Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Ответные реакции растений на действие абиотических стрессовых факторов при применении биорегулятора стифун Калимуллина Зубарзят Фанилевна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Калимуллина Зубарзят Фанилевна. Ответные реакции растений на действие абиотических стрессовых факторов при применении биорегулятора стифун: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.01.05 / Калимуллина Зубарзят Фанилевна;[Место защиты: ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет»], 2019

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 Биохимические и физиологические аспекты действия абиотических стрессовых факторов на высшие растения и антистрессовые свойства биорегуляторов 8

1.1 Засоление 8

1.2 Тяжёлые металлы 13

1.3 Температурные стрессы 18

1.4 Водный дефицит 29

1.5 Протекторные свойства биорегуляторов при действии стрессовых факторов.31

Экспериментальная часть 39

Глава 2 Материалы и методы 39

2.1 Объекты исследования 39

2.2 Методика применения регуляторов роста при действии хлорида натрия, ацетата кадмия, гипотермии 39

2.3 Определение активности амилаз, протеиназ и их ингибиторов в растениях пшеницы 40

2.4 Определение содержания свободных аминокислот в растениях пшеницы 43

2.5 Оценка экспрессии гена CSP5 капусты 44

2.6 Статистическая обработка результатов 45

Результаты исследований и их обсуждение 46

Глава 3 Физиолого-биохимические аспекты действия стифуна на растения Triticum aestivum и Brassica oleracea при абиотических стрессах 46

3.1 Влияние стифуна на морфометрические параметры растений пшеницы в условиях действия натрий-хлоридного засоления, ацетата кадмия 47

3.2 Влияние стифуна на активность амилаз, протеиназ и их ингибиторов в растениях пшеницы в норме и при действии хлорида натрия, ацетата кадмия 50

3.3 Влияние стифуна на содержание свободных аминокислот у растений пшеницы в условиях действия ацетата кадмия 78

3.4 Влияние стифуна на экспрессию гена белка холодового шока (CSP5) и накопление массы растений капусты при действии гипотермии 81

Заключение 85

Выводы 87

Список сокращений 88

Список литературы 89

Температурные стрессы

Существенным фактором внешней среды, оказывающим воздействие на метаболизм, рост, развитие, продуктивность сельскохозяйственных культур в силу их прикреплённости к месту обитания, является температурный режим, характеризующийся очень высокой изменчивостью и перепадами [Miura, Furumoto, 2013]. Изменение климата, связанное с увеличением интенсивности промышленного производства, в виде глобального потепления может обусловливать экстремальные температурные явления, оказывающие сильное воздействие на природные экосистемы и сельское хозяйство [Neilson et al., 2010]. Неблагоприятные температурные условия вызывают у растений нарушение поглощения, транспорта воды и питательных веществ, увеличение осмотического потенциала, возрастание концентрации ионов в тканях, в том числе, токсичных веществ, снижение интенсивности и эффективности транспирации, дыхания, фотосинтеза, ингибирование синтетических реакций, нарушение структуры пигментно-липидного комплекса, обмена нуклеиновых кислот, белков, транскрипционных и трансляционных процессов, коагуляцию цитоплазмы, повреждение клеточных мембран, снижение активности фитогормонов и др. [Chinnusamy et al., 2007]. При действии низких температур в первую очередь происходят изменения в белковом, липидном и углеводном метаболизмах растений [Miura, Furumoto, 2013]. Исследователи отмечают, что в основе повреждения растений холодовым стрессом лежит изменение структуры и функционирования клеточных мембран, т.е. переход их из жидкокристаллического состояния в состояние геля, увеличивающее проницаемость [Лукаткин, Зауралов, 2009; Zhivet ev et al., 2010]. Низкие отрицательные температуры способствуют образованию в растениях льда, оказывающего механическое повреждающее действие на ткани, вызывают обезвоживание клеток, осмотический и окислительный стрессы [Chinnusamy et al., 2007; Miura, Furumoto, 2013].

Растения обладают рядом защитных механизмов, ослабляющих либо предотвращающих негативное действие температурного стресс-фактора, проявляющихся на разных уровнях их структурной организации и жизнедеятельности и представляющих собой результат комплексной ответной реакции [Hughes, Dunn, 1996; Колесниченко, Войников, 2003]. К их числу относятся изменение содержания белков, углеводов, органических соединений, аминокислот, хлорофилла, ферментов и их каталитической активности, состава клеточной мембраны, связанное с модификацией её текучести и другие [Zhivet ev et al., 2010]. Cтрессовые белки, называемые белками теплового или холодового шока, играют важную роль в адаптации растений к действию неблагоприятного температурного фактора [Ко-лесниченко, 2000].

Значительный объём литературных источников посвящён исследованию экспрессии генов, кодирующих белки холодового шока (БХШ) растений, среди которых выделяют дегидрины, шейпероны, антифризные белки, а также белки, разобщающие окисление и фосфорилирование в митохондриях [Колесниченко, Войников, 2003; Gmez et al., 2005]. Сравнительный транскриптомный анализ был использован для идентификации генов, а также гормонов и процессов, связанных с холодовым стрессом (+4 0С в течение 24 ч), на растениях перца [Lee, Choi, 2013]. При этом отмечалась повышенная регуляция для генов пероксидазы, се-ленсвязывающего белка, глюкозо-1-фосфат-аденилтрансферазы и факторов транскрипции с доменами типа «цинковые пальцы» и понижающая регуляция экспрессии генов цитратсинтазы, рецептор-подобной протеинкиназы 4, энолазы-фосфатазы и др. Глобальный анализ транскриптома также показал, что салициловая кислота (СК) может влиять на активацию генов в растениях перца, реагирующих на низкотемпературный стресс [Lee, Choi, 2013]. Выявлено, что при холодо-вой акклимации увеличивается синтез транскриптов флавоноидов, что приводит к увеличению их концентрации и защищает растения от окислительного повреждения [Theocharis et al., 2012]. Флавоноиды – вторичные метаболиты, синтезируемые полипропаноидным путем из фенилаланина, обладают антиоксидантной активностью, а также, как предполагается, отвечают за стабилизацию клеточной мембраны, поскольку накапливаются в липидной фазе мембраны при минусовых температурах [Sinha et al., 2015]. У растений батата были идентифицированы гены, реагирующие на температурный стресс, такие как АБК-отвечающие элементсвязывающие факторы (AREB) и факторы транскрипции CBF [Tao et al., 2012]. Существование и дифференциальные паттерны экспрессии этих генов могут быть связаны с высокой способностью адаптации батата к холодовому и тепловому стрессам. Во время холодовой акклиматизации у двух сортов пшеницы с помощью микрочипов были идентифицированы дифференциально регулируемые гены, которые кодировали протеинкиназы, факторы транскрипции, кальций-связывающие белки и белки фотосинтеза [Gulick et al., 2005]. При обобщении результатов транскриптомного анализа в условиях действия на растения низкой температуры (+4 0С) у разных видов выделяли следующие гены: на системе Poncirus trifoliata – гены, отвечающие за синтез осмолитов, -амилазы, антиокси-дантов, а также структурные гены клеточной оболочки; Ammopiptanthus mongolicus – гены, участвующие в фотосинтезе, углеводном и белковом обменах, захвате АФК, трансдукции сигнала, факторов транскрипции, клеточном транспорте, защитном ответе; Populus simonii – гены, участвующие в фотосинтезе, кальций/кальмодулин-опосредованном сигналинге, ФТ, биосинтезе гормонов, ан-тиоксидантов; Ammopiptanthus mongolicus – гены, участвующие в транспорте и метаболизме липидов, внутриклеточных осмопротекторов, антиоксидантных ферментных систем, кальция, абсцизовой кислоты (АБК), ФТ (COR, LEA, CBF и DREB); Oryza sativa ssp. Japonica – гены гликозилгидролаз, ABC транспортер АТФ-связывающего белка, раннего ответа к обезвоживанию, ФТ BZIP, гидрокси-лазы жирных кислот, этилен-отзывчивого ФТ, кальмодулин-связывающий мотив домена, содержащего белок [Sinha et al., 2015]. При действии +6 0С у растений Triticum aestivum выделяли гены, участвующие в транспорте и метаболизме липи-дов и углеводов, регуляции транскрипции, окислительно-восстановительных реакциях, организации хроматина, метаболизме ДНК, а для Oryza sativa ssp. indica (+5 ± 1 0С) – гены протеинкиназы, ФТ, убиквитин протеин лигазы, ауксин-отзывчивые, связанные с метаболизмом. В общей сложности были выделены 44 и 19 кДНК засухо- и холодиндуцируемых генов, соответственно, 30 и 10 из которых были новыми стресс-индуцируемыми генами, которые не были зарегистрированы ранее в качестве засухо- или холодиндуцируемых генов [Seki et al., 2001]. Двенадцать стресс-индуцируемых генов были определены в качестве целевых (DREB1A), шесть из них были новыми. На основе гель РНК-блоттинга и микро-чип анализа шесть генов идентифицированы как новые засухо- и холодиндуциро-ванные гены, контролируемые DREB1A. В этой работе были определены 19 генов COR, среди которых выявлялись гены ферритина, LEA белка, глиоксалазы.

Протеомные исследования растений картофеля выявили существенные изменения в изобилии белка после 3 сут воздействия холода (+70C день / +20C ночь) [Evers et al., 2012]. По сравнению с контрольными растениями уровни идентифицированных белков, глутатион S-трансферазы, тиоредоксинов и липоксигеназы были значительно увеличены, в то же время содержание некоторых ингибиторов протеиназ существенно снижалось после холодового воздействия. На растениях риса в общей сложности выявлялись дифференциальные паттерны 105 белков в ответ на холодовой стресс [Imin et al., 2006]. Были идентифицированы новые отвечающие на действие гипотермии белки, в том числе холод-индуцированный белок пыльников (OsCIA) растений Oryza sativa, который присутствует в метелке, листьях и проростках в нормальных условиях. Тем не менее, отмечалось, что уровни мРНК OsCIA не изменялись в анализируемых органах проростков после воздействия холода. OsCIA является примером белка, который имеет тканеспе-цифическую дифференциальную экспрессию, регулируемую посттранскрипционными модификациями [Neilson et al., 2010]. В условиях холодового стресса на рисе выявлены две фракции белков: содержащая растворимые белки, в том числе РуБисКо, и нерастворимые [Cui et al., 2005]. Из 1700 белковых пятен для 60 было характерно увеличение количества при гипотермии. Более 43% идентифицированных белков были локализованы в хлоропластах, что подчеркивает восприимчивость этой органеллы к холодовому стрессу. Обнаружены три основные функциональные группы белков, участвующие в повышающей регуляции с метаболическими белками, для которых было характерно изменение накопления. 10 идентифицированных белков отвечали за синтез, фолдинг, сборку, деградацию белка. Второй наиболее представленной категорией являлись белки, которые вносят вклад в биосинтез клеточной стенки, затем – белки, связанные с антиоксидантными реакциями [Cui et al., 2005]. При исследованиях реакций на температурный стресс, вызываемый холодом, в растениях арабидопсиса наблюдались три группы изменений в спектре в стромальных протеомах, соответствующие трём категориям белков: (I) белки, содержание которых увеличивалось в ответ на холодовой шок после 10 дней воздействия гипотермии и возвращалось на уровень контроля после 40 дней гипотермии; (II) белки, уровень которых повышался после 10 дней воздействия гипотермии и поддерживался до 40 дней гипотермии; (III) белки, количество которых было снижено через 10 и 40 дней воздействия холода [Goulas et al., 2006]. В общей сложности в стромальных протеомах выявлено 35 белков, ответственных за холодовую акклиматизацию. Люменальный протеом был менее чувствителен к действию низких температур по сравнению с протеомом стромы [Goulas et al., 2006]. В целом было выявлено 43 дифференцированно накапливающихся белков в строме и люмене, участвующих в процессе фотосинтеза, метаболических функциях пластид, биосинтезе гормонов, передаче сигнала. При анализе с использованием 2D гель-электрофореза белков из плодов томата в условиях охлаждения были обнаружены дифференцированно транслирующиеся белки, в том числе защитные, белки эмбриогенеза и фотосинтеза [Sanchez-Bel et al., 2012]. В другой работе у растений риса выявлено более 1000 белковых пятен, из которых уровень 31 понижался и 65 повышался [Yan et al., 2006]. В функциональные категории, вклад каждой из которых был более, чем 5% к общему количеству реагирующих на холод белков, входили энергетический обмен, метаболизм углерода, фотодыхание и трансляция. Наиболее пострадавшая от холодового стресса функциональная группа наблюдалась в фотосинтезе с 35.3% белков, реагирующих на холод. Частичная деградация также отмечалась у фрагментов белков, связанных с фотосинтезом (в том числе 19 фрагментов большой субъединицы РуБисКо), выявленная на 2-DE геле и подтверждённая впоследствии вестерн-блоттингом. Было предположено, что АФК могут помечать эти белки в качестве мишеней для протеолитической деградации.

Влияние стифуна на морфометрические параметры растений пшеницы в условиях действия натрий-хлоридного засоления, ацетата кадмия

Ионы солей, накапливающиеся в почве в процессе засоления, оказывают негативное влияние на рост и продуктивность культурных растений [Said-Al Ahl, Omer, 2011]. Наибольшую чувствительность к засолению среды большинство растений испытывает во время прорастания семян [Sosa et al., 2005; Said-Al Ahl, Omer, 2011; Zeid, 2011]. Как видно из таблицы, хлорид натрия дозозависимо ин-гибировал линейные размеры и массу проростков.

Также выявлялось негативное влияние ацетата кадмия на рост растений. Предобработка проростков стифуном уменьшала ингибирующее действие стрессовых факторов; при этом в отсутствие стресса он проявлял стимулирующие свойства. В ранее проведенных исследованиях было установлено, что в лабораторных условиях стифун (33 мг/л) при предпосевной обработке семян существенно предотвращал ингибирующее действие 1.5%-ной NaCl на всхожесть и ростовые параметры пшеницы [Yakhin et al., 1998, 2000]. При этом следует отметить участие стифуна в регуляции обусловленных засолением изменений уровней фитогормо-нов. Наряду с этим стифун существенно предотвращал обусловленное действием засоления снижение урожайности и повышал качество зерна пшеницы в полевых опытах, проведенных на засоленных почвах [Балакшина, Диканев, 1996; Яхин и др., 2000]. Протекторные свойства стифуна в условиях негативного действия кадмия выражались в стабилизации процессов деления и растяжения клеток, снижении уровня хромосомных нарушений [Яхин и др., 2007]. Кроме того, биорегулятор уменьшал накопление кадмия и свинца в растениях [Яхин и др., 2011].

Ранее было показано, что в опытах с ТМ наряду с выявленными антимутагенной активностью и уменьшением накопления кадмия растениями при действии стифуна подобные свойства были показаны и для эпина-экстра [Яхин и др., 2007, 2011; Лубянов, 2009], который применяется в растениеводстве в качестве регулятора роста [Государственный каталог …, 2016]. В отношении результатов, полученных при оценке влияния эпина-экстра на основе эпибрассинолиа (ЭБ) на проростки пшеницы (таблица), следует отметить, что ЭБ снижал негативный эффект натрий-хлоридного засоления среды на процессы роста и развития растений Eucalyptus camaldulensis, Brassica juncea [Sasse et al., 1995; Hayat et al., 2007b]. Брасси-ностероиды (БС) снижали токсический эффект ионов солей на растения, предотвращая разрушение ядер мезофильных клеток листьев, меристематических клеток корней, дезинтеграцию клеточных мембран [Sairam, 1994; Кораблева, Платонова, 1995], структуры хлоропластов, негативный эффект на фотосинтетические пигменты [Anuradha, Rao, 2003], повышая скорость ассимиляции углерода [Ali et al., 2007] и транспорта фотоассимилятов [Bajguz, Hayat, 2009]. Имеются данные об увеличении БС осмотического давления клеточного сока и оводнённости растений в условиях солевого стресса вследствие индукции ими накопления осмотических соединений [Schilling et al., 1991; Прусакова, Чижова, 1996; Прусакова и др., 2000; Vardhini, Rao, 2003]. Увеличение концентрации осмолитов БС при засолении могло сопровождаться повышением прироста биомассы растений [Ali et al., 2007]. Защитные свойства БС могут быть связаны с предотвращением накопления внутриклеточных АФК, возникающих в результате окислительного стресса и повреждающих биомолекулы [Gapper, Dolan, 2006; Bajguz, Hayat, 2009]. Стабилизация роста растений горчицы 24-эпибрассинолидом, 28-гомобрассинолидом в условиях токсического действия ионов никеля могла происходить вследствие активации ими антиоксидантной системы, накопления пролина [Bajguz, Hayat, 2009]. Предотвращение Cu2+-индуцированного (0.2 мM CuSO4) снижения линейных размеров корней и побегов у 7-дневных растений редиса (Raphanus sativus L.) при добавлении в среду роста ЭБ (10-11 M) могло быть связано с увеличением в них содержания свободной и связанной ИУК и АБК; сырой массы растений – индукцией синтеза фермента ксилоглюкантрансфераз/гидролазы, влияющей на разрыхление клеточной стенки [Choudhary et al., 2010]. Стабилизация ЭБ ростовых параметров растений в условиях токсического действия кадмия может быть связана с активацией лектинов (фитогемагглютининов), участвующих в формировании неспецифической устойчивости [Канделинская и др., 2008].

В контексте поставленных в настоящей работе задач необходимо рассмотреть механизмы, определяющие ответные реакции растений на действие стрессовых факторов при применении стифуна. Известно, что в условиях неблагоприятных факторов внешней среды происходит изменение активности ферментов, в частности, гидролитических – амилаз и протеиназ. Так, вследствие стресс-индуцированного снижения водного потенциала может происходить уменьшение их активности, имеющее негативный характер [Zeid, 2011]. Положительные изменения активности ферментов связаны с развитием у растений адаптационных реакций [Фролова и др., 2011].

Увеличение амилазной, протеиназной активности в стрессовых условиях может приводить к возрастанию концентрации осмотических соединений, свободных аминокислот, пептидов, стрессовых белков, участвующих в защитных реакциях, а также активации распада окисленных белков в растениях [Buchanan et al., 2000; Shringarpure et al., 2003; Parida et al., 2004; Schaller, 2004; Pena et al., 2006; Manivannan et al., 2008; Pena et al., 2008; Фролова и др., 2011; Zeid, 2011]. С другой стороны, обусловленное стрессом замедление ростовых процессов у растений может обусловливать необходимость меньшего количества углеводов и аминокислот, проявляющуюся в снижении активности этих гидролаз [Александрова и др., 2007]. В следующих экспериментах мы исследовали влияние стифуна на активность амилаз, протеиназ и их ингибиторов в растениях пшеницы в условиях действия хлорида натрия, ацетата кадмия.

Влияние стифуна на активность амилаз, протеиназ и их ингибиторов в растениях пшеницы в норме и при действии хлорида натрия, ацетата кадмия

Протеазы и амилазы – ключевые ферменты, активация которых приводит к мобилизации резервных питательных веществ при прорастании семян для получения необходимых для роста растворимых продуктов метаболизма [Ashraf, Foolad, 2005; Ramakrishna, Rao, 2006]. Амилазы (эндо-1,4-D-глюкан глюканогид-ролазы) представляют собой класс гидролаз, повсеместно обнаруживающихся у живых организмов, которые расщепляют орто-гликозидные связи в амилозе, главном запасном полисахариде, содержащемся в семенах различных растений наряду с другими олиго- и полисахаридами, играющими ключевую роль в метаболизме углеводов [He et al., 2008; Siddiqui, Khan, 2011; Oprica, Marius, 2014]. Кальций-зависимый фермент -амилаза (КФ 3.2.1.1) [He et al., 2010] вовлечен в начальную деградацию крахмала в более растворимые формы – D-глюкозу и оли-госахаридные единицы [Verma, Dubey, 2001], его активность наряду с другими физиологическими ответами опосредуется фитогормоном гиббереллином [Александрова и др., 2007; Zayneb et al., 2015]. -амилаза (КФ 3.2.1.2) [Das et al., 2014] способствует дальнейшей конверсии свободных сахаров [Amirjani, 2012]. Снижение амилазной активности может быть главным фактором, вовлеченным в сдерживание прорастания семян [Amirjani, 2012]. Активность амилазы является ключевым молекулярным маркером для мониторинга ранних событий в развитии растения [Zayneb et al., 2015]. Максимальная амилазная активность у проростков пшеницы проявляется на 3–6 день после прорастания семян [Livesley, 1991].

Протеазы – ключевые регуляторы, необратимо воздействующие на другие белки, и регулирующие различные процессы в ответ на сигналы окружающей среды, субстрат специфичные с жестко регулируемой, как в пространстве, так и во времени активностью [van der Hoorn, 2008]. Протеолитические ферменты играют роль практически во всех аспектах жизненного цикла растений, начиная от момента прорастания семян и заканчивая инициацией запрограммированного старения и смерти клеток [Loukas, 2002; Schaller, 2004]. Биологические функции растительных протеаз являются чрезвычайно разнообразными [van der Hoorn, 2008]. Среди протеолитических ферментов, разрушающих запасные белки семян на этапе мобилизации, к настоящему времени выявлены в основном цистеиновые про-теазы, а также сериновые, аспартатные, треониновые, аспарагиновые и металло-протеазы [Немова, Бондарёва, 2008; Tan-Wilson, Wilson, 2012]. Цистеинпротеазы, CIP протеазы и др. необходимы для обновления белка и рециклинга аминокислот [Seki et al., 2002]. Получение новой информации о протеазах может привести к более глубокому пониманию развития, дифференциации и гибели растений [Kohli et al., 2012].

Протеолиз является центральным регуляторным механизмом гомеостаза и функционирования белка, влияющим на все аспекты жизнедеятельности растений [Demir et al., 2018]. Он отвечает за функционирование клетки и реакции на стресс, удаляя аномальные/неправильно упакованные белки, обеспечивая аминокислотами для синтеза новых белков, способствуя созреванию зимогенов и пептидных гормонов, контролируя метаболизм и развитие за счет ферментов и регуляторных белков, а также апоптоз клеток растений [Vierstra, 1996; van der Hoorn, 2008; Hameed et al., 2009]. Контролируемая деградация белков и активация проферментов необходимы для роста и развития растений и выживания при абиотических и биотических стрессах [Kidri et al., 2014]. В то же время неконтролируемый протеолиз, часто индуцируемый стрессом, вреден для растений [Kidri et al., 2014]. В регуляции активности амилаз и протеаз участвуют ингибиторы, при образовании комплексов с которыми ферменты частично, либо полностью утрачивают свою активность [Wagstaff et al., 2002; Wei et al., 2009]. Любое ограничение активности ферментов, таких как протеаза и РНКаза, может воздействовать на синтез белка, который является очень критическим для семян и может существенно влиять на их прорастание [Batool et al., 2015]. В то же время протеазы важны для осуществления и регулирования распада белков, функций, которые регулируются конкретными эндогенными ингибиторами белка [Kidri et al., 2014]. Наряду с протеазами, в процессах развития растений участвуют их ингибиторы [Rech et al., 2013], которые могут выполнять защитную роль для протеаз [Seki et al., 2002]. Активность гидролаз и их ингибиторов может изменяться при воздействии различных абиотических стрессовых факторов [Pernas et al., 2000; Huang et al., 2007; Shan et al., 2008; Kidri et al., 2014; Oprica, Marius, 2014], БАС [Zeid, 2011; Vardhini et al., 2012; El-Feky, Abo-Hamad, 2014]. Исходя из вышеперечисленных фактов, получение детальной информации о влиянии стифуна на активность амилаз, про-теиназ и их ингибиторов в растениях может внести важный вклад в понимание механизмов его действия в норме и при стрессе.

Как видно из рисунков 1–4, в проростках пшеницы сорта Ирменка 4 активность амилаз, протеиназ и их ингибиторов возрастала при применении стифуна и эпина-экстра. Активность амилаз и их ингибиторов существенно возрастала по сравнению с контролем при действии биорегуляторов через 3, 24, 48 ч (рисунки 1, 2). Так, после обработки проростков стифуном амилазная активность превышала контроль в корнях через 3 ч – в 2, 24 ч – 2.7, 48 ч – 1.7 раза, в побегах – в 3, 7.6 и 2.7 раза, соответственно.

Как видно, в побегах активность фермента при применении стифуна увеличивалась в большей степени, чем в корнях. Активность ингибиторов амилаз в корнях через 3 ч после воздействия стифуна была выше контроля в 1.8, 24 ч – 3.3, 48 ч – 3.2 раза, в побегах – в 2, 1.9, 3.2 раза, соответственно. Таким образом, повышенная активность ферментов и их ингибиторов отмечалась уже через 3 ч после применения стифуна и была более высокой по сравнению с контролем в течение 2 суток.

При применении эпина-экстра амилазная активность в корнях и побегах через 3, 24, 48 ч повышалась в 1.6, 4.3, 2.5 и 2.7, 8, 3.1 раза, соответственно (рисунок 1). Активность ингибиторов амилаз под влиянием эпина-экстра в той же временной динамике превышала контроль в 1.8, 2.9, 3 раза в корнях и 1.6, 2.2, 2.7 раза в побегах пшеницы (рисунок 2).

При действии стифуна выявлено увеличение активности протеиназ и ингибиторов трипсина (ИТ) в растениях пшеницы (рисунки 3, 4). Так, через 3 ч после обработки проростков биорегулятором протеиназная активность в корнях была в 1.4 раза выше контроля, 24 ч – в 2 раза, 48 ч – 1.4 раза, в побегах, соответственно, – 1.8, 1.4 раза, через 48 ч наблюдалась небольшая тенденция ее возрастания (рисунок 3). Активность ИТ в корнях и побегах пшеницы под влиянием стифуна увеличивалась в эти же временные периоды в 1.2, 1.4 и 1.6 раза, соответственно (рисунок 4).

Через 3 ч после обработки проростков эпином-экстра протеиназная активность в корнях была практически на уровне контрольного варианта, через 24 ч – в 2.1 раза выше контроля, через 48 ч – несколько превышала контроль; в побегах – выше контроля в 1.3, 1.5 и 1.3 раза, соответственно. Активность ИТ превышала контроль в 1.3, 2.3 и 1.5 раза в корнях, в 1.3, 1.2 и 1.7 раза в побегах пшеницы, соответственно, через 3, 24 и 48 ч после обработки проростков эпином-экстра (рисунок 4).

Ранее было показано, что стифун влияет на баланс фитогормонов [Яхин и др., 2012]. При применении стифуна происходили стимуляция роста, возрастание в корнях проростков пшеницы уровня ИУК и ЦК, уменьшение содержания АБК; в побегах возрастали уровени АБК, ИУК, дигидрозеатина, дигидрозеатинрибозида [Яхин и др., 2012].

В связи с этим, важно обсудить влияние фитогормонов на гидролазы и их ингибиторы. Так, гибберелловая кислота (ГК) индуцировала активность -амилазы в зернах пшеницы [Lall et al., 1988]. При проращивании семян пшеницы в среде, содержащей ГК, выявлено возрастание амилазной активности у 1-суточных проростков [Александрова и др., 2007]. Отмечено существенное возрастание амилаз-ной активности в каллусах картофеля при обработке их салициловой и жасмоно-вой кислотами [Ахатова и др., 2012]. Также увеличивалась активность протеиназ и их ингибиторов; тогда как предобработка семян пшеницы не оказала существенного влияния на уровень протеолитической и антипротеиназной активности в листьях [Ахатова и др., 2012]. Обнаружено, что ГК3 и АБК могут стимулировать и ингибировать, соответственно, общую протеолитическую активность в экстрактах из прорастающих зерен [Segundo et al., 1990]; АБК способна подавлять -амилазу пшеницы [Sodkiewicz, Sodkiewicz, 2003]. При применении ГК, глицинбетаина повышение амилазной и протеиназной активности ячменя было сопряжено с увеличением их линейных размеров и массы, содержания воды в листьях, улучшением всхожести семян [Zeid, 2011]. Между тем, в экспериментах других исследователей зафиксировано некоторое снижение гибберелловой кислотой активности амилаз у 4-суточных проростков пшеницы, что исследователи связывают с тем, что в более поздние сроки прорастания количество запасного крахмала в растениях уменьшается вследствие интенсивного роста [Александрова и др., 2007]. Применение ЦК бензиладенина (БА), ГК3 или ИУК приводило к значительному увеличению активности -амилазы в проростках лобии (Dolichos lablab L. var. Lignosus) [Ramakrishna, Rao, 2006]. На увеличение активности протеаз (кислой, нейтральной и щелочной) не повлияли БA или ГК3 во время ранних стадий прорастания, но подавлялось падение их активности на более поздних стадиях прорастания. В то же время, in vivo применение ИУК отдельно или в сочетании с БА или ГК3 приводило к более быстрому и высокому повышению активности -амилазы и протеазы.

Влияние стифуна на экспрессию гена белка холодового шока (CSP5) и накопление массы растений капусты при действии гипотермии

Гипотермия, влияя на различные физиологические и биохимические процессы растений, является абиотическим стрессом, который может существенно уменьшать урожайность сельскохозяйственных культур [Megha et al., 2018]. Систематизированный анализ биологической активности соединений различной природы и коммерческих препаратов свидетельствует об их выраженных антистрессовых свойствах в условиях негативного действия холодового стресса [Колмыко-ва, Лукаткин, 2012]. Важную роль при адаптации растений к холодовому стрессу играет синтез белков холодового шока (БХШ) [Hughes, Dunn, 1996; Колесничен-ко, Войников, 2003; Gmez et al., 2005]. При рассмотрении специфических генов, ответственных за синтез БХШ, в качестве механизма адаптации растений к гипотермии было показано антистрессовое действие регуляторов роста, сопряженное с регуляцией экспрессии гена белка холодового шока (CSP5) [Гималов и др., 2004, 2006]. В наших опытах проводилась оценка протекторных свойств и механизмов действия стифуна в условиях действия гипотермии и было исследовано влияние биорегулятора на рост растений и транскрипционную активность гена CSP5 капусты (рисунки 14, 15). Как видно из рисунка 14, при действии холода динамика изменения массы растений капусты была отрицательной по отношению к контролю. Применение стифуна предотвращало обусловленное гипотермией снижение прироста биомассы. Следует отметить, что накопление массы у растений при применении стифуна в отсутствие холодового воздействия превышало данный показатель в контроле. При этом как в норме, так и при действии стресса обработка семян стифуном была более эффективной по сравнению с опрыскиванием растений.

Через 18 ч после начала действия гипотермии отмечался повышенный в 2.7 раза по сравнению с контролем уровень транскрипционной активности гена БХШ капусты CSP5 (рисунок 15). Ее уровень при предпосевной обработке семян сти-фуном и действии низкой положительной температуры был несколько ниже по сравнению с влиянием только гипотермии, но выше в 1.7 раза, чем в контроле. При опрыскивании вегетирующих растений стифуном и гипотермии уровень экспрессии возрастал в 1.5 раза по сравнению с действием пониженной температуры. Обработка семян и опрыскивание растений стифуном повышали уровень экспрессии гена CSP5 по сравнению с контролем в 2.3 и 3 раза, соответственно.

Следует отметить, что в конце эксперимента эффекты влияния исследуемых биорегуляторов на прирост биомассы растений капусты были практически сопоставимы (рисунки 14, 16).

Уровень транскрипционной активности гена CSP5 капусты при обработке семян эпином-экстра в сочетании с влиянием гипотермии был практически сопоставим с действием только гипотермии (рисунок 17), но выше в 3 раза, чем в контроле. Опрыскивание растений эпином-экстра и действие холодового стресса повышали экспрессию гена CSP5 в 4 раза по сравнению с гипотермией. При обработке семян эпином-экстра уменьшение экспрессии было незначительным, при опрыскивании растений ее уровень возрастал в 1.6 раза по сравнению с контролем. В связи с этими результатами следует отметить данные других исследователей, полученные также на капусте, в которых защитное действие эпибрассиноли-да во время холодового стресса сопровождалось стимуляцией экспрессии гена белка холодового шока [Гималов и др., 2006]. По мнению исследователей, регулируемая ЭБ экспрессия гена CSP5 могла быть опосредована увеличением уровня эндогенной АБК.

Таким образом, предотвращение стифуном ростингибирующего действия гипотермии на растения капусты сопряжено с изменением уровня экспрессии гена CSP5. Регуляция транскрипционной активности гена БХШ может быть вовлечена в механизм антистрессового действия стифуна в условиях холодового стресса. Полученные данные могут свидетельствовать о специфичности механизмов протекторного действия биорегулятора в зависимости от способа его применения.