Na+ -АТФазы галотолерантных водорослей Попова Лариса Геннадьевна

Содержание к диссертации

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ 7

ВВЕДЕНИЕ 8

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 17

1.1. Активный транспорт ионов Na⁺ через биологические мембраны 17

1.1.1. Первичные №⁺-помпы у представителей различных 17
систематических групп

1.1.1.1. Первичные Ыа⁺-помпы у представителей царства Bacteria 20

Net-транслоцирующие декарбоксилази 20

Na-транслоцирующие NADH.xuhoh оксидоредуктазы (NQR) 21

Na⁺-зависимые FiFo-A ТФазы 22

Na*-транслоцирующие АТФазы V-muna 23

Nd^-транслоцирующая А ТФаза P-muna 24

Na*-транспортеры ABC-типа 25

1.1.1.2. Первичные Иа⁺-помпы у представетелей царства Archaea 25

Na*-транслоцирующие метилтрансферазы метаногеиных бактерий 25

Na*-зависимые АТФ-синтазы 25

1.1.1.3. Первичные Na⁺-noMnbi эукариот 26

Na*, К"-А ТФаза клеток животных (царство Animalia) 26

Na⁺-A ТФаза клеток животных (царство Animalia) 28

Na^-АТФаза дрожжей (царство Fungi) 29

Na*-A ТФаза морских микроводорослей - представителей царства 30
Chromista

Na*-A ТФаза мхов (царство Plantae) 31

У высших сосудистых растений первичные Na*-насосы не 32
обнаружены

1.1.2. Na7H* антипортер - универсальный механизм вторично- 33
активного транспорта

Na*/H* антипортеры - гетерогенная группа мембранных белков 34

Пространственная структура Na*/H* антипортеров 35

Регуляция Na⁺/H* антипортеров 36

Функции Na*/tt антипортеров 37

1.1.3. У одного и того же организма экспорт Na⁺ может 39
осуществляться как первично-активным (Na⁺-Hacoc), так и
вторично-активным (Na7H⁺ антипортер) механизмом

1.2. Некоторые аспекта адаптации высших растений к повышенным 40
концентрациям NaCl

1.2.1. Возможные пути поступления Na⁺ в цитоплазму растительной 42
клетки

Входные It-каналы (KIRC или КАТ/АКТ) 42

Выходные К*-каналы (KORC) 43

Потенциал-независимые неселективные катионные каналы (NSCC 43
илиПС)

Низкоаффинные катионные переносчики (LCT1) 44

Высокоаффинные К*-переносчики: белки семейств KUP/HAK и НКТ 45

1.2.2. Галофигы контролируют поступление Na⁺ в растение 47

Ограничение проницаемости плазматической мембраны для ионов 49
Na⁺ у галофитов

Апопластный путь поступления Na* в растение и анатомические 51
особенности строения корня у галофитов

1.2.3. Активный транспорт Na⁺ из цитоплазмы растительной клетки: 52

Na⁺/H⁺ антипортеры плазмалеммы и тонопласта

Na*/ft антипортер плазматической мембраны 53

Na/ІҐ антипортер тонопласта 55

Na⁺/H* антипортеры плазмалеммы и тонопласта в условиях 56
солевого стресса

Компартментация Na* в вакуоли и синтез осмолитов 58

1.2.4. КҐ-АТФаза плазматической мембраны клеток растений 59

Pt~A ТФаза - представитель семейства АТФаз Р-типа 60

Множественность изоформ ІҐ -А ТФазы растений 64

Различие свойств индивидуальных изоформ ft-АТФазы 65

Регуляция активности ft-А ТФазы 66

С-терминальный домен ft-А ТФазы - мишень для регуляции 68
фермента

Регуляция ft-А ТФазы в условиях солевого стресса 72

1.3. Галотолерантные микроводоросли как промежуточное звено между 75 прокариотами и высшими растениями в эволюции систем транспорта Na⁺

1. Ионное гомеостатирование цитоплазмы у галотолерантных 77 микроводорослей

2. tf-АТФаза в плазматической мембране микроводорослей 79

3. Na7H* антипортер плазматической мембраны микроводорослей 81

4. Отвечает ли Na⁺/FT антипортер за экспорт ионов Na⁺ из 82 цитоплазмы галотолерантных микроводорослей в естественных условиях обитания этих организмов?

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 84

5. Объекты исследования и условия культивирования 84

6. Выделение плазматической мембраны из Tetraselmis viridis 85

7. Выделение плазматической мембраны из Dunaliella maritima 87

8. Мечение плазматических мембран Т. viridis и A maritima 88 экзогенным маркером, ^,25Г

9. Регистрация активностей Na⁺ -АТФазы и Н*- АТФазы в 89 плазматической мембране микроводорослей

10. Регистрация фосфорилированного интермедиата Na⁺-АТФазы 92 Т. viridis

11. Аналитические методы 94

12. Другие методы 96

Глава 3. ЬҐ-АТФаза и Na⁺/H* АНТИПОРТЕР В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ (МОРСКИХ) МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima. 98

3.1. Плазматическая мембрана микроводорослей: получение и 100
характеристика

13. Применение экзогенной метки, ^п\ как маркера плазматической 100 мембраны микроводорослей

14. Плазматическая мембрана микроводоросли Т. viridis 101

15. Плазматическая мембрана микроводоросли Д maritima 107

3.2. АТФазная активность препаратов плазматической мембраны ПО
Т. viridis и Д. maritima

рН-зависимость гидролиза АТФ 110

Влияние ингибиторов мембранных АТФаз на АТФазную активность 112 препаратов плазматической мембраны микроводорослей.

3. Функциональная идентификация протонной помпы (ЬҐ-АТФазьі) в 116 плазматической мембране Т. viridis и Д. maritima

4. Na⁺/H* антипортер в плазматической мембране Т. viridis и 119 Д maritima

5. Теоретическая оценка эффективности экспорта ионов Na⁺ из клеток 121 галотолерантных микроводорослей посредством AjiH-зависимого Na⁺/H* антипортера

Глава 4. Na⁺- АТФаза В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ
ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ: ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И СВОЙСТВА. 125

1. АТФ-зависимая аккумуляция ^MNa⁺ везикулами плазматической 125 мембраны Т. viridis и Д maritima

2. Ка⁺-транспортирующая АТФаза галотолерантных водорослей и 131 сопряженный транспорт ионов Н⁺

3. Na⁺- АТФаза Т. viridis осуществляет электрогенный Na*/!!* обмен 132

4. Na⁺-АТФаза Д maritima осуществляет транслокацию ионов Na⁺ 143 через мембрану по унипортерному механизму

Глава 5. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДВУХ ИОННЫХ
НАСОСОВ, Н*-АТФазы и Na'-АТФазы, ФУНКЦИОНИРУЮЩИХ в
ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ
МИКРОВОДОРОСЛЕЙ. 148

5.1. Ыа⁺-АТФазы T.viridis и D.maritima как возможные участники 149

системы рН-статирования в клетках этих водорослей

5.2. Ыа⁺-АТФаза и Na⁺-roMeoera3. Зависимость активностей Na⁺- 152
АТФаз Т. viridis и D. maritime от концентрации ионов Na⁺

5.3 Влияние свободных Mg²⁺ и АТФ на активности двух АТФаз в ПМ 154 Т. viridis

4. Зависимость активностей НҐ-АТФазьі и №⁺-АТФазы Т. viridis от 157 концентрации комплекса MgATФ

5. Влияние некоторых ингибиторов мембранных АТФаз на 159 активности ЬГ-АТФазы и Na⁺-АТФазы Т. viridis

6. Различия в свойствах Н⁺-АТФазы и Ыа⁺-АТФазы как основа для 162 быстрой регуляции этих ферментов в условиях

гиперосмотического солевого шока

Глава 6. ФОСФОРИЛИРОВАННЫЙ ИНТЕРМЕДИАТ Na⁺- АТФазы

Tetraselmis viridis. 165

1. Фосфорилирование белков в препаратах плазматической 166 мембраны Т. viridis. Влияние ионного состава среды

2. Кинетика фосфорилирования белков 169

3. Влияние ортованадата на фосфорилирование белков 171

4. Химическая природа фосфат-белковых связей 171

5. Pulse-chase эксперименты 173

6. Белок 100 кД - фосфорилированный интермедиат Ка⁺-АТФазы 174 Т. viridis

Глава 7. Ыа⁺-АТФаза И АДАПТАЦИЯ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
К СРЕДАМ РАЗЛИЧНОЙ СОЛЕНОСТИ. 179

7. Регистрация фосфоинтермедиата Ыа⁺-АТФазы в плазматической 180 мембране Т. viridis, адаптированной к средам различной солености

8. Функциональные характеристики Иа^-АТФазы Т. viridis> 181 адаптированной к средам различной солености

9. Кинетические модели предсказывают возможность существования, 183 по крайней мере, двух изоформ Ка⁺-АТФазы Т. viridis

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 191

ВЫВОДЫ 200

ЛИТЕРАТУРА 203

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

АДФ- аденозин 5 '-дифосфат

АТФ - аденозин 5 '-трифосфат

АО - акридиновый оранжевый

Оксонол VI - бис-(3-пропил-5-оксоизоксазол-4-ил)пентаметин оксонол

ПААГ - полиакриламидный гель

Пиранин - 8-гадроксипирен-1,3,6-трисульфоновая кислота

ПМ - плазматическая мембрана

ВТР - Bis-Tris-Propane, 1,3-бис[трис(гидроксиметил)-метиламино]пропан

СССР - карбонилцианид хлорфенилгидразон

DCCD - N, N'-дициклогексилкарбодиимид

DTT - дитиотреитол

EDTA - этилендиаминтетрацетат

EGTA - этиленгликоль-бис[Р-аминоэтилэфир]-К,К,Ы\К"-тетраацетат

HEPES - Ы-[2-гидроксиэтил]пиперазин->Г-[2-этансульфонат]

MES -2-[М-морфолино]этансульфонат

NCDC - 2-нитро-4-карбоксифенил Ы,Ы-дифенилкарбамат

NEM - #-этилмалеимид

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

SDS - лаурил сульфат, Na-соль

Tris - трис-(гидроксиметил)аминометан

ДцН -разность электрохимических потенциалов протона

Д\|/ - разность электрических потенциалов

Введение к работе

Ыа⁺-гомеостаз цитоплазмы является общим свойством всех организмов, независимо от их таксономической принадлежности. Исследование механизмов Ыа⁺-гомеостатирования у представителей разных систематических групп имеет фундаментальное значение и вносит вклад в установление путей эволюционного развития жизни на Земле.

Na⁺ в высоких концентрациях нарушает нормальную работу биополимеров и поэтому все живые клетки, независимо от таксономической принадлежности и условий обитания, поддерживают низкие концентрации этого иона в цитоплазме. Даже у галобактерий¹ - единственных организмов, которые проявляют устойчивость к соли на молекулярном уровне и в клетках которых суммарные концентрации Na⁺ и К⁺ достигают, в зависимости от условий выращивания, 3 - 5 М [Brown, 1964; Ginzburg et al., 1971], ионный состав цитоплазмы отличается от ионного состава наружной среды. В то время как в наружной среде доминирующим катионом, как правило, является Na , в клетках этих организмов в молярных концентрациях накапливается К⁺ (внутриклеточные концентрации К⁺ могут в несколько раз превышать концентрации Na⁴) [Lanyi, 1974; Oren, 1986; Oren et al., 1997; Oren et al., 2002].

Предполагается, что метаболическая токсичность Na⁺ в большой мере является результатом его способности конкурировать с К⁺ за места связывания в биополимерах, важных для клеточного функционирования. Следовательно, при высоком соотношении Na⁺:K⁺ многие ферментативные процессы в цитоплазме могут быть нарушены. В частаости, нарушение процессов синтеза белка высокими концентрациями Na⁺ рассматривается как один из примеров токсического действия Na⁺ на клеточный метаболизм. Механизм синтеза белка

¹ Здесь термином галобактерий мы объединяем две филогенетически не связанные группы микроорганизмов: экстремально галофильные археи, Halobacteriales, которые не способны расти при концентрациях NaCl менее 15 + 20% [Lanyi, 1974; Кашнер, 1981], и анаэробные галофильные бактерии, Haloanaerobiales [Oren, 1986; Oren et al., 1997].

требует высоких концентраций К⁺, который необходим для связывания тРНК с рибосомами; Na⁺ в этом процессе выступает в роли конкурента К⁺ [Blaha et al., 2000].

Естественная среда обитания галотолерантных/галофильных организмов содержит в большей или меньшей концентрации ионы Na⁺. Градиент электрохимического потенциала Na⁺ направлен из наружной среды в цитоплазму и, соответственно, Na⁺ поступает в клетки этих организмов пассивно. Выведение Na⁺ из клеток должно осуществляться активно, с затратой метаболической энергии.

В ходе эволюции в клеточных мембранах организмов, обитающих в соленых средах, возникли многообразные Ма⁺-транспортирующие системы, осуществляющие активный (против градиента электрохимического потенциала) перенос этого иона через мембраны. ^-транспортирующие системы делятся на две группы по принципу своей энергизации. Одну группу составляют гетерогенные по своей первичной структуре белки, осуществляющие вторично-активный транспорт Na⁺ через мембраны в обмен на протон, - NaVH⁺ антипортеры [Padan et al., 2001]. Na*/!!* антипортеры являются универсальным механизмом, т.е. они обнаруживаются в различных биологических мембранах и у организмов самого разного эволюционного происхождения. Экспорт Na⁺ из клеток посредством Na^H* антипортера осуществляется за счет энергии электрохимического градиента Н⁺, который создается на клеточных мембранах генераторами протонного градиента различной природы.

Другую группу составляют первично-активные механизмы транспорта Na⁺ - Na^-помпы, непосредственно сопрягающие химические реакции превращения субстрата с транспортом ионов Na⁺ через мембрану.

Наиболее широко известной и хорошо изученной Na^-помпой является открытая в 1957 г. Йенсом Скоу Ыа⁺,К⁺-АТФаза животных клеток [Skou, 1957]. Этот фермент, используя энергию гидролиза АТФ, выводит ионы Na⁺ из клеток в обмен на ионы К⁺, а генерируемый при этом градиент электрохимического потенциала ионов Na⁺ используется во вторично-активных процессах котранспорта различных веществ через клеточную мембрану.

Первичные №⁺-помпы разнообразной природы найдены в плазматических мембранах представителей прокариотических царств, Bacteria и Archaea [Dimroth, 1997]. Это Ма⁺-транспортирующие декарбоксилазы и оксидоредуктазы бактерий, Ма⁺-транспортирующие метилтрансферазы архебакгерий, Na⁺-транспортирующие АТФазы различных типов, обнаруженные у бактерий и архей. Часто в плазматической мембране галотолерантного микроорганизма сосуществуют первичный Na⁺-Hacoc и ДцН-зависимый Na⁺/H* антипортер [Скулачев, 1986; Dimroth, 1997].

Долгое время Ыа⁺,К⁺-АТФаза животных клеток оставалась единственным представителем Ыа⁺-транспортарующих ферментов, обнаруженных у эукариот. Однако в 90-е годы 20-го века Ыа⁺-АТФаза была найдена у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schwanniomyces occidentalis [Наго et al., 1991; Bafluelos, Rodriguez-Navarro, 1998] и у морской микроводоросли Heterosigma akashiwo [Wada et al., 1989; Shono et al., 1995]. Отметим, что все обнаруженные у эукариот Na⁺-ro>Mnbi являются АТФазами Р-типа.

Таким образом, к началу нашей работы первичные Ка⁺-помпы были обнаружены у представителей большинства царств живого мира - Bacteria, Archaea, Chromista¹ (к этому царству относится микроводоросль К akashiwo), Fungi, Animalia, за исключением царства растений. Мы предприняли попытку восполнить этот пробел.

Объектами нашего интереса являются морские (галотолерантные) микроводоросли двух видов, Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima (царство Plantae, тип Prasinophyta) [Bisby et al, 2006; см. также электронный ресурс

² В царство Chromista выделены организмы (преимущественно, окрашенные, хотя есть и бесцветные), обладающие рядом особенностей, которые не наблюдаются у представителей других эукариотических царств. У хромист цитоплазма окружена четырьмя мембранами; есть также особенности в строении флагелл, пластид и устройстве генетического аппарата [www//en.wikipedia.org]. Ранее фотосинтезирующие хромисты относили к растительному царству, а нефотосинтезирующие - к грибам и животным. Фотосинтезирующие хромисты имеют ряд принципиальных отличий от растений. Так, хромисты содержат хлорофилл с, а также и другие пигменты, которые не встречаются в растениях. В отличие от растений, хромисты не запасают энергию в форме крахмала.

Catalogue of Life: 2006 Annual Checklist, сайт ]. Естественной средой обитания этих организмов является морская вода, где концентрация NaCl составляет, в среднем, 0,5 М.

Установлено, что в цитоплазме галотолерантных водорослей концентрации ионов Na⁺ существенно (в 10-20 раз) ниже, чем концентрации этого иона в наружной среде [Балнокин, Медведев, 1984; Балнокин, Мазель, 1985]. Это предполагает существование механизмов откачки ионов Na⁺ из цитоплазмы галотолерантных водорослей, Необходимо отметить, что в клетках этих микроорганизмов отсутствует крупная центральная вакуоль, в связи с чем основную роль в поддержании ионного гомеостаза в цитоплазме играет плазматическая мембрана клетки и расположенные в ней ион-транспортиру юшие механизмы.

На основании данных по измерению внутриклеточных концентраций Na⁺, был выдвинут постулат о существовании в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей механизмов активного экспорта Na⁺, но вопрос о том, какие это механизмы, оставался открытым. К началу нашей работы существовали экспериментальные свидетельства тому, что в плазмалемме галотолерантных микроводорослей функционирует ЇҐ-АТФаза (генератор протонного градиента на этой мембране) [Gimmler et al., 1989; Weiss et al., 1989; Smahel et al., 1990] и ДцН-зависимый Na⁺/H⁺ антипортер [Katz et al., 1986; 1989; 1991]. Последний рассматривался в качестве возможного механизма экспорта ионов Na* из клеток в наружную среду.

Однако может ли ДцН-зависимый Na⁺/H⁺ антипортер быть эффективным регулятором содержания Na⁺ в цитоплазме у морских микроводорослей? В естественных условиях обитания этих организмов высокие концентрации соли (около 0.5 М NaCl) сочетаются со щелочной реакцией среды (рН около 8) [Виноградов, 1967]. Поскольку у водорослей рН цитоплазмы не выходит за пределы диапазона 7.1 - 7.9 [Денеш и др., 1977; Kirst, 1977; Goyal et al., 1987], т.е. более кислый, чем наружная среда, становится очевидным, что существуют термодинамические ограничения на экспорт Na⁺ из клеток посредством АцН-зависимого NaVH* антипортера. Кроме того, ряд экспериментальных данных,

полученных в исследованиях in vivo на галотолерантных водорослях, свидетельствовал о том, что экспорт Na⁺ из клеток этих организмов не вполне может быть описан в рамках работы вторично-энергизуемого механизма [Балнокин, Медведев, 1984; Katz et al., 1991; Whittington, Bisson, 1994; Kiegle, Bisson, 1996].

Исходя из вышеизложенного, мы пришли к гипотезе, что в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует первичный Ыа⁺-транспортирующий насос. Мы предположили, что этот насос -АТФаза Р-типа, поскольку, как уже было сказано выше, все обнаруженные к настоящему времени у эукариотических организмов первичные Na⁺-noMnu являются Ыа⁺-транспортирующими АТФазами Р-типа.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлось экспериментальное подтверждение гипотезы о функционировании в плазматической мембране морских (галотолерантных) микроводорослей первичной Na^-помпы - Ыа⁺-транспортирующей АТФазы, осуществляющей экспорт ионов Na⁺ из клеток в наружную среду. Были поставлены и решены следующие задачи, определяемые целью работы:

1. Разработаны методы получения препаратов плазматической мембраны, находящейся в виде замкнутых везикул и сохраняющей в функционально-активном состоянии ион-транспортные системы, из двух видов галотолерантных микроводорослей, Tetraselmis viridis и Dunaliella maritima.

2. На выделенных из Т. viridis и D. maritima везикулах плазматической мембраны продемонстрирован АТФ-зависимый транспорт ионов Na⁺ и получены доказательства его независимости от протон-движущей силы на мембране, т.е. у двух видов галотолерантных микроводорослей функционально идентифицирован первичный Ка⁺-транспортирующий механизм - Na⁺-АТФаза.

3. На выделенных везикулах плазматической мембраны галотолерантных водорослей продемонстрирован также АТФ-зависимый транспорт Н*, т.е. функционально идентифицирована Н⁺-АТФаза.

(4) На выделенных везикулах плазматической мембраны из двух видов
водорослей функционально идентифицирован Na⁺/H* антипортер.

5. Исследованы свойства обнаруженных в плазматической мембране двух видов галотолерантных микроводорослей Ыа⁺-АТФаз.

6. Исследованы свойства обнаруженных в плазматической мембране двух видов галотолерантных микроводорослей РҐ-АТФаз.

(7) Проведен сравнительный анализ свойств двух помп, Ка⁺-АТФазы и Н⁺-
АТФазы, функционирующих в плазматической мембране Г. viridis, как
механизмов, ответственных за ионное гомеостатирование цитоплазмы у этого
организма.

Основные положения, выносимые на защиту.

(1) В плазматической мембране галотолерантных (морских) микроводорослей,
относящихся к растительному царству, функционирует первичная Ыа⁺-помпа -
Ыа⁺-транспортирующая АТФаза Р-типа.

2. Наряду с первичной Na⁺-noMnofl, Ка⁺-транспортирующей АТФазой, в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует ЬГ-АТФаза - фермент, присутствие которого характерно для плазматических мембран растительных клеток.

3. В плазматической мембране галотолерантных микроводорослей функционирует также универсальный механизм транспорта Na⁺ - Na'VH* антипортер.

(4) В естественных условиях обитания галотолерантных микроводорослей
экспорт Na⁺ из цитоплазмы в наружную среду осуществляет №⁺~АТФаза, тогда
как Na⁺/H* антипортер не вовлечен в этот процесс, а является, по-видимому,
частью системы рН-статирования цитоплазмы.

Научная новизна. Впервые в плазматической мембране галотолерантных
организмов, относящихся к царству растений, функционально

идентифицирована и охарактеризована помпа, осуществляющая первично-активный перенос ионов Na⁺ через эту мембрану, - Ыа⁺-транспортирующая

АТФаза. Ыа⁺-АТФазы обнаружены у двух видов морских микроводорослей -Tetraselmis viridis и Dmaliella maritima (царство Plantae, тип Prasinophyta, класс PrasinophyceaeJ. Найденные Ыа⁺-АТФазы являются новыми членами семейства Ыа⁺-АТФаз, описанных к настоящему времени у представителей домена Еисагуа (животных, грибов и мхов). Показано, *гго в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей наряду с Ка⁺-АТФазой существует вторично-активный механизм переноса ионов Na⁺ через плазматическую мембрану -Na⁺/H* антипортер, работа которого зависит от протон-движущей силы на мембране и сопряжена с работой протонной помпы, ІҐ-АТФазьі. Последняя также функционально идентифицирована в плазматической мембране указанных видов водорослей. На основании данных, полученных при исследовании транспорта ионов Na⁺ через плазмалемму интакгных микроводорослей, а также теоретических расчетов, сделано заключение, что у галотолерантных микроводорослей в естественной среде обитания механизмом, отвечающим за Ыа⁺-гомеостатирование цитоплазмы, является Ка⁺-АТФаза, тогда как Na⁺/H⁺ антипортер является, по-видимому, частью системы рН-статирования клетки

Исследованы функциональные свойства обнаруженных Ыа^АТФаз, а также ЬҐ-АТФаз, и выявлена роль таких факторов цитоплазматического окружения как рН, концентрации ионов Na⁺ и Mg²⁺, концентрация АТФ в регуляции активности этих ферментов.

Определены механизмы работы двух Ка⁺-АТФаз. Показано, что Na⁺-АТФаза Т. viridis осуществляет электрогенный обмен Na⁺ на Н* со стехиометрией mNaVnrf", где m>n. Ыа⁺-АТФаза D. maritima переносит только ионы Na⁺ и, соответственно, также является элекгрогенным ферментом.

Идентифицирован фосфорилированный интермедиат №⁺-АТФазы Т. viridis и определена его кажущаяся молекулярная масса. Исследованы закономерности процессов фосфорилирования и дефосфорилирования Na⁺-АТФазы Т. viridis в ходе каталитического цикла этого фермента.

На основании исследований транспортных функций Ка⁺-АТФазы Т. viridis предложены: (1) гипотеза, предполагающая функционирование, по крайней мере, двух изоформ этого фермента в плазматической мембране водоросли и (2)

математическая модель, описывающая функционирование этих изоформ при адаптации данной водоросли к высоким концентрациям NaCl.

Предложена модель быстрой регуляции активностей Ыа⁺-АТФазы и Н*-АТФазы - ферментов, сосуществующих в плазматической мембране галотолерантных микроводорослей, факторами цитоплазматического окружения (рН, концентрации Na⁺ и Mg²⁺, АТФ) при гиперосмотическом солевом шоке.

Научно-практическая ценность работы. Представленная работа является фундаментальным исследованием, раскрывающим механизмы адаптации одноклеточных галотолерантных эукариот - морских микроводорослей, относящихся к царству растений, к высокому содержанию солей в среде обитания. Полученные новые данные вносят вклад в современные представления о клеточных механизмах ионного гомеостатирования у галотолерантных организмов.

Материалы диссертации могут быть рекомендованы для включения в учебные пособия и лекционные курсы по физиологии солеустойчивости растений и физиологии растительной клетки на биологических факультетах высших учебных заведений.

Апробация работы. Результаты работы по теме диссертации были доложены или представлены на V Международном молодежном симпозиуме «Регуляция метаболизма в растениях» (София, 1991), на XV Международном биохимическом конгрессе (Реховот, 1991), на Втором съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1992), на Международном симпозиуме по физиологии, биохимии и генетике солеустойчивости растений (Ташкент, 1992), на VIII Конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (Антверпен, 1992), на 11-м Международном совещании по биологии мембран растительных клеток (Кембридж, 1998), на IV Съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), на Пятой Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2001), на 27-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (Лиссабон, 2001), на 12-м

Международном семинаре "Plant membrane biology" (Москва, 2001), на Международном симпозиуме "Plant under environmental stress" (Москва, 2001), на Международном симпозиуме "Signalling systems of plant cells" (Москва, 2001), на II Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Москва, Дубна, 2001), на годичном собрании Общества физиологов растений России «Экспериментальная биология растений 2001» (Уфа, 2001), на Международной научной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001), на III Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), на VI испано-португальском симпозиуме "Relaciones hidricas en la plantas" (Памплона, 2002), на 12-м Международном совещании по биологии мембран растительной клетки (Мэдисон, 2001), на V Съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), на XIII Международном совещании по биологии мембран растительной клетки (Монпелье, 2004), на Всероссийской научной конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), на Международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 43 работы, в том числе 21 статья в научных журналах и сборниках трудов.