-август), имели три максимума: при 685 нм (антенна СР43), 695 нм (антенна СР47) и хорошо выраженный пик при 735 нм (ФСI) (рис. 39, A). Это соответствовало соотношениям F735/F685 и F735/F695 выше 1.5 (табл. 29). Поздней осенью (ноябрь) характер спектра низкотемпературной флуоресценции хлоропластов оставался прежним, но интенсивность флуоресценции несколько снижалась (рис. 39, Б). Величина соотношения F735/F695 увеличивалась втрое, а F735/F685 – вдвое. После выхода растений из-под снега (апрель) в спектре 77К флуоресценции хлоропластов отчетливо выражен пик поглощения при 685 нм и небольшой пик с максимумом 735 нм (рис. 39, В). Величины соотношения F735/F685 и F735/F695 значительно снижались и были много меньше единицы (табл. 29). Низкотемпературные спектры хлоропластов, выделенных из листьев в мае, имели три максимума поглощения (рис. 39, Г), что свидетельствует о функционировании обеих фотосистем. Однако на фоне восстановления пиков флуоресценции при 735 и 695 нм было заметно снижение интенсивности поглощения при 685 нм. Величины соотношения F735/F685 и F735/F695 хлоропластов возрастали почти на порядок и достигали значений, близких к 1.5. Сезонные колебания величины соотношения F695/F685 были выражены гораздо слабее, чем таковые для соотношений F735/F685 и F735/F695.
Хлорофилл-белковые комплексы. Экстрагированные из разрушенных (break) хлоропластов ПБК разделяли в градиенте сахарозы и получали 77К спектры флуоресценции отдельных фракций (рис. 40). В экстрактах, полученных из хлоропластов в июле, присутствовали фракция свободных хлорофиллов (СХл), содержащая форму хлорофилла а с максимумом поглощения при 671 нм (рис. 40, А1), фракции светосо-бирающих комплексов (ССК1–3) с хлорофиллом b и коротковолновыми формами хлорофилла а (678, 679 и 681 нм) (рис. 40, А2-А4), и фракция мегакомплекса ФСI-ФСII (рис. 40, А5). Форма Хл а при 685 нм входит в состав антенны реакционного центра ФСII и СCКII, форма Хл а при 735 нм составляет антенну реакционного центра ФСI и ССКI.
В экстрактах, полученных в ноябре, выявлена фракция хлорофилл-а-белкового комплекса ФСII, включающая Хл а с максимумом поглощения при 685 нм (рис. 40, Б1). В трех других фракциях (рис. 40, Б2-Б4) содержались комплексы, включающие обе фотосистемы.
В экстрактах, полученных в апреле, присутствовали только две фракции (рис. 40, В1-В2). Обе фракции включали светособирающие комплексы с Хл b и коротковолновыми формами Хл а (675 и 682 нм). Полученные данные свидетельствуют о разрушении значительной части ПБК в хлоропластах перезимовавших листьев.
Состав пигмент-белковых комплексов в мембранах тилакоидов хлоропластов, изолированных из листьев Ajuga reptans в разные сезоны, был изучен также методом гель-электрофореза. Типичные профили ПБК представлены на рис. 41. В летних образцах (июль-август) обнаружено шесть зон, которые в соответствии с их электрофо-ретической мобильностью и по аналогии с приведенными в работах других авторов (Ottander et al., 1995; Ivanov et al., 2006) можно идентифицировать как: 1) мегаком-плекс ФСI-ФСII; 2) суперкомплекс ФСII–ССКII; 3) светособирающий комплекс ФСI (ССКI), 4) тримерная и 5) мономерная формы ФСII, связанные со светособирающим комплексом (ССКII), и 6) свободные пигменты (СП) (преимущественно Хл а). В ноябре зоны 1 и 2 (мегакомплекс ФСI-ФСII и суперкомплекс ФСII–ССКII) исчезали. После перезимовки (апрель) хорошо проявлялись мономеры ССКII ФСII и частично свободные пигменты.
Адаптация фотосинтетического аппарата вечно- и зимнезеленых растений к сезонным изменениям среды связана с перестройкой пигмент-белковых комплексов. Устойчивость ФСА растений формируется за счет изменения концентрации и перераспределения зеленых и желтых пигментов в ССК и/или реакционных центрах (РЦ) фотосистем (Бухов, 2004). В состав пигмент-белковых комплексов хлоропластов входят как зеленые пигменты, так и каротиноиды, которые выполняют структурную функцию в ансамблях ФСII (-каротин) и светособирающих комплексах (лютеин) (Moskalenko, Karapetyan, 1996). Мономер комплекса ФСII содержит 36 хлорофиллов и 11 каротиноидов в форме транс--каротина (Ferreira et al., 2004; Барбер, 2014).
Нами выявлено снижение содержания хлорофиллов в зимующих листьях A. reptans (табл. 26), что было связано с распадом крупных пигмент-белковых комплексов фотосистем. Наблюдаемая в осенне-зимний период потеря хлорофилла в листьях A.reptans может указывать на механизм избегания или снижения количества поглощаемой энергии подобно поведению большинства вечнозеленых видов (Adams et al., 2002). После перезимовки наблюдалось частичное восстановление фонда хлоро-филлов, в основном за счет увеличения концентрации Хл а – главного пигмента корового комплека фотосистем.
Присутствие достаточного количества хлорофилла и изменения в организации ФСII в перезимовавшей хвое Pinus sylvestris L. позволили быстро восстановить фотосинтез весной (Ottander et al., 1995). Мы также полагаем, что сохранение функциональной активности ФСА листьев травянистого летне-зимне-зеленого вида происходит благодаря структурной реорганизации суперкомплексов ФСII и их светособи-рающих систем (ССКII), с их последующей сборкой весной. О восстановлении фотохимической активности ФСII в хлоропластах листьев A. reptans после перезимовки свидетельствуют изменения в соотношениях реакционных центров фотосистем F735/F685 и F735/F695. Однако перезимовавшие листья A. reptans были способны ассимилировать СО2 со скоростью вдвое ниже, зарегистрированной в этих же листьях в предыдущем сезоне (Дымова, Головко, 2001).
Известно, что ФСII более чувствительна к стрессовым воздействиям, чем ФСI. В состав ФСII входят два основных пигмент-белковых комплекса, которые содержат как каротиноиды ксантофиллового цикла (КЦ) и оба хлорофилла (светособирающий комплекс), так и -каротин с Хл а (комплекс ядра ФСII) (Kobayashi et al., 1990). У зимующих листьев A.reptans происходило увеличение относительного содержания -каротина, лютеина и пигментов ВКЦ на фоне снижения содержания хлорофиллов (табл. 27). Сходные изменения были отмечены у древесных хвойных растений (Adams, Demmig-Adams, 1994; Яцко и др., 2011; Софронова и др., 2016).
Растения A. reptans зимуют под опавшей листвой и снегом. Весной после таяния снега они испытывают воздействие интенсивного света и пониженных температур. В этих условиях сохранению ФСА в перезимовавших листьях способствует высокий уровень конверсии пигментов КЦ (DEPS=0.66) и накопление ключевого пигмента КЦ – зеаксантина (рис. 37). Благодаря функционированию зеаксантин-зависимого механизма тепловой диссипации избытка поглощенной световой энергии, в ССК ФСII может рассеиваться до 80% энергии возбуждения (Horton et al., 1996 ).
Анализ спектров (77К) флуоресценции хлорофилла листьев и хлоропластов выявил значительные сезонные изменения состояния ФСII и ФСI (рис. 36, 39; табл. 28, 29). Значительное увеличение соотношений F735/F685 и F735/F695 в зимующих листьях (табл. 28) свидетельствует о снижении количества хлорофиллов в ФСII на фоне уменьшения общего содержания хлорофиллов в листе (табл. 26). Сходные величины соотношения ФСI/ФСII (больше 5) отмечены также у зимующей хвои Pynus sylvestris (Ivanov et al., 2006).