Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1.1. Стевиозид и его свойства 8
1.2. Общие сведения о лектинах
1.2.1. Структура и физико-химические свойства АЗП 15
1.2.2. Роль АЗП в регуляции ростовых процессов и в ответе растения на стресс 15
1.3. Тяжелые металлы 17
1.3.1 Общие представления о тяжелых металлах 17
1.3.2 Механизмы токсичности тяжелых металлов
1.3.3. Поступление и влияние ТМ на физиолого-биохимические процессы в растениях 20
1.3.4. Механизмы устойчивости растений к действию тяжелых металлов 24
1.3.5. Трансдукция сигнала в ответ на действие тяжелых металлов 26
1.4. Активные формы кислорода и антиоксидантная система защиты 29
1.4.1. Механизмы образования активных форм кислорода в клетке 29
1.4.2. Биологическое значение активных форм кислорода 32
1.4.3. Повреждающее действие и генерация активных форм кислорода при
стрессах различного происхождения 33
1.4.4. Антиоксидантная система защиты растений 34
Экспериментальная часть 36
2. Материалы и методы 36
2.1. Объекты исследований 36
2.2. Схема опытов 36
2.3. Определение морозоустойчивости растений 37
2.4. Морфометрия 38
2.5. Определение митотического индекса 38
2.6. Определение содержания ТМ и микроэлементов в проростках 40
2.7. Определение содержания суммарных белков 41
2.8. Определение активности амилаз 41
2.9. Определение содержания свободного пролина 42
2.10. Определение уровня перекисного окисления липидов (содержания малонового диальдегида) 43
2.11. Определение содержания перекиси водорода 44
2.12. Определение активности каталазы 45
2.13. Определение активности аскорбатпероксидазы 46
2.14. Определение активности глутатионредуктазы 47
2.15. Выделение фракции растворимых и связанных с клеточной стенкой лектинов 48
2.16. Очистка, фракционирование лектинов, 49
2.17. Определение агглютинирующей активности лектинов
2.17.1. Приготовление эритроцитов 50
2.17.2. Определение агглютинирующей активности лектинов 51
2.18. Методика проведения полевых опытов и определение величины и
структуры урожая 52
2.19. Статистическая обработка результатов 52
3. Результаты исследования и их обсуждение 54
3.1. Влияние разных концентраций стевиозида на рост и накопление биомассы растений озимой пшеницы 54
3.2. Влияние стевиозида на физиолого-биохимические показатели озимой пшеницы 56
3.2.1. Митотический индекс и длительность фаз митоза 56
3.2.2. Содержание суммарных белков 58
3.2.3. Активность амилаз 58
3.2.4. Морозоустойчивость 59
3.2.5. Активность и молекулярная гетерогенность лектинов 60
3.3. Влияние стевиозида на морфометрические показатели проростков озимой пшеницы при действии тяжелых металлов 64
3.4. Содержание макро-, микроэлементов и тяжелых металлов и в корнях и листьях растений озимой пшеницы 68
3.5. Активность растворимых и связанных с клеточной стенкой лектинов при действии тяжелых металлов и стевиозида 72
3.6. Влияние тяжелых металлов и стевиозида на содержание пролина и каротиноидов в проростках озимой пшеницы 82
3.7. Степень ПОЛ в корнях проростков озимой пшеницы, выращенных на среде с ТМ и стевиозидом 86
3.8. Влияние тяжелых металлов и стевиозида на содержание пероксида водорода в корнях проростков озимой пшеницы 90
3.9. Активность антиоксидантных ферментов в корнях проростков озимой пшеницы, выращенных на среде с тяжелыми металлами и стевиозидом
3.9.1. Каталаза 94
3.9.2. Аскорбатпероксидаза 98
3.9.3. Глутатионредуктаза 102
3.10. Влияние стевиозида на структуру урожая и биометрические показатели яровой пшеницы 106
Заключение 108
- Роль АЗП в регуляции ростовых процессов и в ответе растения на стресс
- Определение морозоустойчивости растений
- Митотический индекс и длительность фаз митоза
- Влияние тяжелых металлов и стевиозида на содержание пролина и каротиноидов в проростках озимой пшеницы
Роль АЗП в регуляции ростовых процессов и в ответе растения на стресс
Лектины – это класс белков, высокоспецифично и обратимо взаимодействующих с углеводными лигандами, различных по функциям и структуре [Лазарева, 2009].
Предложенный У. Бойдом термин «лектины» (лат. legere – выбирать), указывает на избирательность их взаимодействия с углеводами [Потапов, 1966]. Молекулы фитолектинов состоят из двух или четырех субъединиц. Молярная масса этих белков колеблется в пределах от 36 кД (агглютинин зародыша пшеницы) до 265 кД [Марков,1983].
Примером взаимодействия лектинов с углеводами может служить реакция агглютинации частиц и клеток, например, эритроцитов. Наподобие антителам, лектины являются мультивалентными лигандами, их молекула имеет два или четыре центра связывания углеводов. Терминальный остаток углеводов, например, галактозы, маннозы и т.п., определяет специфичность взаимодействия лектинов с углеводными лигандами [Fujimoto et al., 2014].
Фитолектины различны по своей структуре и свойствам и разделяют на две основные группы – «классические» лектины, имеющие от двух и более центров связывания углеводных лигандов и способные к агглютинации клеток, и -лектины – имеют один центр связывания, взаимодействуют с гликозильными производными флороглюцина (антиген Яриева) и не способны к агглютинации эритроцитов [Jiang et al., 2010]. Показано, что лектины клетках растений могут быть растворимыми и связанными с мембранами или с клеточной стенкой. Компартментом клетки, где в основном содержатся лектины, является вакуоль, и собственно оттуда происходит секреция во внеклеточное пространство [Van Damme et al., 2004]. Эти углеводсвязывающие белки обнаружены в цитоплазме и во внутриклеточных органеллах, таких как ядро, пластиды и митохондрии [Шакирова, 2007]. Наличие лектинов в клеточных стенках может говорить о их важной функциональной роли в регуляции роста и дифференцировки тканей растений [Jiang et al., 2010]. Функции лектинов в организме растений очень различные. Эти гликопротеины могут выступать в качестве запасных белков, участвовать в транспортировке сахаров и гормонов, участвовать в регуляции роста и развития растений, выполнять защитную функцию при биотических и абиотических стрессовых условиях, а также показана их немаловажная роль в развитии симбиотических отношений между растениями и микроорганизмами [Van Damme et al., 2008; De Hoff et al., 2009; Шакирова, 2007; Бабоша, 2008; Kovalchuk et. al, 2012]. Имеются данные о повышении активности лектинов в условиях стресса, вызванного низкой температурой [Комарова и др., 2003; Тимофеева и др., 2008; 2010]. Также выявлена значительная роль кальциевого сигналинга в регуляции участия данных белков в низкотемпературном закаливании [Тимофеева и др., 2010].
Исходя из вышеуказанного, можно сделать вывод, что лектины полифункциональны и играют важную роль в жизнедеятельности растений в ходе всего онтогенеза.
Типичным представителем лектинов злаковых культур является агглютинин зародыша пшеницы (АЗП), у которого лучше всех исследованы физико-химические и биологические свойства, структура, биогенез, организация центров связывания с углеводными лигандами [Шакирова, 2001]. В связи с этим, следующие разделы посвящены данному лектину. 1.2.1. Структура и физико-химические свойства АЗП
Агглютинин зародыша пшеницы состоит из двух субъединиц, молекулярная масса одной субъединицы около 18 кДа. Этот белок, отличается высоким содержанием глицина и цистеина (23% и 18% соответственно), также имеет высокое сродство к N-ацетил-D-глюкозамину и N-ацетил-D-нейраминовой кислоте. АЗП принадлежит к семейству хитин-связывающих белков, содержащих гевеин-подобный домен [Schwefel et al., 2010] и проявляет стабильность в широком диапазоне температуры и рН.
Две субъединицы связаны нековалентными связями, каждая из которых имеет по 4 домена, состоящих из 43 аминокислотных остатков [Van Damme et al., 1998]. Субъединицы располагаются по принципу «голова к хвосту» и домены образуют пары, где одна пара формирует один углевод-связывающий сайт [Van Damme et al., 1998]. Показано, что четыре сайта могут функционировать одновременно или независимо друг от друга [Schwefel et al., 2010].
Усиленный синтез и накопление АЗП происходит в зародышевом корешке, колеоптиле и первичных адвентивных корней [Raikhel et al., 1993]. Но это не значит, что этот белок присутствует только на начальных стадиях развития. АЗП обнаружен в немалых количествах и в период вегетации растений и уровень его содержания в ходе онтогенеза сильно колеблется [Mishkind et al., 1982; Cammue et al., 1989; Shakirova et al., 2001].
Определение морозоустойчивости растений
Содержание ТМ и микроэлементов определяли методом атомно-абсорбционной спектрометрии. Для этого, листья и корни 9-ти суточных растений сушили в сушильном шкафу при 105 0С до постоянного веса. Корни перед сушкой промывали в течении 5 минут в растворе 10 мМ ЭДТА, чтобы смыть ТМ с поверхности корней. Высушенные листья и корни измельчали на специальном приборе до порошкообразного состояния. Затем к 100 мг образца наливали 5 мл концентрированной азотной кислоты и подвергали термической обработке при 160 0С. После этого, для уменьшения концентрации веществ, отбирали 2 мл полученной суспензии и доводили концентрированной азотной кислотой до 15 мл. Полученный раствор использовался для спектрометрии. 2.7. Определение содержания суммарных белков
Навеску листьев (1 г) растирали со стеклом в 40 мл боратного буфера с pH 10. Переносили содержимое в колбы, доводя объем до 50 мл с помощью боратного буфера. Взбалтывали 1 час. Полученный раствор (10 мл) центрифугировали при 8000 об/мин 15 минут. Затем отбирали 1 мл супернатанта и приливали к нему 9 мл боратного буфера. Смесь колориметрировали на спектрофотометре при 260 и 280 нм. Вычисление результатов проводили по следующей формуле: С=1,55Е280-0,76Е260 где С- концентрация белка, мг/мл; Е260, Е280 – полученные значения на спектрофотометре при заданных длинах волн. Окончательный расчет содержания суммарных белков (ССБ) в исходной навеске: ССБ = С5Н010 18060 где С - концентрация белка, мг/мл; Н – навеска растительного материала, г; 50- объем экстрагируемого раствора, мл; 86 – сухой вес листьев, %. Полученное содержание суммарных белков выражают в мг/г [Третьяков, 1990].
Навеску (4 г) суточных проростков озимой пшеницы сорта Мироновская 808 растирали в фарфоровой ступке пестиком при добавлении небольшого количества стекла и 10 мл 1 %-го раствора NaCl до получения однообразной мелкодисперсной кашицы. Суспензию количественно переносили в мерную колбу на 50 мл и после ополаскивания ступки и пестика небольшими порциями раствора NaCl (до 50 мл), настаивали гомогенат 1 час при 3-40С и постоянном перемешивании, затем центрифугировали при 5000g 15 минут. Полученную надосадочную жидкость (по 1мл) использовали в качестве ферментативного препарата для определения активности амилаз при помощи специально приготовленных растворов чистого крахмала заданной концентрации. Суммарную активность амилаз определяли при добавлении 0,2 н ацетатного буфера (рН 5,5) и 2% раствора крахмала. Смесь выдерживали при 40 С в течение 30 минут. После инкубирования в реакционную смесь каждой пробирки внесли по 2 мл 1 н раствора НС1 для прекращения действия фермента. К 0,5-ти мл смеси из каждой пробирки приливали по 1мл 0,1 н раствора НС1, 5 капель 0,3% раствора йода в 3% растворе йодистого калия. После доведения смеси до 50-ти мл водой, колориметрировали раствор на спектрометре при 595 нм (на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре). Для определения активности -амилазы, в оставшуюся часть ферментного препарата (5-8 мл) добавляли на кончике шпателя сухого уксуснокислого кальция и ставили на водяную баню при 70 С, выдерживали 15 мин, затем быстро охлаждали. При таких условиях -амилаза инактивируется практически полностью. Далее этот раствор использовали для определения -амилазной активности по методике, описанной выше.
Активность амилаз (в 1 мг гидролизованного крахмала за 1 ч на 1 мл ферментативного раствора) рассчитали по формуле: Ек-Е0 2-2 АА = , Ек 60 где Ек и Ео - светопоглощение контрольного и опытного растворов, единиц шкалы прибора; 2 и 2—пересчетные коэффициенты на 1 ч и 1 мл ферментного раствора; 60 — пересчетный коэффициент на 1 мг крахмала (3 мл и 2%-го раствора соответствуют 60 мг) [Третьяков с соавт., 1990].
Для определение свободного пролина берут три пробы корней по 1 гр каждая. Мелко их нарезают, заливают 10 мл 3%-го раствора сульфосалициловой кислоты и растирают в течение 5 мин в ступках до получения однородной массы, растертую массу переносят на фильтр. Затем берут 2 мл фильтрата, помещают в пробирки и добавляют 2 мл реагента, который готовят непосредственно перед опытом, растворяя 1,25 г нингидрина в смеси 30 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл фосфорной кислоты (6 моль/л). Затем в пробирки добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты. После тщательного перемешивания содержимого пробирки ставят на 1 ч в кипящую водяную баню. После этого пробирки охлаждают под холодной водой или в ледяной бане. Далее в каждую пробирку добавляют 4 мл толуола, взбалтывают 20-30 с и дают отстояться. Через 10-15 мин верхний слой толуола, в который переходит весь краситель, отделяют от водной фазы. Интенсивность окраски измеряют на ФЭКе при 520 нм против толуола. Концентрацию пролина определяют по калибровочному графику. Результаты расчета выражают в миллиграмм-процентах на сухое вещество, предварительно определив, сколько сухого вещества содержится в 1 г сырых корнях в контроле и стевиозиде при добавлении металлов. Сухой вес определяли по методике Третьякова [Третьяков, 1990].
Митотический индекс и длительность фаз митоза
Сравнивая ингибирующее действие разных тяжелых металлов на рост корней проростков кукурузы по суточному приросту корня, В.Б. Иванов с соавт. [Иванов и др., 2003] разделил металлы на три группы: сильнотоксичные (Cu, Ag), среднетоксичные (Cd и Hg) и слаботоксичные (Pb, Co, Zn). Однако согласно нашим данным, действие меди и кадмия несколько отличалось от этой классификации. В концентрации 1 мМ сульфат кадмия подавлял рост листьев на 56% и корней на 50% по сравнению с контролем, а в концентрации 10 мкМ - на 25% и 29% соответственно. Высокая концентрация CuSO4 влияла также, как и сульфат кадмия: уменьшала высоту листьев на 58% и длину корней на 46% по сравнению с растениями, выросшими на воде. При действии CuSO4 в концентрации 10 мкМ рост надземной части замедлился на 3% и корней – на 4%, что является несущественным и находится в пределах ошибки. Сульфат цинка снижал длину корней на 20%, а высоту листьев на 17% и только при его высокой концентрации. Субоптимальная концентрация ZnSO4 практически не повлияла на ростовые процессы. Таким образом, согласно полученным результатам, наибольшее токсическое действие на рост растений оказали медь и кадмий, а цинк проявил менее токсичное действие, что подтверждает литературные данные [Иванов и др., 2003]. Предобработка проростков стевиозидом в течение 5 суток уменьшила ингибирующий эффект на ростовые параметры озимой пшеницы всех трех исследуемых ТМ в обеих концентрациях. В варианте с медью и цинком в субоптимальной концентрации, мы наблюдали увеличение дитерпеноидным гликозидом ростовых параметров как листьев, так и корней выше контроля. В случае с кадмием в концентрации 10 мкМ видно уменьшение подавления роста листьев и корней на 10% и 12% соответственно, но данные значения до уровня контроля не поднялись.
Такую же картину видим и при выращивании растений на растворах ТМ в сублетальной концентрации, но в разной степени. Стевиозид уменьшил негативный эффект меди на рост листьев и корней на 7% и 21%, а цинка – на 12% и 16% соответственно. Наибольшее уменьшение подавления процессов роста предобработкой дитерпеновым гликозидом наблюдали в варианте с кадмием, что составило для листьев 19%, а для корней 24%. Таблица 3 - Митотический индекс корней проростков озимой пшеницы сорта Казанская 560 при действии стевиозида и тяжелых металлов. - вариант достоверно отличающийся от контроля (значение p 0,05). НгО стевиозид (Ю"8М) контроль 5,2 ± 0,20 6,7 ± 0,30 Cd (1мМ) 1,8 ± 0,09 2,9 ± 0,15 Cd (10мкМ) 3,8 ± 0,19 4,6 ± 0,23 Си (1мМ) 1,9 ± 0,01 3,1 ± 0,15 Си (10мкМ) 4,8 ± 0,25 6,4 ± 0,30 Zn (1мМ) 3,5 ± 0,17 5,3 ± 0,26 Zn (10мкМ) 4,9 ± 0,24 6,4 ± 0,30 Также было интересно посмотреть, как повлияет стевиозид на митотический индекс на фоне действия поллютантов. Как показали результаты наших исследований (таблица 3), ТМ в высокой (1 мМ) концентрации подавляли митотическую активность в корнях проростков пшеницы - в вариантах с кадмием и медью разница с контролем составила 65% и 63% соответственно, а в варианте с цинком - 33%. При низкой (10 мкМ) концентрации достоверное изменение исследуемого параметра наблюдали только в варианте с кадмием, где разница с контролем составила 27%.
Предобработка дитерпеновым гликозидом уменьшала негативный эффект ТМ на митотическую активность корней проростков (таблица 3). Так, на фоне стевиозида разница с контролем данного параметра при действии сублетальных концентраций кадмия и меди составила 44% и 40% соответственно, напротив 65% и 63%. В варианте с цинком в концентрации (1 мМ) уменьшение митотической активности не наблюдалось.
В субоптимальной концентрации (10 мкМ) на фоне стевиозида кадмий уменьшил пролиферативную активность на 12%, а в вариантах с медью и цинком наблюдали увеличение пролиферации клеток корней проростков пшеницы на 23%. Чтобы выявить, механизм данного положительного эффекта стевиозида при действии ТМ, надо было понять, на каком уровне происходит защитное действие дитерпенового гликозида. Либо он активирует внутриклеточные системы защиты от поллютантов, такие как синтез металлотионеинов и фитохелатинов с дальнейшей их компартментацией в специализированных органеллах [Чиркова, 2002], либо предотвращает их поступление в клетки. С этой целью мы изучили элементный состав корней и листьев при выращивании проростков на растворах стевиозида и ТМ.
Влияние тяжелых металлов и стевиозида на содержание пролина и каротиноидов в проростках озимой пшеницы
Данная работа посвящена исследованию рострегулирующей и антистрессовой активности стевиозида – гликозида, получаемого из растения Stevia rebaudiana Bertoni.
В ходе анализа различных концентраций, нами выявлено, что стевиозид проявляет наибольшую физиологическую активность в концентрации 10-8М. В литературе есть данные, что производные стевиола, являющегося агликоном стевиозида, проявляют гиббереллиноподобную активность [Oliveira et al., 2008]. Однако наши эксперименты показали, что стевиозид не обладает всем спектром действия гиббереллинов, поскольку нами не было обнаружено его влияния на активность -амилазы, являющийся одним из наиболее хорошо изученных свойств природных гиббереллинов.
В доказательство отсутствия аналогии с гиббереллинами может говорить их антистрессовый эффект на растения озимой пшеницы при воздействии гипотермии. Также, выявлено, что изменение стевиозидом морфометрических параметров проростков пшеницы связано с активацией деления клеток, тогда как общепринято, что гиббереллины, в большинстве своем, активируют рост клеток растяжением.
Основываясь на полученных данных по влиянию стевиозида на морфометрию и морозоустойчивость растений озимой пшеницы, мы провели эксперимент по использованию стевиозида в качестве антистрессового регулятора роста при воздействии на растения тяжелых металлов. Результаты исследования показали, что стевиозид снимал ингибирующий эффект поллютантов на рост растений. Мы предполагаем, что данный положительный эффект стевиозида связан с его влиянием на активность растворимых лектинов (под которым мы подразумеваем АЗП). Показано, что АЗП, преимущественным местом синтеза которого является меристематическая ткань корней проростков, может влиять на гормональный баланс растений, в том числе и на стрессовый фитогормон АБК [Bogoeva et al., 2004]. Также в литературе есть данные, что повышение уровня
АЗП в клетках корней сопровождается его секрецией в окружающую наружную среду, где, предположительно, он может выступать связывающим агентом ТМ за счет своих SH- групп. Кроме того, для экзогенного АЗП выявлен эффект усиления лигнификаци клеточных стенок, которое в свою очередь может выступать дополнительным барьером при поступлении ТМ в клетки [Мурзабаев, 2015]
Исходя из наших данных можно предположить, что секреция АЗП в окружающую среду, стимулированная стевиозидом, может способствовать связыванию тяжелых металлов (в большей степени меди) в прикорневой зоне, что препятствует их поступлению в растения (схема 5). На следующем этапе стевиозид, влияя на работу кальциевых каналов, препятствует поступлению тяжелых металлов (в первую очередь кадмия) в клетки растений.
Попадая в клетки, ТМ вызывают интенсивное образование активных форм кислорода, которые в свою очередь вызывают перекисное окисление липидов, о чем говорит повышенный уровень малонового диальдегида, основного продукта реакции ПОЛ. Наши исследования показали, что стевиозид снижал повышенный уровень МДА и перекиси водорода, вызванный токсичным действием ТМ, преимущественно за счет активации синтеза неферментативных защитных соединений, таких, как пролин и каротиноиды, что в свою очередь вызывало снижение уровня МДА.
Также на уровень АФК могут оказывать влияние растворимые лектины. В литературе говорится о влиянии АЗП на окислительный статус клетки посредством активации антиоксидантной системы, которое связано, как указывалось выше, с регуляцией гормонального баланса клетки. Показано, что экзогенный АЗП способен сбалансированно активировать про-/антиоксидантную системы в корнях проростков пшеницы, что отражается в существенном уменьшении кадмий-индуцированной продукции АФК и, соответственно, снижении активности антиоксидантных ферментов [Мурзабаев, 2015]. Это подтверждает полученные нами данные по снижению под действием стевиозида стимулированной ТМ активности актиоксидантных ферментов, таких как аскорбатпероксидаза, глутатионредуктаза и каталаза.
Совокупность вышеуказанных эффектов стевиозида, видимо и вызывало уменьшение негативного действия ТМ на рост и развитие растений озимой пшеницы.
На основании лабораторных исследований, мы провели полевые испытания дитерпенового гликозида стевиозида. Трехлетние исследования показали, что стевиозид повышал урожайность яровой пшеницы на 15%, прежде всего, за счет увеличения озерненности колоса и массы зерен.