Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Модель иммунной системы растений 10
1.2 Защитные PR-белки в формировании фитоиммунитета
1.2.1 Белки семейства PR-1 – маркерные белки СПУ 15
1.2.2 Белки семейства PR-2 - -1.3-глюканазы 15
1.2.3 Хитиназы важные защитные антипатогенныые белки 16
1.2.4 Про-/антиоксидантная система в фитоиммунитете и белки семейства PR-9 – пероксидазы 17
1.3 Сигнальные молекулы и фитогормоны в регуляции фитоиммунитета 21
1.3.1 Салициловая кислота 21
1.3.2 Жасмоновая кислота 23
1.3.3 Этилен 26
1.3.4 Синергизм и антагонизм сигнальных путей 30
1.3.5 Фитогормоны роста и развития в регуляции фитоиммунитета 33
1.4 Стимулирующие рост растений бактерий в фитоиммунитете 42
Глава 2 Материалы и методы исследования 52
2.1 Объекты исследования 52
2.1.1 Пшеница Triticum aestivum L. 52
2.1.2 Бактерии рода Bacillus 52
2.1.3 Фитопатогенный гриб S. nodorum Berk .
2.2 Условия проведения экспериментов 53
2.3 Определение эндофитности штаммов бактерий рода Bacillus 54
2.4 Методы гистохимических исследований
2.4.1 Локализация Н2О2 с помощью ДАБ 55
2.4.2 Выявление автофлуоресценции лигнина 55
2.5 Биохимические методы исследований 55
2.5.1 Получение белковых экстрактов 55
2.5.2 Определение активности оксидоредуктаз 56
2.5.3 Измерение уровня пероксида водорода 57
2.5.4 Экстракция, очистка и концентрирование гормонов 58
2.5.5 Твердофазный иммуноферментный анализ 58
2.6 Молекулярно-биологические методы 59
2.6.1 Выделение и очистка РНК из растений 59
2.6.2 Реакция от-ПЦР и полуколичественный анализ экспрессии гена 60
2.6.3 Полимеразная цепная реакция ДНК 61
2.6.4 Электрофорез РНК в полиакриламидных гелях 61
2.6.5 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 62
2.7 Статистическая обработка результатов 62
Глава 3 Результаты и их обсуждение 63
3.1 Роль фитогормонов в индукции защитных реакций пшеницы к S.
nodorum 63
3.1.1 Влияние СК и ЖК на физиолого-биохимические показатели пшеницы в условиях инфицирования S. nodorum 63
3.1.2 Влияние этилена и ингибитора его рецепции 1-МЦП на физиолого-биохимические показатели пшеницы, инфицированной S. nodorum 81
3.1.3 Взаимодействие этилена с СК и ЖК в растениях пшеницы, инфицированных S. nodorum 98
3.2 Штаммы Bacillus ssp. в индукции защитных реакций растений пшеницы к грибу S. nodorum Berk. 103
3.2.1. Эндофитность экспериментальных штаммов Bacillus ssp. 105
3.2.2 Влияние штаммов Bacillus ssp. на защитную систему пшеницы 107
3.3 Роль взаимодействия штамма B. subtilis 26Д и сигнальных молекул в индукции защитных реакций пшеницы к грибу S. nodorum Berk. 114
Заключение 125
Выводы 129
Список использованной литературы
- Белки семейства PR-2 - -1.3-глюканазы
- Фитопатогенный гриб S. nodorum Berk
- Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
- Взаимодействие этилена с СК и ЖК в растениях пшеницы, инфицированных S. nodorum
Введение к работе
сигнальные пути растений, регулирующие развитие защитного ответа на воздействие патогена (Robert-Seilaniantz et al., 2011; Kazan, Lyons, 2014), изучение которых - одно из наиболее актуальных направлений современной физиологии и биохимии растений и фитоиммунологии, в частности (Ban, Jones, 2009). Важно и то, что наиболее эффективные штаммы СРРБ, могут быть в последующем предложены в качестве основы для проектирования экологически безопасных средств защиты растений. Комплексный анализ механизмов действия природных индукторов устойчивости на защитные системы растений поможет в создании новых не токсичных для окружающей среды биопрепаратов. Поэтому характеристика таких систем как растение - бактерия - фитопатоген с целью эффективного управления взаимодействием их участников актуальная проблема фитоиммунологии и защиты растений от вредных организмов в целом.
Цель исследования: определить роль салициловой и жасмоновой кислот, этилена и штаммов Bacillus ssp. в регуляции механизмов, формирующих устойчивость растений пшеницы к возбудителю септориоза Septoria nodorum Berk.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Оценить влияние СК, ЖК, этилена и бактерий Bacillus ssp. и их композиций на формирование неспецифических защитных реакций (генерация Н2О2, активация компонентов про-/антиоксидантной системы, лигнификация клеточных стенок) в растениях пшеницы при инфицировании патогенным грибом S. nodorum;
-
Оценить влияние СК, ЖК, этилена и бактерий Bacillus ssp. и их композиций на уровень фитогормонов (цитокининов, АБК и ИУК) в растениях пшеницы при инфицировании патогенным грибом S. nodorum;
-
Изучить характер изменения транскрипционной активности маркерных генов, кодирующих PR-белки, в растениях пшеницы под влиянием СК, ЖК, этилена, бактерий Bacillus ssp. и их композиций при инфицировании грибом S. nodorum и оценить вклад сигнальных путей в развитие устойчивости к этому патогену;
-
Определить степень участия эндогенной Н202 в регуляции и транскрипционной активности генов, кодирующих защитные белки в растениях пшеницы при инфицировании S. nodorum.
-
Оценить степень участия эндогенных фитогормонов (ЦК, АБК, ИУК) в регуляции транскрипционной активностью генов, кодирующих защитные белки в реализации механизмов, ответственных за индукцию защитных реакций при инфицировании.
Научная новизна. Впервые показано влияние бактериального штамма В. subtilis 26Д транскрипционную активность генов, кодирующих маркерные защитные белки, и гормональный баланс растений пшеницы при гемибиотрофной инфекции. Новыми являются данные о важности концентрационной составляющей СК и ЖК в композиции с клетками эндофитного бактериального штамма В. subtilis 26Д на защитные реакции растений пшеницы к патогенному грибу S. nodorum. Впервые показано, что одним из механизмов снижения защитного ответа к возбудителю септориоза под влиянием совместной обработки растений пшеницы эндофитным штаммом В. subtilis 26Д и 10"7 М ЖК является эффект подавления функции генов PR-белков пероксидазы (ПО), хитиназы и Р-1.3-глюканазы. Впервые показано, что активное развитие септориоза под влиянием этилена в растениях пшеницы, инфицированных грибом S. nodorum, связано с нарушением функционирования компонентов индуцируемой СК защитной системы, таких как генерация Н202, накопление лигнина и подавление экспрессии генов PR-белков,
транскрипционная активность которых регулируется СК. Обнаружена схожесть в сигнальной регуляции активности компонентов про-/антиоксидантной системы растений пшеницы при гемибиотрофной инфекции под воздействием СК и ингибированием рецепции этилена.
Практическая значимость работы. Полученные данные расширяют современные представления о физиологических и биохимических механизмах устойчивости растений. Индуцирование/супрессия защитной системы растений пшеницы под влиянием композиции эндофитного штамма В. subtilis 26Д с сигнальными молекулами (СК, ЖК) различной концентрации требует внимательного подхода к компонентам в биопрепаратах. Основные результаты работы могут быть использованы в учебно-исследовательской работе по изучению физиологических механизмов регуляции защитных систем при чтении курсов по физиологии растений и фитоиммунологии.
Апробация работы. Результаты работы доложены на межд. конф. «Биология наука XXI века» (Пушино 2010), «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011), «Физиология растений - теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехнологий» (Калининград, 2014), «Генетическая интеграция про-и эукариот: фундаментальные исследования и современные агротехнологии» (Санкт-Петербург, 2015), «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (Санкт-Петербург, 2016), межд. симп. «Молекулярные механизмы редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013), «Перспективы развития химических и биологических технологий в 21-м веке» (Саранск, 2015), «Сигнальные системы и поведение растений» (С.-Петербург, 2016), «Фитоиммунитет и клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2016), Всерос. конф. «Растения в условиях глобальных и локальных природно-климатических и антропогенных воздействий», VIII Съезде Общества физиологов растений России (Петрозаводск, 2015), VII Межд. научно-практической конф. «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира (Ялта, 2016).
Конкурсная поддержка. Исследования были поддержаны государственным контрактами Министерства образования и науки Российской Федерации № П339 по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 г.г. и № 14.604.21.0016 по ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», а также грантом РФФИ-Поволжье № 14-04-970079.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 15 работ, в том числе 6 статей в журналах из «Перечня ВАК» и глава в иностранном издании.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 308 источников. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32-мя рисунками и 9-ю таблицами.
Благодарности. Автор благодарит научного руководителя И.В. Максимова и сотрудников лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН к.б.н. СВ. Веселову, к.б.н. А.В. Сорокань, к.б.н. Г.Ф. Бурханову, к.б.н. О.Б.Сурину, к.б.н. Е.А. Черепанову за помощь при выполнении и обсуждении работы.
Белки семейства PR-2 - -1.3-глюканазы
-1.3-глюканазы (PR-2), вовлечены во многие физиологические процессы растений. Так, при патогенезе экспрессирующиеся белки семейства PR-2 деградируют клеточную стенку патогена путем ее гидролиза, чаще всего совместно с хитиназой или другими PR-белками, что делает стенки гиф патогенов восприимчивыми к лизису, а высвобождение -1.3-глюкана, запускает другие компоненты фитозащитных систем (Balasubramanian et al., 2012). По изоэлектрической точке -1.3-глюканазы делят на кислые и основные. Кислые изоформы присутствуют в небольшом количестве в норме и индуцируются при атаке патогенами, СК и ЦК, локализуются в апопласте (Van Loon, 2007). Основные -1.3-глюканазы также обнаруживаются в здоровых растениях в корнях и цветах, в основном в вакуолях и их экспрессия индуцируется под влиянием инфицирования, обработки растений СК или этиленом (Van Loon, 2007). Не вызывает сомнений антифунгальная активность белков PR-2 против широкого спектра патогенов, таких как Fusarium oxysporum, Puccinia graminis, Phytophthora ssp., Alternaria solani, Bipolaris sorokiniana (Balasubramanian et al., 2012). Устойчивые генотипы растений показывают более раннюю экспрессию генов PR-2, по сравнению с восприимчивыми генотипами (Agrawal et al., 2002; Van Loon, 2007).
Хитиназы широко распространены в природе, их выделяют из грибов, растений, животных, бактерий и вирусов (Melchers et al., 1994). Их индукция осуществляется в растениях под воздействием инфицирования, сигнальных молекул, фитогормонов, тяжелых металлов, поранения и др. Регуляция экспрессии генов хитиназ осуществляется СК, ЖК, этиленом, Н2О2, АБК и другими факторами, в том числе РАМР патогенов (Kim et al., 1998) и зависит от вида стресса, патогена, дозы гормона и времени действия определенного фактора (Zhang, Zhou, 2010).
Классификация хитиназ. Хитиназы относят к большой группе ферментов гликозил-гидролаз, насчитывающих более 45 семейств (Журавлева, Лукьянов, 2004). Все эти ферменты гидролизуют –1.4–гликозидную связь хитина, но по специфичности отличаются друг от друга. Хитиназы I класса встречаются только в растениях, локализованы вакуолярно и подразделяются на кислые (Ia) и щелочные (Ib). Хитиназы II класса встречаются как в растениях, так в грибах и бактериях, не связываются с хитином и локализуются в апопласте. Внеклеточные хитиназы IV класса обнаружены в двудольных растениях. В литературе много сведений о непосредственной фунгицидности хитиназ (Herrera-Estrella, Chet, 1999). Они ингибируют рост широкого спектра патогенов, например Trichoderma, Alternaria, Fusarium, Rhizoctonia, Botritis и др. (Selitrennikoff, 2001). Например, хитиназа PR-3 (I) из риса вызывала повышение устойчивости к возбудителям Rhizoctonia solani и Botritis cinerea растений риса и огурца (Tabei et al., 1998). Гиперэкспрессия собственной хитиназы в растениях Brassica juncea снижала рост патогена Alternaria brassicae на 12-56% по сравнению с контролем (Mondal et al., 2003). Понятно, что хитиназы особенно эффективны при синергичном действии с глюканазами (PR-2) (Moravcikova et al., 2003). Экспрессия PR-3(II) и PR-2 (II) показала повышение устойчивости ячменя к R. solani (Jach et al., 1995), томата к F. oxysporum (Jongedijk et al., 1995), табака к C. nicotianae, R. solani, B. cinerea и Alternaria alternata (Jach et al., 1995).
Про-/антиоксидантная система в фитоиммунитете и белки семейства PR-9 - пероксидазы Показано, что одной из наиболее ранних ответных реакций растений на внедрение патогена является локальная генерация АФК – окислительный «взрыв», запускающий каскад последующих защитных реакций. Известно, что АФК, в основном Н2О2, участвует в запуске СВЧ-реакции, процессах лигнификации в инфицированных клетках, что приводит к образованию барьера для дальнейшего распространения патогена, а в высоких концентрациях оказывает на него токсическое действие. Кроме того, Н2О2 считается мессенджером в сигнальных системах и активирует факторы регуляции транскрипции, приводящие к экспрессии защитных генов и последующему синтезу PR-белков (Тарчевский, 2002; Neill et al., 2002; Sewelam et al., 2013). Передачу окиcлительного сигнала в клетках многих эукариот осуществляют также митоген–активирующие протеинкиназы (MAPK), в индукции которых важная роль отводится Н2О2 (Pitzschke, Hirt, 2006; Sewelam et al., 2016).
Источники АФК (супероксидный (О2-), гидроксил (OH-) радикалы, Н2О2), а также оксид азота (NO), и пути их генерации при патогенезе остаются малоизученными. Однако имеются данные о катализе этого процесса ферментами НАДФН-оксидазой, оксалатоксидазой, супесоксиддисмутазой (СОД) и ПО (Тарчевский, 2002). Так, инфицирование вызывает в растениях активацию мебрано-связанной НАДФН-оксидазы, которая, как полагают, является одним из важных генераторов АФК в виде О2-, играющего роль пускового звена в каскаде реакций образования других АФК (Kawano, 2003).
Вместе с тем, в растениях существует эффективная система защиты от избытка АФК - антиоксидантная система. Основную роль в нейтрализации АФК играют антиоксидантные ферменты СОД, снижающая концентрацию О2- в четыре порядка, ПО и каталаза, устраняющие избыток перекисей, образованных из О2- с участием СОД (Чиркова, 2002). СОД приписывают ключевую роль в антиоксидантной защите при действии различных стрессоров. На контрастных по устойчивости к засолению сортах томата получены данные, указывающие на то, что активность СОД и ПО в опыте возрастала лишь у устойчивого сорта, тогда как у неустойчивого – этого не происходило.
В утилизации Н2О2, нарояду с каталазой, участвует пероксидаза (Минибаева, Гордон, 2003), формирующая в растениях обширное мультигенное семейство ферментов класса III, относящихся к белкам семейства PR-9 и играющих важную роль в защитных реакциях растений против фитопатогенных организмов (Almagro et al., 2009). Пероксидазы в раcтениях присутствуют в двух формах – цитоплазматической и апопластной. Последние в свою очередь дифференцируются на ионно- и ковалентно- связанные c клеточной cтенкой формы. Пероксидазы полифункциональны, и это выражается в неодинаковой способности изоПО окислять разнообразные доноры водорода, обладая оксигеназной, оксидазной, полифенолоксидазной, ИУК-оксидазной активностью и в то же время они участвуют в таких важнейших процессах метаболизма как образование и укрепление клеточных стенок, гидроксилирование флавоноидов, биосинтез этилена, регуляция ростовых процессов (Чиркова, 2002; Минибаева, Гордон, 2003; Passardi et al., 2007; Almagro et al., 2009).
Фитопатогенный гриб S. nodorum Berk
Для получения белковых экстрактов и измерения уровня активности ПО и каталазы листья пшеницы перед фиксацией предварительно промывали и подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и растирали в фарфоровой ступке с добавлением 0,05 М Na-фосфатного буфера (ФБ) рН 6.2 в соотношении 1:5 (1 часть растительного материала и 5 объемов ФБ). Для выделения цитоплазматической белковой фракции образцы экстрагировали в течении 30 мин при 4С и центрифугировали при 15 тыс. оборотах на центрифуге 5415К (Eppendorf, Германия) и отбирали супернатант.
Содержание белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Для этого в лунки планшета раскапывали по 0.1 мл образца, разбавленного в ФБ (образец: ФБ – 1:10) добавляли 0.150 мл реактива Бредфорд. Реактив готовили следующим образом: 100 мг кумасси G-250 растворяли в 50 мл 95% этанола, добавляли 100 мл Н3РО4 и доводили водой до одного литра. Образец должен содержать от 0,1 до 1 мг/мл белков. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре для планшет EnSpire Multimode Plate Readers (Perkin Elmer, США) при 595 нм через 5 мин, но не позднее 1 часа. Концентрацию белка определяли по графику, для построения которой использовали растворы бычьего сывороточного альбумина, раститрованных от 1 до 0,1 мг/мл.
Активность ПО определяли модифицированным методом Бояркина (Ермаков и др., 1987) с использованием плоскодонных планшет для иммунологического анализа (Nunc, США) (Хайруллин и др., 2000). В лунки добавляли по 0.075 мл образца, разбавленного в ФБ (образец: ФБ – 1:30), 0.025 мл раствора о-фенилендиамина в концентрации 0.5 мг/мл и 0.025 мл 0.016% Н2О2. Развитие окраски останавливали, добавляя по 0.05 мл 4Н H2SO4. Оптическую плотность измеряли на приборе Benchmark Microplate Reader (BioRad, США) для иммуноферментного анализа при 490 нм. Активность фермента вычисляли по стандартной формуле (Ермаков и др., 1987), выражали в единицах оптической плотности на 1мг белка.
Активность каталазы измеряли по снижению концентрации перекиси водорода, которую определяли с использованием молибдата аммония, образующего с Н2О2 окрашенное соединение (Королюк и др., 1988). Реакция инициировалась добавлением 0.1 мл супернатанта к 2 мл 0.03% раствора Н2О2. Контролем служила холостая проба, в которую вместо супернатанта добавляли 0,1 мл дистиллированной воды. Останавливалась реакция добавлением 1 мл 4% молибдата аммония через 10 минут после инициации. Интенсивность окраски измеряли на приборе Benchmark Microplate Reader (BioRad, США) при длине волны 410 нм. В качестве контроля использовали пробу, в которую вместо перекиси водорода вносили 2 мл воды. Активность каталазы рассчитывали с использованием калибровочной кривой и выражали в мкМ Н2О2/мг сырой массы мин.
Активность оксалатоксидазы. Цитоплазматическую (свободно растворимую) фракцию фермента выделяли с использованием 0,05 М сукцинатного буфера, pH 3,8 (СБ) (Vuletic, Sukalovich, 2000). Для этого отрезки листьев гомогенизировали в СБ, при соотношении массы навески листьев к объему СБ (1:3). Экстракт центрифугировали 20 мин при 1200 g ("Eppendorf", Германия). Реакционная смесь для определения активности оксалатоксидазы содержала 100мкл СБ, 0,0025 М щавелевую кислоту ("Реахим", Россия), 50 мкл ферментной вытяжки и коммерческой пероксидазы хрена фирмы ("ДиаэМ", Россия) в концентрации 15 ед./мл и 0,08%-ный хромогенный субстрат o-фенилендиамин (ОФД, "Реахим", Россия). Оптическую плотность измеряли при 490 нм на спектрофотометре Benchmark Microplate Reader (BioRad, США). Активность фермента выражали в оптических ед./мг белка.
Отрезки листьев растений гомогенизировали в 0.05 М фосфатном буфере, pH 6.2 (ФБ), в соотношении 1:5, центрифугировали 20 мин при 10000 оборотов на центрифуге 5415К (Eppendorf, Германия). Супернатант использовали для определения содержания Н2О2 (Яруллина и др., 2011). Концентрацию Н2О2 измеряли с использованием красителя ксиленоловый оранжевый (Bindschedler et al, 2001). Реагент содержал 0.074% соль Мора в 5.81% растворе серной кислоты и 0.009% раствор ксиленолового оранжевого в 1.82 % растворе сорбита (в соотношении 1:100). Для определения к 500 мкл реагента добавляли 50 мкл супернатанта образца, инкубировали при комнатной температуре 45 мин. Образцы центрифугировали при 16 тыс. об. /мин в течение 5 мин, перед измерением, затем измеряли оптическую плотность продуктов реакции измеряли на спектрофотометре EnSpire Multimode Plate Readers (Perkin Elmer, США) при длине световой волны 560 нм. Концентрацию Н2О2 определяли по предварительно построенной калибровочной кривой.
Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
В литературе много противоречивых данных о механизмах регуляции зависимых от этилена защитных ответов растений при патогенезе. Практически все они включают использование в качестве модельных растений арабидопсиса или табака. Вместе с тем следует заметить, что на примере риса показано, что этиленовый сигнальный путь у однодольных растений заметно отличается (Day, Vlot, 2015) и у пшеницы изучен недостаточно. В связи с этим особый интерес представляет понимание роли этиленовой сигнальной системы в регуляции про/антиоксидантного статуса однодольных растений при патогенезе. Известно, что необратимое связывание этилена с рецепторами и подавление дальнейшей передачи сигнала ингибируется 1-метилциклопропеном (1-МЦП), который нашел широкое применение при хранении фруктов для задержки их созревания (Sisler et al., 1996). Однако его роль в защите растения от патогенов крайне противоречива, поскольку 1-МЦП может индуцировать в них как устойчивость, так и восприимчивость к патогенам (Hoffman et al., 1999; Marcos et al., 2005).
Развитие симптомов заболевания. Различия в развитии мицелия на поверхности листьев пшеницы разных сортов обнаруживались через 24 ч после инокуляции (рис. 12). У сорта Каз10 зона нанесения суспензии спор была густо покрыта мицелием, тогда как на поверхности листа сорта Ом35 мицелий развивался гораздо медленнее. Обработка 1-МЦП листьев способствовало снижению густоты покрытия поверхности листа в сравнении с контролем в обоих сортах пшеницы, что предполагает на выработку растениями под влиянием этого препарата веществ уже изначально подавляющих рост мицелия. Следовательно, ожидаемо, что уже на начальных этапах инфицирования будут наблюдаться различия в развитии патогена на листьях растений пшеницы. Так, через 4 сут отмечалась зависимость проявления признаков заболевания от сорта пшеницы и условий эксперимента (рис. 12). Через 9 сут после заражения на листьях сорта Каз10 наблюдали крупные зоны поражения с пикнидами, а на листьях устойчивого сорта Ом35 эти зоны были небольшие и без пикнид (рис. 12, таб. 5). Обработанные ЭТ растения, как восприимчивого, так и устойчивого сортов, становились чувствительны к грибу S. nodorum, так как на листьях развивались пикниды гриба, окруженные большими зонами хлорозов, занимающих до 50 и 40% площади листа, соответственно у восприимчивого и устойчивого сорта (4 балла) (рис. 13). Под влиянием 1-МЦП, напротив, у обоих сортов задерживался рост мицелия на поверхности листа (рис. 13), что в последующем приводило к заметному замедлению проявления симптомов заболевания и формирования в листьях пикнид патогена (рис. 13, табл. 5).
Влияние 1-МЦП на рост вегетативного мицелия гриба S. nodorum на поверхности листьев контрастных по устойчивости сортов растений пшеницы (24 ч после инфицирования) Гистохимический анализ накопления Н2О2 в листьях пшеницы показал, что значительная его генерация наблюдалась в зоне проникновения мицелия патогена у устойчивого, но не восприимчивого сорта (рис. 13). Обработка 1-МЦП усиливала локальное накопление Н2О2 в зонах проникновения мицелия в ткани листьев обоих сортов, а обработка ЭТ подавляла генерацию Н2О2 в этих зонах (рис. 13).
В контрольных и обработанных 1-МЦП и ЭТ листьях пшеницы, не инфицированных грибом, обнаруживалось незначительное количество Н2О2 только в зоне проводящих пучков. Вместе с тем, на 24 час после инфицирования в зоне развития патогена в листьях устойчивых растений пшеницы происходит активное накопление перекиси водорода (рис. 13).
Наиболее четко различия в накоплении Н2О2 наблюдалось в устицах инфицированных растений (рис. 13). Кроме того из рис. 9 видно, что под влиянием инфицирования грибом S. nodorum и воздействия 1-МЦП происходит существенное изменение в содержании лигнина в листьях. Так, через 2 сут после заражения в клеточных стенках тканей листа устойчивого сорта Ом35 наблюдалась интенсивная автофлуоресценция лигниноподобных полимеров фенольных соединений (рис. 14 в), а в тканях восприимчивого сорта Каз10 она была выражена значительно слабее (рис. 14а). Обработка инфицированных листьев пшеницы 1 МЦП индуцировала усиленное отложение лигнина и его автофлуоресценции в клеточных стенках зоны соприкосновения со структурами патогена обоих сортов, при этом интенсивно лигнин накапливался в листьях устойчивого сорта (рис. 14 б, г). Важно заметить, что подобное не наблюдалась в неинфицированных листьях всех вариантов, что говорит активации накопления лигнина в растениях именно в случае воздействия на них инфекционного агента в лице гриба S. nodorum. Подобный эффект предполагает, что ингибитор рецепции этилена 1-МЦП обладает свойством праймирования растений, что способствует последующему формированию устойчивости растений к патогену у растений исключительно при их инфицировании. Контроль ЭТ 1-МЦП Симптомы болезни на восприимчивом сорте Казахстанская Локализация Н2О2 Локализация Н2О2
Симптомы болезни на устойчивом сорте Омская Рис. 13 Влияние ЭТ и 1-МЦП на развитие симптомов септориоза (через 9 сут после инфицировании) и на локальную генерацию Н2О2 в зоне инфицирования (через 24 ч) на листьях контрастных по устойчивости сортов растений пшеницы Рис. 14 Влияние 1-МЦП на отложение лигниноподобных фенольных соединений в клеточных стенках (48 ч. опыта) и накопление Н2О2 в устьицах (24 ч. опыта) листьев двух контрастных по устойчивости сортов пшеницы Казахстанская 10 (а, б) и Омская 35 (в, г) после инфицирования грибом S. nodorum: а, в – инфицированные листья; б, г – инфицированные листья после обработки 1-МЦП
Содержание Н2О2 через 24 ч в листьях инфицированных растений пшеницы восприимчивого сорта Каз10 возрастало в меньшей степени, чем в листьях устойчивого сорта Ом35 (таб. 6). Следует отметить, что в инфицированных листьях устойчивого сорта Ом35 высокая концентрация Н2О2 поддерживалась на протяжении всего эксперимента, а у восприимчивого сорта Каз10 она после кратковременного повышения снижалась и к 72 ч после заражения не превышала контроль (таб. 6). Обработка листьев ЭТ подавляла генерацию Н2О2 у обоих сортов, но с большей степени у восприимчивого сорта Каз10 (таб. 6) 1-МЦП приводила к интенсивному накоплению Н2О2 через 24 ч после инфицирования, что соответствовало времени активного проникновения патогена в ткани листа хозяина (таб. 6). В инфицированных листьях устойчивого сорта, обработанных 1-МЦП, наблюдался повышенный уровень АФК в течение всего периода эксперимента. Обнаруженное в данной работе быстрое транзитное накопление Н2О2 у обработанных 1-МЦП инфицированных растений подтверждает данные, полученные на растениях с нарушенным синтезом и рецепцией этилена (Wi et al., 2012; Sewelam et al., 2013).
Изменение активности ПО и каталазы в растениях пшеницы при инфицировании S. nodorum под влиянием этилена. Образование и утилизация АФК находится в растениях под контролем ферментов про-/антиоксидантной системы, куда входят ПО и каталаза. Кроме того, особый интерес вызывает фермент ОО, катализирующий окисление солей щавелевой кислоты (ЩК), характеризующихся свойствами эффектора (Guo, Stotz, 2010), с выработкой Н2О2.
Влияние этилена на активность ПО, вовлекаемых в систему генерации и утилизации АФК, в процессе инфицирования растений не изучалось. При этом формирование лигнина, катализируемое растительными ПО, с одной стороны -наиболее надежный способ утилизации фитотоксичных концентраций АФК и фенольных соединений, а с другой - способствует образованию механического барьера для патогена, не разрушаемого его гидролазами патогена.
Инфицирование листьев пшеницы обоих сортов спорами гриба S. nodorum приводило к повышению в них активности ПО (по сравнению с контролем), которая достигала максимального значения к 72 ч эксперимента (рис. 15 а, б). При этом в листьях восприимчивого сорта Каз10 активация ПО шла медленнее (рис. 13 а, б) по сравнению с устойчивым сортом (рис. 15 в, г). Ранее подобные изменения в активности этого фермента показаны на растениях картофеля (Chet, Inbar, 1994) и гороха (Chitarra et al., 2003). Обработка 1-МЦП стимулировала, а ЭТ ингибировал ПО активность в инфицированных листьях, как у восприимчивого, так и у устойчивого сортов.
Взаимодействие этилена с СК и ЖК в растениях пшеницы, инфицированных S. nodorum
Как отмечалось выше, применение СРРМ представляется привлекательным, так как в дополнение к их рост стимулирующей активности, бактерии способны, активизируя различные стороны метаболизма, обеспечивать высокий иммунный статус растений и повышать неспецифическую устойчивость к широкому спектру патогенов, т.е. запускать системную индуцированную устойчивость (СИУ). Однако не ясно, каким образом регулируется взаимодействие растений и эндофитов, как запускается защитная система растений-хозяев. Индукция защитных реакций в растениях направлена на предотвращение развития и распространения патогена. Первой реакцией растений на проникновение патогена считается локальный окислительный взрыв, запускающий каскад последующего защитного ответа. Образование и утилизация АФК катализируется различными оксидазами – ферментами про-/антиоксидантной системы, активность которых находится под контролем фитогормонов.
В таблице 8 представлены данные оп анализу влияния штамма B. subtilis 26Д, сигнальных молекул СК, ЖК и их композиций с бактерией на генерацию Н2О2, а также активность ферментов про-/антиоксидантной системы в растениях пшеницы, инфицированных грибом S. nodorum. Как видно, обработка растений пшеницы СК, ЖК и B. subtilis 26Д в отдельности усиливали их устойчивость к септориозу, за счет генерации Н2О2, повышения активности ПО и ингибирования активности КАТ. Эти процессы приводили к более интенсивной лигнификации клеточных стенок в зоне инфицирования (рис. 26), в результате чего мы наблюдали значительное уменьшение зон поражения и остановку роста патогена на листьях растений (табл. 8).
При совместной обработке растений пшеницы бактериальным штаммом B. subtilis 26Д и СК наблюдался аддитивный эффект, при котором была обнаружена более интенсивная генерация Н2О2, ингибирование активности КАТ и синтез лигнина, что приводило к значительному уменьшению зон поражения. Интересно, что в композиции ЖК+ B. subtilis 26Д при инфицировании грибом S. nodorum проявился ингибирующий эффект и устойчивость растений снижалась, как предполагается за счет снижения генерации Н2О2, увеличения активности КАТ, ингибирования активности ПО и замедления процессов лигнификации. Таким образом, СРРМ индуцируют в растениях СИУ, регулируя уровень АФК, за счет влияния на ферменты про-/антиоксидантной системы. Раннее накопление АФК, индуцированное СРР бактериями в инфицированных растениях, может играть критическую роль в механизмах СИУ.
Обработка растений пшеницы СК также вызывала сдвиг гормонального баланса в сторону ЦК – повышение содержания зеатина и снижение АБК и ИУК (рис. 27 б, д, з), что повышало устойчивость этих растений к септориозу (табл. 8). При совместной обработке растений пшеницы СК и штаммом B. subtilis 26Д наблюдался аддитивный эффект, симптомы болезни в данном варианте обработки проявлялись в меньшей степени, чем у растений обработанных только B. subtilis 26Д или только СК (табл. 8), а увеличение содержания зеатина на начальных этапах инфицирования было выше, чем в растениях обработанных только B. subtilis 26Д или только СК. Содержание АБК в таких растениях уменьшалось, а ИУК изменялось незначительно (рис. 27 б, д, з).
Влияние предпосевной совместной обработки суспензией клеток B.subtilis 26Д (1-3Б), растворами салициловой (2) и жасмоновой кислот (3) на отложение лигниноподобных фенольных соединений в клеточных стенках листьев пшеницы восприимчивого сорта Жница через 72 часа после инфицирования грибом S. nodorum. А – без B. subtilis 26Д, Б – обработка B. subtilis 26Д. 1A – микроизображение с листьев контрольных растений пшеницы, не подвергнутых обработке сигнальными молекулами и суспензией бактерии.
Обработка растений пшеницы ЖК также уменьшала симптомы развития болезни, как обработка СК или бактериальным штаммом (табл. 8). Тем не менее, мы не наблюдали большого повышения уровня ЦК в этом варианте обработки, однако и не наблюдали увеличения содержания АБК и ИУК, как у необработанных инфицированных растений, которое приводило к развитию симптомов болезни (рис. 27 в, е, и). При совместной обработке растений пшеницы ЖК и бактериальным штаммом B. subtilis 26Д наблюдался ингибирующий эффект, проявлявшийся в большем развитии симптомов болезни, чем у необработанных инфицированных растений (табл. 8), снижении содержания зеатина через 24 ч и отсутствии его высокого уровня через 72ч после инфицирования, а также повышении содержания АБК и критическом уменьшении уровня ИУК при инфицировании в таких растениях (рис. 27 в, е, и).
Обработка СК, ЖК и B. subtilis 26Д в отдельности увеличивали устойчивость растений пшеницы к септориозу, за счет интенсивной лигнификации клеточных стенок листа в зоне поражения по сравнению с контролем. Это коррелировало со сдвигом гормонального баланса в сторону ЦК и накоплением транскриптов изучаемых генов защитных белков. Вероятно, отмеченные показатели сыграли определенную роль в уменьшении степени поражения растений септориозом. При совместной обработке растений пшеницы штаммом B. subtilis 26Д и СК наблюдался аддитивный эффект, при котором обнаружено высокое содержание зеатина (активной формы ЦК) на начальных этапах инфицирования, чем в растениях обработанных только B. subtilis 26Д или только СК. Содержание АБК в таких растениях снижалось.
Иммунизация сигнальными молекулами и клетками эндофитной бактерии приводили к интенсивному накоплению транскриптов PR-белков (рис. 28) и синтезу лигнина (рис. 26), что проявлялось в значительном уменьшении зон поражения. Интересно, что в композиции 10-7 М ЖК + бактерия при инфицировании, вместо ожидаемого синергизма наблюдался ингибирующий эффект и устойчивость растений снижалась (табл. 8), как видно из рис. 28, в том числе и за счет снижения уровня транскриптов PR-белков. Стоит отметить, что содержание ЦК в таких растениях после инфицирования не поднималось, а уровень
АБК значительно повышался, и критически уменьшался уровень ИУК (рис. 27). Таким образом, под влиянием СРР бактерий может происходить сдвиг гормонального баланса растений, который может влиять на реализацию механизмов, защищающих их от инфекции. Как ранее было показано в растениях, обработанных 10-7 М ЖК (рис. 3) или B. subtilis 26Д (табл. 8) в отдельности наблюдалось торможение развития болезни, по сравнению с не иммунизированными растениями. Совместное применение штамма B. subtilis 26Д и 10-7 М ЖК снижало защитный эффект и способствовало сильному развитию болезни, что предполагает интерференцию индивидуально запускаемых ими сигнальных путей при совместном использовании, подобно тому, как это показано при совместном использовании СК и ЖК на растениях пшеницы (табл. 2), а также совместном использовании ЖК со штаммом B. subtilis 26Д на растениях картофеля (Sorokan et al., 2014).
Возникает логический вопрос. Сохраняется ли такой ингибирующий эффекта в комбинации ЖК+B. subtilis 26Д и при изменении концентрации сигнальной молекулы? Для ответа на это, мы использовали две концентрации ЖК различающихся на несколько порядков друг от друга (10-12 М и 10-7 М), проявивших на модельных опытах к торможению симптомов развития болезни у инфицированных S. nodorum растений по сравнению с контролем (табл. 2, 9), подтверждая положительное влияние этих двух концентраций ЖК на метаболизм растений пшеницы. Интересно, что при совместной обработке растений B. subtilis 26Д + ЖК 10-12 М симптомы болезни проявлялись в меньшей степени, чем у растений обработанных только B. subtilis 26Д или только ЖК. Эти данные говорят о том, что 10-12 М ЖК в комбинации с B. subtilis 26Д не давала эффекта интерференции на защитную реакцию растений, которая происходила при использовании смеси клеток B. subtilis 26Д с 10-7 М ЖК.