Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Биохимические и физиологические аспекты действия абиотических стрессовых факторов на высшие растения и антистрессовые свойства биорегуляторов 8
1.1 Засоление 8
1.2 Тяжёлые металлы 13
1.3 Температурные стрессы 18
1.4 Водный дефицит 29
1.5 Протекторные свойства биорегуляторов при действии стрессовых факторов.31
Экспериментальная часть 39
Глава 2 Материалы и методы 39
2.1 Объекты исследования 39
2.2 Методика применения регуляторов роста при действии хлорида натрия, ацетата кадмия, гипотермии 39
2.3 Определение активности амилаз, протеиназ и их ингибиторов в растениях пшеницы 40
2.4 Определение содержания свободных аминокислот в растениях пшеницы 43
2.5 Оценка экспрессии гена CSP5 капусты 44
2.6 Статистическая обработка результатов 45
Результаты исследований и их обсуждение 46
Глава 3 Физиолого-биохимические аспекты действия стифуна на растения Triticum aestivum и Brassica oleracea при абиотических стрессах 46
3.1 Влияние стифуна на морфометрические параметры растений пшеницы в условиях действия натрий-хлоридного засоления, ацетата кадмия 47
3.2 Влияние стифуна на активность амилаз, протеиназ и их ингибиторов в растениях пшеницы в норме и при действии хлорида натрия, ацетата кадмия 50
3.3 Влияние стифуна на содержание свободных аминокислот у растений пшеницы в условиях действия ацетата кадмия 78
3.4 Влияние стифуна на экспрессию гена белка холодового шока (CSP5) и накопление массы растений капусты при действии гипотермии 81
Заключение 85
Выводы 87
Список сокращений 88
Список литературы 89
- Температурные стрессы
- Влияние стифуна на морфометрические параметры растений пшеницы в условиях действия натрий-хлоридного засоления, ацетата кадмия
- Влияние стифуна на активность амилаз, протеиназ и их ингибиторов в растениях пшеницы в норме и при действии хлорида натрия, ацетата кадмия
- Влияние стифуна на экспрессию гена белка холодового шока (CSP5) и накопление массы растений капусты при действии гипотермии
Температурные стрессы
Существенным фактором внешней среды, оказывающим воздействие на метаболизм, рост, развитие, продуктивность сельскохозяйственных культур в силу их прикреплённости к месту обитания, является температурный режим, характеризующийся очень высокой изменчивостью и перепадами [Miura, Furumoto, 2013]. Изменение климата, связанное с увеличением интенсивности промышленного производства, в виде глобального потепления может обусловливать экстремальные температурные явления, оказывающие сильное воздействие на природные экосистемы и сельское хозяйство [Neilson et al., 2010]. Неблагоприятные температурные условия вызывают у растений нарушение поглощения, транспорта воды и питательных веществ, увеличение осмотического потенциала, возрастание концентрации ионов в тканях, в том числе, токсичных веществ, снижение интенсивности и эффективности транспирации, дыхания, фотосинтеза, ингибирование синтетических реакций, нарушение структуры пигментно-липидного комплекса, обмена нуклеиновых кислот, белков, транскрипционных и трансляционных процессов, коагуляцию цитоплазмы, повреждение клеточных мембран, снижение активности фитогормонов и др. [Chinnusamy et al., 2007]. При действии низких температур в первую очередь происходят изменения в белковом, липидном и углеводном метаболизмах растений [Miura, Furumoto, 2013]. Исследователи отмечают, что в основе повреждения растений холодовым стрессом лежит изменение структуры и функционирования клеточных мембран, т.е. переход их из жидкокристаллического состояния в состояние геля, увеличивающее проницаемость [Лукаткин, Зауралов, 2009; Zhivet ev et al., 2010]. Низкие отрицательные температуры способствуют образованию в растениях льда, оказывающего механическое повреждающее действие на ткани, вызывают обезвоживание клеток, осмотический и окислительный стрессы [Chinnusamy et al., 2007; Miura, Furumoto, 2013].
Растения обладают рядом защитных механизмов, ослабляющих либо предотвращающих негативное действие температурного стресс-фактора, проявляющихся на разных уровнях их структурной организации и жизнедеятельности и представляющих собой результат комплексной ответной реакции [Hughes, Dunn, 1996; Колесниченко, Войников, 2003]. К их числу относятся изменение содержания белков, углеводов, органических соединений, аминокислот, хлорофилла, ферментов и их каталитической активности, состава клеточной мембраны, связанное с модификацией её текучести и другие [Zhivet ev et al., 2010]. Cтрессовые белки, называемые белками теплового или холодового шока, играют важную роль в адаптации растений к действию неблагоприятного температурного фактора [Ко-лесниченко, 2000].
Значительный объём литературных источников посвящён исследованию экспрессии генов, кодирующих белки холодового шока (БХШ) растений, среди которых выделяют дегидрины, шейпероны, антифризные белки, а также белки, разобщающие окисление и фосфорилирование в митохондриях [Колесниченко, Войников, 2003; Gmez et al., 2005]. Сравнительный транскриптомный анализ был использован для идентификации генов, а также гормонов и процессов, связанных с холодовым стрессом (+4 0С в течение 24 ч), на растениях перца [Lee, Choi, 2013]. При этом отмечалась повышенная регуляция для генов пероксидазы, се-ленсвязывающего белка, глюкозо-1-фосфат-аденилтрансферазы и факторов транскрипции с доменами типа «цинковые пальцы» и понижающая регуляция экспрессии генов цитратсинтазы, рецептор-подобной протеинкиназы 4, энолазы-фосфатазы и др. Глобальный анализ транскриптома также показал, что салициловая кислота (СК) может влиять на активацию генов в растениях перца, реагирующих на низкотемпературный стресс [Lee, Choi, 2013]. Выявлено, что при холодо-вой акклимации увеличивается синтез транскриптов флавоноидов, что приводит к увеличению их концентрации и защищает растения от окислительного повреждения [Theocharis et al., 2012]. Флавоноиды – вторичные метаболиты, синтезируемые полипропаноидным путем из фенилаланина, обладают антиоксидантной активностью, а также, как предполагается, отвечают за стабилизацию клеточной мембраны, поскольку накапливаются в липидной фазе мембраны при минусовых температурах [Sinha et al., 2015]. У растений батата были идентифицированы гены, реагирующие на температурный стресс, такие как АБК-отвечающие элементсвязывающие факторы (AREB) и факторы транскрипции CBF [Tao et al., 2012]. Существование и дифференциальные паттерны экспрессии этих генов могут быть связаны с высокой способностью адаптации батата к холодовому и тепловому стрессам. Во время холодовой акклиматизации у двух сортов пшеницы с помощью микрочипов были идентифицированы дифференциально регулируемые гены, которые кодировали протеинкиназы, факторы транскрипции, кальций-связывающие белки и белки фотосинтеза [Gulick et al., 2005]. При обобщении результатов транскриптомного анализа в условиях действия на растения низкой температуры (+4 0С) у разных видов выделяли следующие гены: на системе Poncirus trifoliata – гены, отвечающие за синтез осмолитов, -амилазы, антиокси-дантов, а также структурные гены клеточной оболочки; Ammopiptanthus mongolicus – гены, участвующие в фотосинтезе, углеводном и белковом обменах, захвате АФК, трансдукции сигнала, факторов транскрипции, клеточном транспорте, защитном ответе; Populus simonii – гены, участвующие в фотосинтезе, кальций/кальмодулин-опосредованном сигналинге, ФТ, биосинтезе гормонов, ан-тиоксидантов; Ammopiptanthus mongolicus – гены, участвующие в транспорте и метаболизме липидов, внутриклеточных осмопротекторов, антиоксидантных ферментных систем, кальция, абсцизовой кислоты (АБК), ФТ (COR, LEA, CBF и DREB); Oryza sativa ssp. Japonica – гены гликозилгидролаз, ABC транспортер АТФ-связывающего белка, раннего ответа к обезвоживанию, ФТ BZIP, гидрокси-лазы жирных кислот, этилен-отзывчивого ФТ, кальмодулин-связывающий мотив домена, содержащего белок [Sinha et al., 2015]. При действии +6 0С у растений Triticum aestivum выделяли гены, участвующие в транспорте и метаболизме липи-дов и углеводов, регуляции транскрипции, окислительно-восстановительных реакциях, организации хроматина, метаболизме ДНК, а для Oryza sativa ssp. indica (+5 ± 1 0С) – гены протеинкиназы, ФТ, убиквитин протеин лигазы, ауксин-отзывчивые, связанные с метаболизмом. В общей сложности были выделены 44 и 19 кДНК засухо- и холодиндуцируемых генов, соответственно, 30 и 10 из которых были новыми стресс-индуцируемыми генами, которые не были зарегистрированы ранее в качестве засухо- или холодиндуцируемых генов [Seki et al., 2001]. Двенадцать стресс-индуцируемых генов были определены в качестве целевых (DREB1A), шесть из них были новыми. На основе гель РНК-блоттинга и микро-чип анализа шесть генов идентифицированы как новые засухо- и холодиндуциро-ванные гены, контролируемые DREB1A. В этой работе были определены 19 генов COR, среди которых выявлялись гены ферритина, LEA белка, глиоксалазы.
Протеомные исследования растений картофеля выявили существенные изменения в изобилии белка после 3 сут воздействия холода (+70C день / +20C ночь) [Evers et al., 2012]. По сравнению с контрольными растениями уровни идентифицированных белков, глутатион S-трансферазы, тиоредоксинов и липоксигеназы были значительно увеличены, в то же время содержание некоторых ингибиторов протеиназ существенно снижалось после холодового воздействия. На растениях риса в общей сложности выявлялись дифференциальные паттерны 105 белков в ответ на холодовой стресс [Imin et al., 2006]. Были идентифицированы новые отвечающие на действие гипотермии белки, в том числе холод-индуцированный белок пыльников (OsCIA) растений Oryza sativa, который присутствует в метелке, листьях и проростках в нормальных условиях. Тем не менее, отмечалось, что уровни мРНК OsCIA не изменялись в анализируемых органах проростков после воздействия холода. OsCIA является примером белка, который имеет тканеспе-цифическую дифференциальную экспрессию, регулируемую посттранскрипционными модификациями [Neilson et al., 2010]. В условиях холодового стресса на рисе выявлены две фракции белков: содержащая растворимые белки, в том числе РуБисКо, и нерастворимые [Cui et al., 2005]. Из 1700 белковых пятен для 60 было характерно увеличение количества при гипотермии. Более 43% идентифицированных белков были локализованы в хлоропластах, что подчеркивает восприимчивость этой органеллы к холодовому стрессу. Обнаружены три основные функциональные группы белков, участвующие в повышающей регуляции с метаболическими белками, для которых было характерно изменение накопления. 10 идентифицированных белков отвечали за синтез, фолдинг, сборку, деградацию белка. Второй наиболее представленной категорией являлись белки, которые вносят вклад в биосинтез клеточной стенки, затем – белки, связанные с антиоксидантными реакциями [Cui et al., 2005]. При исследованиях реакций на температурный стресс, вызываемый холодом, в растениях арабидопсиса наблюдались три группы изменений в спектре в стромальных протеомах, соответствующие трём категориям белков: (I) белки, содержание которых увеличивалось в ответ на холодовой шок после 10 дней воздействия гипотермии и возвращалось на уровень контроля после 40 дней гипотермии; (II) белки, уровень которых повышался после 10 дней воздействия гипотермии и поддерживался до 40 дней гипотермии; (III) белки, количество которых было снижено через 10 и 40 дней воздействия холода [Goulas et al., 2006]. В общей сложности в стромальных протеомах выявлено 35 белков, ответственных за холодовую акклиматизацию. Люменальный протеом был менее чувствителен к действию низких температур по сравнению с протеомом стромы [Goulas et al., 2006]. В целом было выявлено 43 дифференцированно накапливающихся белков в строме и люмене, участвующих в процессе фотосинтеза, метаболических функциях пластид, биосинтезе гормонов, передаче сигнала. При анализе с использованием 2D гель-электрофореза белков из плодов томата в условиях охлаждения были обнаружены дифференцированно транслирующиеся белки, в том числе защитные, белки эмбриогенеза и фотосинтеза [Sanchez-Bel et al., 2012]. В другой работе у растений риса выявлено более 1000 белковых пятен, из которых уровень 31 понижался и 65 повышался [Yan et al., 2006]. В функциональные категории, вклад каждой из которых был более, чем 5% к общему количеству реагирующих на холод белков, входили энергетический обмен, метаболизм углерода, фотодыхание и трансляция. Наиболее пострадавшая от холодового стресса функциональная группа наблюдалась в фотосинтезе с 35.3% белков, реагирующих на холод. Частичная деградация также отмечалась у фрагментов белков, связанных с фотосинтезом (в том числе 19 фрагментов большой субъединицы РуБисКо), выявленная на 2-DE геле и подтверждённая впоследствии вестерн-блоттингом. Было предположено, что АФК могут помечать эти белки в качестве мишеней для протеолитической деградации.
Влияние стифуна на морфометрические параметры растений пшеницы в условиях действия натрий-хлоридного засоления, ацетата кадмия
Ионы солей, накапливающиеся в почве в процессе засоления, оказывают негативное влияние на рост и продуктивность культурных растений [Said-Al Ahl, Omer, 2011]. Наибольшую чувствительность к засолению среды большинство растений испытывает во время прорастания семян [Sosa et al., 2005; Said-Al Ahl, Omer, 2011; Zeid, 2011]. Как видно из таблицы, хлорид натрия дозозависимо ин-гибировал линейные размеры и массу проростков.
Также выявлялось негативное влияние ацетата кадмия на рост растений. Предобработка проростков стифуном уменьшала ингибирующее действие стрессовых факторов; при этом в отсутствие стресса он проявлял стимулирующие свойства. В ранее проведенных исследованиях было установлено, что в лабораторных условиях стифун (33 мг/л) при предпосевной обработке семян существенно предотвращал ингибирующее действие 1.5%-ной NaCl на всхожесть и ростовые параметры пшеницы [Yakhin et al., 1998, 2000]. При этом следует отметить участие стифуна в регуляции обусловленных засолением изменений уровней фитогормо-нов. Наряду с этим стифун существенно предотвращал обусловленное действием засоления снижение урожайности и повышал качество зерна пшеницы в полевых опытах, проведенных на засоленных почвах [Балакшина, Диканев, 1996; Яхин и др., 2000]. Протекторные свойства стифуна в условиях негативного действия кадмия выражались в стабилизации процессов деления и растяжения клеток, снижении уровня хромосомных нарушений [Яхин и др., 2007]. Кроме того, биорегулятор уменьшал накопление кадмия и свинца в растениях [Яхин и др., 2011].
Ранее было показано, что в опытах с ТМ наряду с выявленными антимутагенной активностью и уменьшением накопления кадмия растениями при действии стифуна подобные свойства были показаны и для эпина-экстра [Яхин и др., 2007, 2011; Лубянов, 2009], который применяется в растениеводстве в качестве регулятора роста [Государственный каталог …, 2016]. В отношении результатов, полученных при оценке влияния эпина-экстра на основе эпибрассинолиа (ЭБ) на проростки пшеницы (таблица), следует отметить, что ЭБ снижал негативный эффект натрий-хлоридного засоления среды на процессы роста и развития растений Eucalyptus camaldulensis, Brassica juncea [Sasse et al., 1995; Hayat et al., 2007b]. Брасси-ностероиды (БС) снижали токсический эффект ионов солей на растения, предотвращая разрушение ядер мезофильных клеток листьев, меристематических клеток корней, дезинтеграцию клеточных мембран [Sairam, 1994; Кораблева, Платонова, 1995], структуры хлоропластов, негативный эффект на фотосинтетические пигменты [Anuradha, Rao, 2003], повышая скорость ассимиляции углерода [Ali et al., 2007] и транспорта фотоассимилятов [Bajguz, Hayat, 2009]. Имеются данные об увеличении БС осмотического давления клеточного сока и оводнённости растений в условиях солевого стресса вследствие индукции ими накопления осмотических соединений [Schilling et al., 1991; Прусакова, Чижова, 1996; Прусакова и др., 2000; Vardhini, Rao, 2003]. Увеличение концентрации осмолитов БС при засолении могло сопровождаться повышением прироста биомассы растений [Ali et al., 2007]. Защитные свойства БС могут быть связаны с предотвращением накопления внутриклеточных АФК, возникающих в результате окислительного стресса и повреждающих биомолекулы [Gapper, Dolan, 2006; Bajguz, Hayat, 2009]. Стабилизация роста растений горчицы 24-эпибрассинолидом, 28-гомобрассинолидом в условиях токсического действия ионов никеля могла происходить вследствие активации ими антиоксидантной системы, накопления пролина [Bajguz, Hayat, 2009]. Предотвращение Cu2+-индуцированного (0.2 мM CuSO4) снижения линейных размеров корней и побегов у 7-дневных растений редиса (Raphanus sativus L.) при добавлении в среду роста ЭБ (10-11 M) могло быть связано с увеличением в них содержания свободной и связанной ИУК и АБК; сырой массы растений – индукцией синтеза фермента ксилоглюкантрансфераз/гидролазы, влияющей на разрыхление клеточной стенки [Choudhary et al., 2010]. Стабилизация ЭБ ростовых параметров растений в условиях токсического действия кадмия может быть связана с активацией лектинов (фитогемагглютининов), участвующих в формировании неспецифической устойчивости [Канделинская и др., 2008].
В контексте поставленных в настоящей работе задач необходимо рассмотреть механизмы, определяющие ответные реакции растений на действие стрессовых факторов при применении стифуна. Известно, что в условиях неблагоприятных факторов внешней среды происходит изменение активности ферментов, в частности, гидролитических – амилаз и протеиназ. Так, вследствие стресс-индуцированного снижения водного потенциала может происходить уменьшение их активности, имеющее негативный характер [Zeid, 2011]. Положительные изменения активности ферментов связаны с развитием у растений адаптационных реакций [Фролова и др., 2011].
Увеличение амилазной, протеиназной активности в стрессовых условиях может приводить к возрастанию концентрации осмотических соединений, свободных аминокислот, пептидов, стрессовых белков, участвующих в защитных реакциях, а также активации распада окисленных белков в растениях [Buchanan et al., 2000; Shringarpure et al., 2003; Parida et al., 2004; Schaller, 2004; Pena et al., 2006; Manivannan et al., 2008; Pena et al., 2008; Фролова и др., 2011; Zeid, 2011]. С другой стороны, обусловленное стрессом замедление ростовых процессов у растений может обусловливать необходимость меньшего количества углеводов и аминокислот, проявляющуюся в снижении активности этих гидролаз [Александрова и др., 2007]. В следующих экспериментах мы исследовали влияние стифуна на активность амилаз, протеиназ и их ингибиторов в растениях пшеницы в условиях действия хлорида натрия, ацетата кадмия.
Влияние стифуна на активность амилаз, протеиназ и их ингибиторов в растениях пшеницы в норме и при действии хлорида натрия, ацетата кадмия
Протеазы и амилазы – ключевые ферменты, активация которых приводит к мобилизации резервных питательных веществ при прорастании семян для получения необходимых для роста растворимых продуктов метаболизма [Ashraf, Foolad, 2005; Ramakrishna, Rao, 2006]. Амилазы (эндо-1,4-D-глюкан глюканогид-ролазы) представляют собой класс гидролаз, повсеместно обнаруживающихся у живых организмов, которые расщепляют орто-гликозидные связи в амилозе, главном запасном полисахариде, содержащемся в семенах различных растений наряду с другими олиго- и полисахаридами, играющими ключевую роль в метаболизме углеводов [He et al., 2008; Siddiqui, Khan, 2011; Oprica, Marius, 2014]. Кальций-зависимый фермент -амилаза (КФ 3.2.1.1) [He et al., 2010] вовлечен в начальную деградацию крахмала в более растворимые формы – D-глюкозу и оли-госахаридные единицы [Verma, Dubey, 2001], его активность наряду с другими физиологическими ответами опосредуется фитогормоном гиббереллином [Александрова и др., 2007; Zayneb et al., 2015]. -амилаза (КФ 3.2.1.2) [Das et al., 2014] способствует дальнейшей конверсии свободных сахаров [Amirjani, 2012]. Снижение амилазной активности может быть главным фактором, вовлеченным в сдерживание прорастания семян [Amirjani, 2012]. Активность амилазы является ключевым молекулярным маркером для мониторинга ранних событий в развитии растения [Zayneb et al., 2015]. Максимальная амилазная активность у проростков пшеницы проявляется на 3–6 день после прорастания семян [Livesley, 1991].
Протеазы – ключевые регуляторы, необратимо воздействующие на другие белки, и регулирующие различные процессы в ответ на сигналы окружающей среды, субстрат специфичные с жестко регулируемой, как в пространстве, так и во времени активностью [van der Hoorn, 2008]. Протеолитические ферменты играют роль практически во всех аспектах жизненного цикла растений, начиная от момента прорастания семян и заканчивая инициацией запрограммированного старения и смерти клеток [Loukas, 2002; Schaller, 2004]. Биологические функции растительных протеаз являются чрезвычайно разнообразными [van der Hoorn, 2008]. Среди протеолитических ферментов, разрушающих запасные белки семян на этапе мобилизации, к настоящему времени выявлены в основном цистеиновые про-теазы, а также сериновые, аспартатные, треониновые, аспарагиновые и металло-протеазы [Немова, Бондарёва, 2008; Tan-Wilson, Wilson, 2012]. Цистеинпротеазы, CIP протеазы и др. необходимы для обновления белка и рециклинга аминокислот [Seki et al., 2002]. Получение новой информации о протеазах может привести к более глубокому пониманию развития, дифференциации и гибели растений [Kohli et al., 2012].
Протеолиз является центральным регуляторным механизмом гомеостаза и функционирования белка, влияющим на все аспекты жизнедеятельности растений [Demir et al., 2018]. Он отвечает за функционирование клетки и реакции на стресс, удаляя аномальные/неправильно упакованные белки, обеспечивая аминокислотами для синтеза новых белков, способствуя созреванию зимогенов и пептидных гормонов, контролируя метаболизм и развитие за счет ферментов и регуляторных белков, а также апоптоз клеток растений [Vierstra, 1996; van der Hoorn, 2008; Hameed et al., 2009]. Контролируемая деградация белков и активация проферментов необходимы для роста и развития растений и выживания при абиотических и биотических стрессах [Kidri et al., 2014]. В то же время неконтролируемый протеолиз, часто индуцируемый стрессом, вреден для растений [Kidri et al., 2014]. В регуляции активности амилаз и протеаз участвуют ингибиторы, при образовании комплексов с которыми ферменты частично, либо полностью утрачивают свою активность [Wagstaff et al., 2002; Wei et al., 2009]. Любое ограничение активности ферментов, таких как протеаза и РНКаза, может воздействовать на синтез белка, который является очень критическим для семян и может существенно влиять на их прорастание [Batool et al., 2015]. В то же время протеазы важны для осуществления и регулирования распада белков, функций, которые регулируются конкретными эндогенными ингибиторами белка [Kidri et al., 2014]. Наряду с протеазами, в процессах развития растений участвуют их ингибиторы [Rech et al., 2013], которые могут выполнять защитную роль для протеаз [Seki et al., 2002]. Активность гидролаз и их ингибиторов может изменяться при воздействии различных абиотических стрессовых факторов [Pernas et al., 2000; Huang et al., 2007; Shan et al., 2008; Kidri et al., 2014; Oprica, Marius, 2014], БАС [Zeid, 2011; Vardhini et al., 2012; El-Feky, Abo-Hamad, 2014]. Исходя из вышеперечисленных фактов, получение детальной информации о влиянии стифуна на активность амилаз, про-теиназ и их ингибиторов в растениях может внести важный вклад в понимание механизмов его действия в норме и при стрессе.
Как видно из рисунков 1–4, в проростках пшеницы сорта Ирменка 4 активность амилаз, протеиназ и их ингибиторов возрастала при применении стифуна и эпина-экстра. Активность амилаз и их ингибиторов существенно возрастала по сравнению с контролем при действии биорегуляторов через 3, 24, 48 ч (рисунки 1, 2). Так, после обработки проростков стифуном амилазная активность превышала контроль в корнях через 3 ч – в 2, 24 ч – 2.7, 48 ч – 1.7 раза, в побегах – в 3, 7.6 и 2.7 раза, соответственно.
Как видно, в побегах активность фермента при применении стифуна увеличивалась в большей степени, чем в корнях. Активность ингибиторов амилаз в корнях через 3 ч после воздействия стифуна была выше контроля в 1.8, 24 ч – 3.3, 48 ч – 3.2 раза, в побегах – в 2, 1.9, 3.2 раза, соответственно. Таким образом, повышенная активность ферментов и их ингибиторов отмечалась уже через 3 ч после применения стифуна и была более высокой по сравнению с контролем в течение 2 суток.
При применении эпина-экстра амилазная активность в корнях и побегах через 3, 24, 48 ч повышалась в 1.6, 4.3, 2.5 и 2.7, 8, 3.1 раза, соответственно (рисунок 1). Активность ингибиторов амилаз под влиянием эпина-экстра в той же временной динамике превышала контроль в 1.8, 2.9, 3 раза в корнях и 1.6, 2.2, 2.7 раза в побегах пшеницы (рисунок 2).
При действии стифуна выявлено увеличение активности протеиназ и ингибиторов трипсина (ИТ) в растениях пшеницы (рисунки 3, 4). Так, через 3 ч после обработки проростков биорегулятором протеиназная активность в корнях была в 1.4 раза выше контроля, 24 ч – в 2 раза, 48 ч – 1.4 раза, в побегах, соответственно, – 1.8, 1.4 раза, через 48 ч наблюдалась небольшая тенденция ее возрастания (рисунок 3). Активность ИТ в корнях и побегах пшеницы под влиянием стифуна увеличивалась в эти же временные периоды в 1.2, 1.4 и 1.6 раза, соответственно (рисунок 4).
Через 3 ч после обработки проростков эпином-экстра протеиназная активность в корнях была практически на уровне контрольного варианта, через 24 ч – в 2.1 раза выше контроля, через 48 ч – несколько превышала контроль; в побегах – выше контроля в 1.3, 1.5 и 1.3 раза, соответственно. Активность ИТ превышала контроль в 1.3, 2.3 и 1.5 раза в корнях, в 1.3, 1.2 и 1.7 раза в побегах пшеницы, соответственно, через 3, 24 и 48 ч после обработки проростков эпином-экстра (рисунок 4).
Ранее было показано, что стифун влияет на баланс фитогормонов [Яхин и др., 2012]. При применении стифуна происходили стимуляция роста, возрастание в корнях проростков пшеницы уровня ИУК и ЦК, уменьшение содержания АБК; в побегах возрастали уровени АБК, ИУК, дигидрозеатина, дигидрозеатинрибозида [Яхин и др., 2012].
В связи с этим, важно обсудить влияние фитогормонов на гидролазы и их ингибиторы. Так, гибберелловая кислота (ГК) индуцировала активность -амилазы в зернах пшеницы [Lall et al., 1988]. При проращивании семян пшеницы в среде, содержащей ГК, выявлено возрастание амилазной активности у 1-суточных проростков [Александрова и др., 2007]. Отмечено существенное возрастание амилаз-ной активности в каллусах картофеля при обработке их салициловой и жасмоно-вой кислотами [Ахатова и др., 2012]. Также увеличивалась активность протеиназ и их ингибиторов; тогда как предобработка семян пшеницы не оказала существенного влияния на уровень протеолитической и антипротеиназной активности в листьях [Ахатова и др., 2012]. Обнаружено, что ГК3 и АБК могут стимулировать и ингибировать, соответственно, общую протеолитическую активность в экстрактах из прорастающих зерен [Segundo et al., 1990]; АБК способна подавлять -амилазу пшеницы [Sodkiewicz, Sodkiewicz, 2003]. При применении ГК, глицинбетаина повышение амилазной и протеиназной активности ячменя было сопряжено с увеличением их линейных размеров и массы, содержания воды в листьях, улучшением всхожести семян [Zeid, 2011]. Между тем, в экспериментах других исследователей зафиксировано некоторое снижение гибберелловой кислотой активности амилаз у 4-суточных проростков пшеницы, что исследователи связывают с тем, что в более поздние сроки прорастания количество запасного крахмала в растениях уменьшается вследствие интенсивного роста [Александрова и др., 2007]. Применение ЦК бензиладенина (БА), ГК3 или ИУК приводило к значительному увеличению активности -амилазы в проростках лобии (Dolichos lablab L. var. Lignosus) [Ramakrishna, Rao, 2006]. На увеличение активности протеаз (кислой, нейтральной и щелочной) не повлияли БA или ГК3 во время ранних стадий прорастания, но подавлялось падение их активности на более поздних стадиях прорастания. В то же время, in vivo применение ИУК отдельно или в сочетании с БА или ГК3 приводило к более быстрому и высокому повышению активности -амилазы и протеазы.
Влияние стифуна на экспрессию гена белка холодового шока (CSP5) и накопление массы растений капусты при действии гипотермии
Гипотермия, влияя на различные физиологические и биохимические процессы растений, является абиотическим стрессом, который может существенно уменьшать урожайность сельскохозяйственных культур [Megha et al., 2018]. Систематизированный анализ биологической активности соединений различной природы и коммерческих препаратов свидетельствует об их выраженных антистрессовых свойствах в условиях негативного действия холодового стресса [Колмыко-ва, Лукаткин, 2012]. Важную роль при адаптации растений к холодовому стрессу играет синтез белков холодового шока (БХШ) [Hughes, Dunn, 1996; Колесничен-ко, Войников, 2003; Gmez et al., 2005]. При рассмотрении специфических генов, ответственных за синтез БХШ, в качестве механизма адаптации растений к гипотермии было показано антистрессовое действие регуляторов роста, сопряженное с регуляцией экспрессии гена белка холодового шока (CSP5) [Гималов и др., 2004, 2006]. В наших опытах проводилась оценка протекторных свойств и механизмов действия стифуна в условиях действия гипотермии и было исследовано влияние биорегулятора на рост растений и транскрипционную активность гена CSP5 капусты (рисунки 14, 15). Как видно из рисунка 14, при действии холода динамика изменения массы растений капусты была отрицательной по отношению к контролю. Применение стифуна предотвращало обусловленное гипотермией снижение прироста биомассы. Следует отметить, что накопление массы у растений при применении стифуна в отсутствие холодового воздействия превышало данный показатель в контроле. При этом как в норме, так и при действии стресса обработка семян стифуном была более эффективной по сравнению с опрыскиванием растений.
Через 18 ч после начала действия гипотермии отмечался повышенный в 2.7 раза по сравнению с контролем уровень транскрипционной активности гена БХШ капусты CSP5 (рисунок 15). Ее уровень при предпосевной обработке семян сти-фуном и действии низкой положительной температуры был несколько ниже по сравнению с влиянием только гипотермии, но выше в 1.7 раза, чем в контроле. При опрыскивании вегетирующих растений стифуном и гипотермии уровень экспрессии возрастал в 1.5 раза по сравнению с действием пониженной температуры. Обработка семян и опрыскивание растений стифуном повышали уровень экспрессии гена CSP5 по сравнению с контролем в 2.3 и 3 раза, соответственно.
Следует отметить, что в конце эксперимента эффекты влияния исследуемых биорегуляторов на прирост биомассы растений капусты были практически сопоставимы (рисунки 14, 16).
Уровень транскрипционной активности гена CSP5 капусты при обработке семян эпином-экстра в сочетании с влиянием гипотермии был практически сопоставим с действием только гипотермии (рисунок 17), но выше в 3 раза, чем в контроле. Опрыскивание растений эпином-экстра и действие холодового стресса повышали экспрессию гена CSP5 в 4 раза по сравнению с гипотермией. При обработке семян эпином-экстра уменьшение экспрессии было незначительным, при опрыскивании растений ее уровень возрастал в 1.6 раза по сравнению с контролем. В связи с этими результатами следует отметить данные других исследователей, полученные также на капусте, в которых защитное действие эпибрассиноли-да во время холодового стресса сопровождалось стимуляцией экспрессии гена белка холодового шока [Гималов и др., 2006]. По мнению исследователей, регулируемая ЭБ экспрессия гена CSP5 могла быть опосредована увеличением уровня эндогенной АБК.
Таким образом, предотвращение стифуном ростингибирующего действия гипотермии на растения капусты сопряжено с изменением уровня экспрессии гена CSP5. Регуляция транскрипционной активности гена БХШ может быть вовлечена в механизм антистрессового действия стифуна в условиях холодового стресса. Полученные данные могут свидетельствовать о специфичности механизмов протекторного действия биорегулятора в зависимости от способа его применения.