Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Фенольные соединения и их классификация 11
1.2. Функции фенольных соединений в растениях 13
1.3. Синтез и транспорт фенольных соединений у растений 19
1.4. Факторы, влияющие на синтез фенольных соединений 24
1.5. Элиситация как фактор, влияющий на синтез фенольных соединений 35
1.6. Фенольный состав вересковых 41
2. Объекты и методы исследования 47
2.1. Объекты исследования 47
2.2. Методы исследования 50
2.2.1. Условия сбора растений открытого грунта 50
2.2.2. Получение и культивирование стерильных микрорастений 51
2.2.3. Получение и культивирование растений в условиях ex vitro 53
2.2.4. Получение и культивирование каллусов 54
2.2.5. Получение грибных препаратов для модификации питательной среды для каллусов 55
2.2.6. Определение содержания фенольных соединений 58
2.2.6.1. Определение содержания растворимых фенольных соединений 58
2.2.6.2. Определение содержания флавоноидов 59
2.2.6.3. Определение содержания катехинов 60
2.2.6.4. Определение содержания проантоцианидинов 60
2.2.6.5. Определение содержания антоцианов 61
2.2.7. Определение содержания фотосинтетических пигментов 62
2.2.8. Определение содержания углеводов 62
2.2.9. Определение содержания белков 63
2.2.10. Анализ почвы 64
2.2.10.1. Определение рН почвы 64
2.2.10.2. Определение содержания подвижного калия в почве 64
2.2.10.3. Определение содержания подвижной фосфорной кислоты в почве 65
2.2.10.4. Определение содержания нитратов в почве 66
2.2.11. Статистическая обработка результатов 66
3. Результаты и их обсуждение 67
3.1. Накопление фенольных соединений в растениях Vaccinium vitis idaea, Oxycoccus palustris и Oxycoccus macrocarpus в условиях in vivo 67
3.1.1. Накопление фенольных соединений в листьях и ягодах растений Vaccinium vitis-idaea и Oxycoccus palustris из природных ягодников Нижегородской области 67
3.1.2. Накопление фенольных соединений в листьях и ягодах культивируемых растений Oxycoccus macrocarpus 71
3.2. Накопление фенольных соединений у Vaccinium vitis-idaea, Oxycoccus palustris и Oxycoccus macrocarpus в условиях in vitro 84
3.3. Влияние внесения макроэлементов на накопление фенольных соединений в листьях растений Oxycoccus macrocarpus в условиях ex vitro 89
3.4. Накопление фенольных соединений в каллусах Oxycoccus palustris и Oxycoccus macrocarpus 99
3.4.1. Влияние гормонального состава питательной среды на накопление фенольных соединений в каллусах Oxycoccus palustris и Oxycoccus macrocarpus, культивируемых на свету 99
3.4.2. Влияние гормонального состава питательной среды на накопление фенольных соединений в каллусах Oxycoccus palustris и Oxycoccus macrocarpus, культивируемых в темноте 106
3.4.3. Влияние грибных добавок на накопление фенольных соединений в каллусах Oxycoccus palustris и Oxycoccus macrocarpus 116
Заключение 127
- Синтез и транспорт фенольных соединений у растений
- Получение грибных препаратов для модификации питательной среды для каллусов
- Накопление фенольных соединений у Vaccinium vitis-idaea, Oxycoccus palustris и Oxycoccus macrocarpus в условиях in vitro
- Влияние грибных добавок на накопление фенольных соединений в каллусах Oxycoccus palustris и Oxycoccus macrocarpus
Синтез и транспорт фенольных соединений у растений
Синтез разнообразных фенольных соединений в растительной клетке объединяет 8 биосинтетических путей: гликолиз, цикл Кальвина, окислительный пентозофосфатный (синтез фосфоенолпирувата и эритрозо-4-фосфата), шикиматный (синтез фенилаланина), фенилпропаноидный пути, цикл Кребса (цикл трикарбоновых кислот (ЦТК); синтез ацетил-КоА), ацетатно-малонатный и флавоноидный пути (Routray, Orsat, 2011; Caretto et al., 2015). Образование собственно ароматического ядра обеспечивают ацетатно-малонатный путь (синтез веществ из уксусной и пировиноградной кислот) и шикиматный (реакции шикимовой и префеновой кислот) (рисунок 2). Первый механизм приводит к образованию фенольных соединений преимущественно в низших растениях, второй относится, главным образом, к высшим растениям (Блажей, Шутый, 1977).
В ацетатно-малонатном (ацетатном, поликетидном) пути происходит многократное карбоксилирование ацетил-КоА с образованием поли- кетометиленовой цепочки, которая затем циклизуется с образованием фенольных соединений. По этому пути синтезируются некоторые хиноны; его реакции наряду с шикиматными используются при биосинтезе флавоноидов (Запрометов, 1993).
Шикиматный путь биосинтеза фенольных соединений начинается с эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата (ФЕП). Далее, через несколько стадий, происходит образование шикимовой кислоты, из которой затем образуются ароматические аминокислоты: фенилаланин, тирозин, триптофан.
Ключевым ферментом вторичного метаболизма является ФАЛ (КФ 4.3.1.24), которая катализирует образование коричной кислоты из фенилаланина. ФАЛ является развилкой между первичным и вторичным метаболизмом, и синтез белков и синтез фенольных соединений конкурируют друг с другом за использование продуктов шикиматного пути (Dias et al., 2016). Экспрессия ФАЛ активно протекает в сосудистых (где синтезируется лигнин) и эпидермальных (где образуются флавоноиды, защищающие от УФ лучей) тканях (Parr, Bolwell, 2000).
Фенилаланин (в ряде случаев тирозин) является предшественником фенилпропаноидов – гидроксикоричных кислот. На синтез фенилпропаноидов направляется около 20% фиксируемого в процессе фотосинтеза углерода (Pereira et al., 2009). Из КоА-производного коричной кислоты с участием трех молекул малонил-КоА образуются халконы – конечные продукты фенилпропаноидного пути. У растений дупликация генов фенилпропаноидного пути встречается чаще, чем дупликация генов шикиматного пути (Tohge et al., 2013). Дальнейшие превращения халконов с образованием разнообразных флавоноидных структур составляют флавоноидный путь (Блажей, Шутый, 1977; Запрометов, 1993; Parr, Bolwell, 2000; Olsen et al., 2009; Routray, Orsat, 2011; Caretto et al., 2015; Dias et al., 2016; Moreno-Escamilla et al., 2018).
Синтез полимерных фенольных соединений происходит с участием свободных радикалов и/или ферментов (Запрометов, 1993; Parr, Bolwell, 2000), в т.ч. лакказы, пероксидазы (Schnablov et al., 2006).
Синтез фенольных соединений по шикиматному пути идет в хлоропластах и цитозоле (Запрометов, 1993). Цитозольные ферменты образуют мультиферментные комплексы (метаболоны) на внешней поверхности ЭПР (Passamonti et al., 2009; Agati et al., 2012). Также они обнаружены в самом ЭПР, тонопласте, вторичной клеточной стенке, ядре (Passamonti et al., 2009; Agati et al., 2013). ФАЛ, в частности, обнаружена в цитоплазме, митохондриях, пероксисомах, аппарате Гольджи, пластидах (Kaewubon, 2015). Вторичным биосинтетическим процессам: гликозилированию, этерификации, окислению, конденсации – фенольные соединения подвергаются вне хлоропластов (Запрометов, 1974).
В клетке фенольные соединения локализуются преимущественно в вакуолях, а также в клеточной стенке, цитоплазме, хлоропластах, митохондриях, ядре (Parr, Bolwell, 2000; Agati et al., 2013; Kaewubon, 2015). В клеточной стенке локализуются проантоцианидины и другие полимерные фенольные соединения (Blumberg et al., 2013). Гидроксикоричные кислоты связаны с компонентами кутикулы и клеточной стенки – в первую очередь клеток эпидермиса (Jaakola, 2003). Хлорогеновая кислота накапливается в так называемых хлорогенопластах (Запрометов, 1993); с возрастом может увеличиваться ее содержание в апопласте (Schnablov et al., 2006). Флавоноиды хлоропластов стабилизируют участки мембран, содержащие небислойные липиды – моногалактозилдиацилглицеролы (Agati et al., 2013).
Транспорт фенольных соединений в центральную вакуоль, первичную и вторичную клеточную стенку и срединную пластинку может осуществляться с током цитоплазмы или с помощью одномембранных пузырьков (рисунок 3) (Запрометов, 1993; Schnablov et al., 2006; Passamonti et al., 2009). В первом случае транспорт фенольных соединений через мембрану осуществляется с участием АВС-транспортеров, белков-переносчиков MATE (антипорт с Н+) или гомологов билитранслоказы (без затрат энергии) (Passamonti et al., 2009; Agati et al., 2013). Первостепенную роль в транспорте играют АВС-транспортеры (в основном MRP/GS-X-насосы), которые переносят с затратой энергии конъюгаты флавоноидов с глутатионом, образующиеся при действии цитоплазматических глутатион-S-трансфераз (Passamonti et al., 2009; Agati et al., 2012). Протон/флавоноидные антипортеры MATE переносят гликозилированные и ацилированные флавоноиды, а гомологи билитранслоказы (в клетках кожицы плодов) – антоцианы и некоторые бесцветные флавоноиды (Passamonti et al., 2009; Agati et al., 2012). Гомологи билитранслоказы найдены в сосудистых тканях плодов и во флоэме, что предполагает участие этих ферментов в дальнем транспорте (Passamonti et al., 2009). В вакуолях антоцианы образуют комплексы с белками – вакуолярные антоциановые включения, что защищает их от ферментативной деградации (Passamonti et al., 2009).
В случае везикулярного транспорта везикулы образуются при инвагинации оболочки пластид (Запрометов, 1993) либо из мембран шероховатого ЭПР или аппарата Гольджи (Passamonti et al., 2009).
В организме растения фенольные соединения преимущественно накапливаются в эпидермисе, хотя синтезироваться могут и в паренхиме (Passamonti et al., 2009; Agati et al., 2013).
Получение грибных препаратов для модификации питательной среды для каллусов
С целью стимуляции накопления фенольных соединений каллусами к ним в питательную среду вносили грибные добавки. Сначала для оценки перспективности использования микромицетов в биотехнологии вересковых было опробовано несколько разных вариантов модификации питательной среды. В качестве объектов исследования нами были выбраны разновозрастные каллусные культуры O. macrocarpus, культивируемые на свету и в темноте на средах Андерсона различного гормонального состава (НУК/Кин, или НУК/БАП, или НУК/иП). Питательные среды модифицировали путем увеличения концентрации сахарозы до 50 г/л. Кроме того, использовали добавки: пектин, стеариновая кислота, коммерческий препарат дрожжевого экстракта, автоклавированный высушенный мицелий Trichoderma virens (Miller, Giddens, Foster) Arx (штамм ВКМ F-1117), автоклавированный фильтрат его КЖ. КЖ вносили в количестве 5, 50 или 500 мл/л; остальные добавки – 50, 500 или 5000 мг/л. Добавки вносили в питательную среду до ее автоклавирования. Контролем служили каллусные культуры того же возраста, полученные на немодифицированной гормональной питательной среде Андерсона. В дальнейшем для модификации гормональной (НУК/Кин) питательной среды для каллусов O. palustris и O. macrocarpus использовали мицелий или КЖ микромицетов T. virens и Alternaria alternata (Fr.) Keissl. (штамм ВКМ F-1120).
Культуры грибов, полученные в жидкой питательной среде Чапека при постоянном помешивании, были любезно предоставлены доцентом кафедры биохимии и биотехнологии ННГУ И.В. Стручковой. Для работы использовали 14-дневные культуры T. virens и 5-дневные культуры A. alternata. Мицелий отделяли от КЖ фильтрованием через 4-слойный капроновый фильтр. Мицелий и фильтрат КЖ (содержащий остаточные питательные вещества и продукты метаболизма микромицетов) автоклавировали 20 мин при 1 атм. Мицелий затем высушивали при 60С и гомогенизировали. Подготовленные таким образом препараты мицелия и КЖ использовали для модификации питательной среды. Длительность одного пассажа – 5 недель. В автоклавированной КЖ определяли содержание углеводов, белков, фенольных соединений, а также рН. В автоклавированном и высушенном мицелии определяли содержание углеводов и фенольных соединений. Содержание белков определяли в гомогенате свежесобранного мицелия.
Модификацию питательной среды для каллусов также проводили белковыми фракциями, выделенными из мицелия T. virens и A. alternata.
Выделение белковых фракций из мицелия микромицетов проводили в холодных условиях по методу, описанному J.R. Al-Obaidi et al. (2016), с модификациями. Для этого 2 г мицелия T. virens и 1 г мицелия A. alternata гомогенизировали соответственно в 14 мл и 10 мл 0.1 М трис-HCl буфера с рН=7.2, содержащего 2 ммоль -меркаптоэтанола. Суспензию обрабатывали ультразвуком мощностью 90 Вт и частотой 30 кГц с помощью ультразвукового дезинтегратора Labsonic P (Sartorius, Германия) и центрифугировали в течение 20 мин при 14000g, 4C на центрифуге Z 36 HK (Hermle, Германия). Супернатант использовали для определения содержания мицелиальных белков и для дальнейшего выделения белковых фракций.
Для выделения белковых фракций к супернатанту добавляли равный объем 20% ТХУ в ацетоне, содержащей 0.07% -меркаптоэтанола, и оставляли на ночь при –20C. Выпавший осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 2990g, 4C. Осадок дважды промывали холодным ацетоном, содержащим 0.07% -меркаптоэтанола, при центрифугировании по 5 мин, 2990g, 4C. Полученный осадок суспендировали в 0.1 М NaOH (рН=12.5) на ротаторе Biosan (Латвия), после чего концентрировали с применением центрифужных фильтров (Merck, Ирландия) с порогом отсечения по молекулярной массе 3 кДа. Белковые фракции мицелия добавляли в питательную среду до ее автоклавирования в концентрации 17 мг белка/л (соответствует содержанию белка в мицелии в концентрации 500 мг/л). Контролем служили каллусные культуры, полученные на немодифицированной гормональной питательной среде Андерсона, содержащей соответствующее количество 0.1 М раствора NaOH. Длительность одного пассажа – 5 недель.
Накопление фенольных соединений у Vaccinium vitis-idaea, Oxycoccus palustris и Oxycoccus macrocarpus в условиях in vitro
Вторичные метаболиты, в т.ч. фенольные соединения, имеют выраженную экологическую функцию (Носов, 1994), поэтому содержание их в растительных тканях определяется как особенностями генотипа, так и условиями окружающей среды (Jaakola, 2003; Dias et al., 2016). В условиях in vitro влияние биотических факторов исключено, а влияние абиотических факторов строго контролируется. В таких условиях уровень фенольных соединений в растениях, очевидно, должен быть снижен по сравнению с растениями in vivo и в первую очередь определяться видоспецифичностью.
Работы со стерильными растениями in vitro V. vitis-idaea (Reed, Abdelnour-Esquivel, 1991; Ostroluck et al., 2010; Debnath, Vyas, Igamberdiev, 2012; Paprtein, Sedlk, 2015; Georgieva et al., 2016), O. palustris (Брилкина и др., 2006) и O. macrocarpus (Брилкина и др., 2006; Marcotrigiano, McGlew 1991; Polashock, Vorsa, 2002; Sedlk, Paprtein, 2011; Clapa, Fira, Vescan, 2012; Litwiczuk, 2013) посвящены в первую очередь особенностям их клонального микроразмножения. При этом чаще всего используют питательные среды WPM и Андерсона. Среда WPM разработана для культивирования древесных растений, а среда Андерсона – конкретно для рододендронов (Калинин, Кушнир, Сарнацкая, 1992). Среды различаются по содержанию органических и минеральных компонентов: среда Андерсона в целом беднее. В частности, содержание азота, калия, кальция, серы, магния, марганца и цинка в ней ниже, чем в среде WPM (таблица 3). Для клонального микроразмножения O. macrocarpus M. Marcotrigiano и S.P. McGlew (1991) указывали на предпочтительное использование среды Андерсона по сравнению со средой WPM. Однако уровень фенольных соединений в стерильных растениях V. vitis-idaea, O. palustris и O. macrocarpus и влияние на него состава питательной среды ранее не были охарактеризованы.
В ходе нашего исследования выявлено, что растения брусники и клюквы in vitro сохраняют способность к накоплению фенольных соединений (рисунок 12, таблица 17), уровень которых зависит от состава питательной среды. У микрорастений V. vitis-idaea и O. macrocarpus, выращенных на среде Андерсона, уровень РФС был в 1.5 раза больше, чем у микрорастений на среде WPM; у V. vitis-idaea был также вдвое больше уровень флавоноидов и катехинов. Кроме того, микрорастения O. macrocarpus на среде Андерсона были крупнее по размеру, чем на среде WPM: средняя длина побега составила 8.2 см и 2.6 см соответственно (рисунок 13). Таким образом, использование более бедной по минеральному составу среды Андерсона имеет ряд преимуществ перед использованием среды WPM.
В целом, при использовании среды Андерсона наибольший уровень РФС, флавоноидов и катехинов среди объектов исследования отмечен у микрорастений V. vitis-idaea; наименьший - у O. palustris. У трех сортов микрорастений O. macrocarpus уровень фенольных соединений был сходным и промежуточным между O. palustris и V. vitis-idaea.
Доля флавоноидов в фенольном комплексе микрорастений составила 84-97% у V. vitis-idaea, 55% у O. palustris, 52-66% у O. macrocarpus. Для растений V. vitis-idaea in vitro она в целом выше, чем для листьев растений in vivo, а для O. palustris и O. macrocarpus она такая же.
В связи с особенностями культивирования растений в стерильных, строго контролируемых, условиях in vitro накопление в них фенольных соединений может в некоторой степени отражать уровень их конститутивного синтеза
O. macrocarpus, сорт Ховес, среда Андерсона У V. vitis-idaea, O. palustris и O. macrocarpus межвидовые различия по накоплению фенольных соединений в условиях in vitro проявляются четче, тогда как в условиях in vivo они заметны в меньшей степени. Микрорастения V. vitis-idaea накапливают до 2.5 раз больше фенольных соединений, чем микрорастения O. macrocarpus и до 4.5 раз больше, чем микрорастения O. palustris. Различия между растениями V. vitis-idaea in vivo и in vitro по уровню фенольных соединений составляют не более 2.3 раза, а для O. palustris и O. macrocarpus – соответственно, не более 5.5 и 4.3 раз. Это говорит о более высокой биосинтетической способности брусники в сравнении с клюквой (особенно с O. palustris). С другой стороны, возможно, именно значительный уровень веществ фенольной природы, многие из которых являются ингибиторами роста, объясняет определенные трудности в культивировании V. vitis-idaea (меньшая всхожесть семян, медленный прирост биомассы по сравнению с O. palustris, в связи с чем материала хватило не на все анализы).
Накопление фенольных соединений у V. vitis-idaea, O. palustris и O. macrocarpus в условиях in vitro, которое не уступает их минимальному накоплению в условиях открытого грунта (in vivo), по нашему мнению, говорит о высокой функциональной значимости этих соединений для исследованных растений семейства Вересковые. В.М. Костиной (2009) показано, что другие представители семейства – Rhododendron smirnowii Trautv., Rh. ledebourii Pojark., Rh. japonicum (Grey) Suring. – в стерильных условиях тоже накапливали фенольные соединения (как суммарно, так и отдельных групп: флавонолов, флаванов, проантоцианидинов) не меньше, чем листья растений открытого грунта.
Итак, микрорастения брусники и клюквы могут накапливать фенольные соединения на уровне минимальных значений, определенных для листьев растений открытого грунта. Преимущественое накопление этих соединений происходит в условиях ограниченного минерального питания, в т.ч. по азоту, – на среде Андерсона.
Влияние грибных добавок на накопление фенольных соединений в каллусах Oxycoccus palustris и Oxycoccus macrocarpus
В связи с невысоким содержанием вторичных метаболитов в каллусных культурах актуальным является использование биотехнологических подходов, обеспечивающих усиление их биосинтеза. Основными известными подходами являются оптимизация состава базовой питательной среды, добавление в среду предшественников либо элиситоров, воздействие физическими факторами, клеточная селекция, иммобилизация клеток, биотрансформация, биоконверсия, генетическая инженерия (Shilpa, Varun, Lakshmi, 2010). Поиск стимуляторов важен также в плане изучения регуляции вторичного синтеза.
Использование элиситоров – один из перспективных подходов увеличения синтеза биологически активных веществ в условиях in vitro. Среди элиситоров самыми успешными признаны грибные препараты (Li et al., 2011; El-Nabarawy et al., 2015). Основная часть работ сфокусирована на увеличении синтеза алкалоидов и терпеноидов (Величко, 2004; Namdeo, 2007; Ghorpade, Chopra, Nikam, 2011; Karwasara, Tomar, Dixit, 2011); фенольным соединениям посвящено меньше исследований.
Некоторые фенольные соединения проявляют фунгицидную активность (Pehkonen et al., 2008) и являются вторичными элиситорами и фитоалексинами (Тарчевский, 2001; Lebel et al., 2012). Соответственно, использование грибных элиситоров в биотехнологии растений способно привести к усилению накопления фенольных соединений и/или изменению их качественного состава.
Для исследования влияния грибных добавок на накопление фенольных соединений в каллусах O. palustris и O. macrocarpus были выбраны микромицеты T. virens и A. alternata. Микроскопические грибы рода Trichoderma в подавляющем большинстве являются нефитопатогенными свободноживущими сапротрофами. Некоторые виды этого рода используются для защиты и стимуляции роста растений (препараты “Глиокладин”, “Триходермин”, “Триходекс” и др.) (Касимова и др., 2013). Микроскопический гриб T. virens был выбран из-за его непатогенности, высокой скорости роста, простоты культивирования и способности к элиситации синтеза некоторых вторичных метаболитов (Ming et al., 2013).
Микроскопические грибы рода Alternaria вызывают заболевания многих организмов (Левитин, 2017), в частности, растений семейства Вересковые (Kurniawan et al., 2018). В естественных условиях атака микроскопических грибов способна значительно усилить накопление растением защитных соединений (Шаймуллина и др., 2013), в т.ч. фенольных соединений.
Эффекты, вызванные добавлением в питательную среду грибных препаратов, зависят от их природы и концентрации, продолжительности элиситации, состава питательной среды, условий культивирования, возраста растительных культур (Namdeo, 2007). В связи с этим для оценки перспективности использования грибов в биотехнологии вересковых нами были использованы разновозрастные каллусы O. macrocarpus, культивируемые как на свету, так и в темноте, к которым в среду вносили органические соединения и грибные добавки.
Модификация питательной среды в ряде случаев привела к значительному увеличению накопления фенольных соединений в каллусах (таблица 23). Положительный эффект наблюдался в отношении каллусов, выращенных на свету, но не в темноте. Среди использованных добавок наибольший эффект оказало внесение не очищенных коммерческих субстратов, а автоклавированного высушенного мицелия гриба T. virens. В частности, в его присутствии содержание катехинов в каллусах увеличилось в 7 раз.
Для каллусов О. palustris стимулирующее влияние на накопление фенольных соединений оказали КЖ Т. virens (5, 50 мл/л) и A. alternata (50 мл/л) (рисунок 24). Максимальное увеличение обеспечило присутствие в среде 50 мл/л КЖ T. virens: содержание РФС по сравнению с контролем увеличилось в 4 раза, флавоноидов – в три раза, катехинов – в 6 раз и проантоцианидинов – в 7.5 раз.
Для каллусов O. macrocarpus стимулирующее влияние на накопление фенольных соединений оказали мицелий T. virens (50 мг/л) и A. alternata (50, 500 мг/л), а также КЖ этих микромицетов (кроме КЖ A. alternata в концентрации 500 мл/л). Максимальный эффект обеспечили мицелий (50 мг/л) и КЖ (50 мл/л) T. virens: увеличение уровня РФС и проантоцианидинов составило два раза, флавоноидов и катехинов – 5 раз.
В связи с отсутствием ярко выраженного стимулирующего влияния мицелия T. virens и A. alternata на накопление фенольных соединений в каллусах O. palustris, нами была проведена еженедельная регистрация уровня этих соединений у каллусов, к которым в среду добавили мицелий в концентрации 50 мг/л. Добавление мицелия T. virens вызвало увеличение накопления каллусами РФС в два раза и проантоцианидинов в 2.5 раза на 2 неделе культивирования (рисунок 25). Добавление мицелия A. alternata вызвало увеличение накопления фенольных соединений в течение первых 4 недель культивирования. Максимальное увеличение накопления РФС и катехинов отмечено на 4 неделе, когда их уровень превышал контрольный уровень в 2-2.5 раза. При этом уровень РФС (21 мг/г сырой массы) был наибольшим среди значений, когда-либо зарегистрированных нами для каллусов O. palustris. Вероятно, отмеченное ранее (рисунок 24) отсутствие стимулирующего эффекта мицелия в отношении каллусов O. palustris объясняется тем, что уровень вторичных метаболитов регистрировался через 5 недель культивирования, а не через 4 недели.
Природа элиситирующих веществ микромицетов изучена недостаточно. Значительное внимание исследователей уделяется полисахаридам как индукторам вторичного синтеза (Ghorpade, Chopra, Nikam, 2011; Li et al., 2011; Mihai et al., 2011) и в меньшей степени – белкам (Mal et al., 2011; Dias et al., 2016).
Для выявления возможности увеличения накопления фенольных соединений растительными клетками под действием грибных белков в питательную среду для каллусов O. palustris добавляли белки, выделенные из мицелия T. virens и A. alternata. Положительное влияние белков мицелия (рисунок 26) было значительнее, чем самого мицелия (рисунок 25). Максимальный эффект в случае белков мицелия T. virens проявился на 2 неделе: уровень РФС увеличился в 8 раз по сравнению с контролем, катехинов – в 11 раз, проантоцианидинов – в 15 раз. Содержание флавоноидов в контрольных каллусах было низким и не детектировалось, а при добавлении белков мицелия T. virens достигало 6 мг/г сырой массы.
Максимальный эффект в случае белков мицелия A. alternata проявился на 5 неделе пассажа: уровень РФС и катехинов увеличился в 6-7 раз по сравнению с контролем, проантоцианидинов – в 24 раза. Содержание флавоноидов достигало 3 мг/г сырой массы.
Доля флавоноидов в фенольном комплексе каллусов, выращенных на средах с добавлением мицелия, КЖ и белков мицелия микромицетов, не изменилась по сравнению с каллусами в возрасте 6-12 пассажей и составила около 53%.
В отличие от автоклавированного высушенного мицелия микромицетов T. virens и A. alternata, выделенные мицелиальные белки оказали стимулирующее влияние на накопление биомассы каллусов, которое проявилось начиная с 3 недели (рисунок 27 – в качестве примера приведена динамика накопления сырой биомассы каллусов; динамика накопления сухой биомассы была сходной).