Введение к работе
Актуальность проблемы. Фотосинтез - процесс, обеспечивающий накопление органических веществ, представляет собой важ-нойшее звено метаболизма, ответственное за продуктивность растений tКичипорозич, 1979; Мгжроносов. 1988). Устойчивость данного процесса к различным неблагоприятным факторам среды (обезвоживание, засолочио, высекая инсоляция, пониженна и повышенна температуры) является важнейшим свойством растения. Шзизндо при{«ды устойчлпости фотосинтетичне ко го аппарата и его адаптации к неблагоприятным внешним условиям на молекулярном уровне позволит и перспективе откорректировать ей биотехнологическим путем.
Одной из причи:і, приводящих к изменению фстееинтет и ческой деятельности при стрессах, является нарушение мембранной системы хдоролластсЕ, что ведет к несогласованности р^аа-ий фотосинтеза (Berry st al. , 1930; Kruoa. 193Q). Однако получению в последнее время данные по влияний экстремальных факторов на состояние и функционирование фотосинтетическоге ап-парата не могут беть объяснены только изменениями структуры мембран хлороплаетоа (Fork et al. , 10S4, 1930; Griffith et al. , 1935; Gasanov. 1938). Предполагается, что bo многих случаях повреждение обусловливается непосредственно состоянием супермолекулярных комплексов, рэгулкруших фотосинтетический процесс. Изучение этих вопросов носит отрывочный, неполный характер и требует систематических исследований.
Настоящая работа являлась частью исследований, проводимых в лаборатории биофизики Института ботаники АН Азербайджанской Республики под руководством д. б. в., проф. Р. А. Гасано-ва в рамках координационного плана КИР Alt СССР по направлениям: Принципы преобразования солнечной энергии при фотосинтезе, . ?8.6. 2, К гос. регистрации 61095922, 81095323; Исследование принципов биосинтеза хлорофилл-белковых комплексов и и« организация в мембранах хлоропласта, М гос. регистрации 01.86.0 080671, 01.91.0 041188; Ыаучно-технических исследований - Разработать методы управления биосинтезом хлорофилл- белковых комплєіїсов на основе изучения их сборки в хлоропластах, постановление ГКНГ и АН СССР от 03.02.67г., N 6/13, 0.74І05, 16. Ні.
] ЦЕНТРАЛЬНАЯ ~1
1 НЛЇ-ЧНАЧ г'-рдиОТЕКА I
J Моск.сєд, . ''Эдбмкн I
\ им. К. , .,,^6 j
і ии8 шА=злт^\
. 4 -
Ііели и__зэдачи^*^здо^анж[^ Пояски путей исследования
принципов раб&ты фотосинтетического аппарата в условиях стресса привел;; нчс к необходимости изучения взаимосвязи мо-декулярноЯ организаики тилакоидов хлоропластсв с, проявлением его функции в алекватнУх условиях. Выполнение поставленной цели предопределило экспериментальное решение еледуюшю за-дач:
1. Изучить изменения в структурно-функциональных харак
теристиках фотосинтетячеедаго дапарата растений, подвергнутых
водному стрессу: ечзЕить изменения в раОоте кислород- вьщеляю-
лего комплекса, установить пункты повреждения оиоринтеяа-Хл. и
есоСенности построения хлорофилл-белковых комплексов и расс
мотреть процесс ш; ре распределения энергии как возмохнмй ме
ханизм адаптации;
-
Провести исследования фотосинтетических тункдай и организации пигмент-белковых комплексов тила::оидоь при пониженных температурах: определить характер изменения пигментного аппарата, состояние Фотосистемы 11 к цепи транспорта электронов, изменения ъ состоянии м^мораяи тилакоидрв и изменения в организации Xffi и полипелтидиого состава тилакоидов;
-
Выявить гркродо Фотоловрелдения энергопреоораэушвх мембран: исследовать фотодеструктивные процессы, лелаше в основе повреждения пигментов, мембран тилакоидов, пигмент -Оелкових комплексов, полипептидного состава изолированных ХЕК. и провести поиск способов стаоилкгацки изолированных структур тилакоидов хлоропласта.
Научная новизна работы. Установлено, что факторы среды {обезвоживание, низкие температуры, сильный свет) изменяют как формирование организации тилакоидов на молекулярном уроь-не, так и характер протекания фотосинтетичне ко Г'о процесса. Дефицит веды подавляет этап синтеза Хл, связанней с перестройкой ХЕК, но не затрагивает, а даме ускоряет переход агрегированного Хлда ъ вгрггиронанный Хл. Сильный свет приводит к резкому подавлении) с/нтеаа длинноволновых форм Хл. Шлилен-тидныи состав комплексов более консервативен и меньше подвергается изменениям при стрессе. Выявлены теоретические подходы к стаоилизгадщ комплєіїсов. Дефицит коды, пеннж&ннае температуры и сильный свет изменяют суГ^ииничный состав различных ХЕК, приводя к возрастанию доли м-энзмеГ'ЬНх суРъедикш, за
счет синтеза менее устойчивых олигомервік и димерішх Форм. Последние изменения являктся уннеереальными и определяют адаптационные возможности фотоскнтетического аппарата.
Совокупность полученных результатов позволила выдвинуть положение о аначеьиі* фстосинтетическогс аппарата как. ключевого Фактора, сп ре делящего устойчивость растений. Ведущая роль фотссинтетическсго аппарата обусловливается пове^киеы пигмент -белковых комплексов, устойчивость которых, в первук очередь, нарушается при. teeх исследован к их стрессовых ситуациям, чувствительностью кислород-виделячодей системы хлеропластоь и уязвимостью процесса формирования фотосинтетических структур. Результати исследований неоднократно вклшолись ь чксло важнейших достижении АН страны.
Практическая , значимость работы, Исследуемые параметры, хаг-актериэущие Фотссинтетичеокия аппарат, могут служить основой для разработки чувствительных и информативных методов определения устопчиьоети и реактивности растений при изменении условии окружающей среды, для оце ні м ихадаптационных возможностей, а также для ргарасстки метода отбора культур с устойчивым фотосинтетическнм аппаратом с целью сокращения сроксе селекции П1>и генетических исследованиях и диагностики состояния растений. Последнее наше применение при разработке системы Сиологического мониторинга загрязнения водной среды. Предложи ній способ стабилизации фотосиьтетического аппарата in vitro мол^т оказаться полезным при создании бистехнологических систем преосраэования солнечной энергии.
^Pj^^^j^toJHu. работа апробирована на научных семинарах Института ботаники аН Азербайджана (Еаку. 1988, 19.Ю, 19). Материалы пс теме диссертации были доло-кены и представлены в публикациях ряда специализированных научных конференций, В^есокюных и Международна симпозиумов и конгрессов: II, Ш, IV, V Ееесовеных биохимических с-ьездах (Ташкент, 1969; Fura, 19V4; Москва, 1979; Киев, 1936); I Все сошном биофизическом съезде (Москва. 1932); XIV Интернациональном оио-химическом конгрессе (Прага, Чехословакия, 1988); VI Конгрессе-ФЕМР (Сплит, Ггчэслзвия, 1988); VIH интернациональном конгрессе по іотосіштезу (Стокгольм. Швеция, 1Ї89); XX ЇЕГС (Будапешт, Венгрия, 1990); VI Европейской био^нергетическ:fi конференции (Амстердам, Нидерланды, 1990); Конференции по
Проблеме "Физиология и биохимия растения" (Бжу. 1982J; Все
союзных конференциях - "Проблемы и пути повмленид устойчивос
ти растения it болезаям и экстремальным условиям среды в связи
с задачами селекции" (Ленинград. 1981); "Молекулярные меха
низмы биологического действия оптического излучения" (Ялта,
1S34); "Структурная динамика биологических мембран и ее роль
я регуляции фотобиологических рецепторних процессов" С Шнек,
1969); "Преобразований световой энергии в фотосинтетических
системзх И моделях" (Пущно, 1089); IV Интернационального
симпозиума по минеральному питанию и фотосинтезу, исс'лэдовэ-
нию биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппара
та в связи с преобразованием солнечной энергии (Толбухин,
Вслгария, 19Й8!, -
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 34 печатные роисты.
Структура л обіем роботи Диссертация состоит из 7 глав, в которых рассмотрены основные литературные ванные и результаты собственных исследований к приведено обкее заключение, Еквозоа и списка цитируемых работ. Работа содержит ZZG страниц машинописного текста, 57 рисунков и 15 таблиц. Список литературы включает 404 наименования.
Сокращения. - Да - хлорофилл; Хлл - хлорофиллид, СХя -свободный хлорофилл; FP - свободный пигм-гнт; <Ж- - Фотосистема; РЦ - реакционный центр; ІБК - пигмент-белкивыи комплекс; ХБК - хлорофилл-белковый кошлекс; СХБК - сеетосоОисаюкиЯ ХВК; CFia - олкгомер РЦ ФСІ; СР1 -мономер РЦ OOZ; Cfa - яіро «II; LHCP" - олигемер СХЕК; LHCF - димер СХБ LtfffiP - мономер СХГК; Фл - флуоресценции; да - замедленная (рлуорєоцен-цкя; м. м. - молекулярная масса; кДа - килолальтон; ГОГ - полна? иле кг лико ль; ПААГ - полиакрилакадный гель; ОДС-Na - натрий додепилеульфат; Дерифат 160 - натрий К-лаурил--пминопport ионаг.
Объекты и кетодн, исследования. Объектом исследования служили листья, хлоропласти, ЗБЯ коммерческого шпината CSpinacea оїегасеа),. 'восьмидневных проростков пліениіьі [Triticim aastivura L, Triticim vulgaris) сортов "Kaaraa", "Гиэа" - AFE, "Маке-Бак" - Мексика ('.асукс устойчивы Я к соле-вынооливни), контрастные по переносимости заморозков растения лимона (Citrus ііюмі) - "Грузинский" и "Лиоскурия" ("Грув:ше-
- У -
кий" - слабо эамороэкоустсйчивий сорт, "Диоскуркя^ - замороэ-коустоаадный сорт). Использована молодые листья лимона 1-го года генерации и старые листья 2 и 3 годов генерации без ви* дкмых повреждения. В ряде экспериментов использованы хлорсп-лзсты реликтовых растений: Danae гас*то>а, Ruscus Ъугсапа -яґлиш. Buxus hyrcara - самшита, Platanus ortentslis - восточного чинара. Porrotia persica - я»лезисго дерева.
Дефгаит воды создавали с помощью ГВГ с и. м., равной 1009. Это приводило, к понижению относительного содержания води в проростках до 40-50Z (Махмудов,' 1986), Воздействие пониженных температур создавали путем помещения отторгнутных листьев лимона в термокамеру на определенное ьреыя ери температуре 6 с и 1 Си укорененные горпючные кусты при шС И ЇГО соответственно. Действие сильного освещения на суспензию ХЛО-ропдзетов в изолированные ХЕК растения шпината осуществлялось ь петлевом мкниреаэторе, где с помощью перистальтического насоса производилась непрерывная перекачка образца через реактор при 26 С и постоянном освещении в 1СО0СР лк.^
Шделенме хлороплзстов проводили по стандартной методике в трис-сахарозном буфере. рН 7,3. ХЕК еолюбилизнроЕзнных ти-лаковдов получали с помоиыо электрофореза в ПААГ с СДС-Na (Ttamber, 1975), или с использованием цеиттерионкого детергента дерифзга-160 (Markvell et al.. 1979; Курбанова и др., 1982) или по разработанной нами технике ускоренной солюбили-аашш тилакоидов СДС-Na (1984), а также-методом ионообменной хрочатогрзфпі на ДЭАЭ-исллюаоэе (Путилова и др., 1976. 1979). U. м. ХЕК и поднлептидов определяли с помощь» маркерных белков. Нолипептидный состав комплексов определяли согласно Лем-ли (19-/). Окрашивание белковых зон проводили 0.2Х Кумзсси голубым. Электрофореграммъ деиситометрировали на микрофотометре ИФО-451 со специально сконструированной приставкой для непосред'Л'Егшюя регистрации гелей. Низкотемпературные спектры поглощения и спектры первой производной регистрировали на установке, собранной на базе СФ14 (Гасаноь и др., 1973), вторые гроизводные регистрировали на спектральном вычислительном комплексе КЗБУ-23. Спектры Фя при -19бС и 20С регистрировали на установке, собранной в лаборатории и описанной в работе Абилоза і! др^ (1967). интенсивность ЯФ измеряли с помощью фосфороскопа со временем между.возбуждением и измерением сие-
чэяка 1,25 мс f Моторі»! и др., 19?&). Регистрация фотстока про a? so дя лае ь на, самописне и интеграторе с цифровым устройствам, лгаиоля*йим оценивать шкзеэдь под индукщюнгюй кривой 55. Интенсивность фотосинтеза оценивала по выделению (У, ампе-реметр:иескйм методом на открытом платиновом элестрсде Ж»к-со-Елшкса на установке, описанной 'Гасановкн и Литвиным (1367).