Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ. Первичные процессы фотосинтеза, включающие поглощение квантов света пигментами светособирающей антенны, перенос энергии возбуждения к фотохимически активным формам хлорофилла реакционных центров, разделение и стабилизацию в них зарядов - происходят в пигмент-липопротеиновых системах фотосинтетического аппарата. Естественно, что без выявления общих закономерностей и индивидуальных особенностей организации отдельных компонентов ХБК и их взаимодействия, невозможно понять принципы построения фотосинтетического аппарата и механизмы преобразования энергии света при фотосинтезе.
Структурная организация фотосинтетических мембран достаточно широко исследована. Основное внимание уделено структуре ХБК фотосистем и электрон-транспортной цепи хлоропласта. В настоящее время широко исследуются процессы взаимодействия и самосборки отдельных компонентов мембран (Москаленко, Ерохин, 1983; Ладыгин и др., 1983; Москаленко и др., 1987; Heber et al., 1978). Самосборка и функционирование ХБК в составе пигмент-липопротеиновых ассоциатов мембран происходят при взаимодействии входящих в их состав белков с окружающим липидным матриксом и основаны на гидрофобных и гидрофильных контактах, ионных, ковалентных и водородных связях.
Сокращения: ХБК - хлорофилл-белковый комплекс, ФСІ фотосистема І, РЦІ - реакционный центр фотосистемы I с ближайшим окружением, CCKI - светособирающий комплекс фотосистемы І, ФСП -фотосистема II, Хл - хлорофилл, SDS - додецил сульфат натрия, СопА -Конканавалин А.
Один из возможных способов подобных взаимодействий может быть также основан на принципах молекулярного узнавания. Данные по локализации лектиков в мембранах растительных клеток (Bowles et al., 1979; Купцова и др.,1989; Выскребенцева и др., 1990; Алексидзе и др., 1991) позволяют предположить возможность участия пектинов в самосборке и поддержании структурной организации мембран. В связи с этим представляет значительный интерес изучение участия пектинов как углевод-связывающих белков неимунной природы, основной функцией которых является функция молекулярного узнавания, в организации липопротеиновых комплексов фотосинтетических мембран.
Удобным объектом для изучения структурной организации
фотосинтетических мембран, самосборки и функционирования ХБК
являются одноклеточные зеленые водоросли - эукариотические
организмы, структурно-функциональная организация
фотосинтетического аппарата которых сходна с таковой у высших растений. Это связано с целым рядом особенностей микроводорослей, таких, как возможность культивирования в интенсивных полностью контролируемых условиях, наличие одного хлоропласта в клетке, короткий жизненный цикл.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью настоящей работы явилось исследование ХБК Dunaliella salina и идентификация лектиноподобных полипептидов.
Достижение цели исследования потребовало решения следующих основных задач:
1. Разработать метод определения пектиновой активности с использованием клеток микроводорослей.
-
Осуществить постепенную разборку тилакоидных мембран и исследовать полипептидный состав, молекулярные и спектрофлюориметрические характеристики ХБК D. salina.
-
Идентифицировать полипептиды, способные взаимодействовать с углеводами в составе мембран хлоропластов, и исследовать углеводную специфичность лектиноподобных белков D. salina.
-
Провести сравнительный анализ гомологии известных аминокислотных последовательностей лектинов и полипептидов ХБК хлоропласта.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые показано существование в CCKI D. salina лектиноподобных полипептидов, установлена их способность связываться с галактозой и ее производными.
Впервые исследованы полипептидные и спектральные характеристики CCKI D. salina.
Предложен новый способ определения лектиновой активности с использованием в качестве тест-объекта клеток микроводорослей -альгоагглютинация, применение которого вероятно позволит осуществлять поиск новых лектинов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались на 9-ом Конгрессе Европейского общества физиологов растений (Брно, 1994); 14-ом Съезде Европейского общества по новым методам в сельскохозяйственных исследованиях (Варна, 1994); расширенном семинаре Института физиологии растений РАН (Москва, 1995).
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, 4 глав экспериментальной части, заключения
и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 20 рисунков и 7 таблиц.
Основным объектом исследования служила одноклеточная галофильная зеленая водоросль Dunaliella salina Teod. lPPAS D-209 из коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН - IPPAS (Семененко, 1991). Объектами исследования служили также Chlorella vulgaris IPPAS С-1 и Chlamydomonas reinhardtii CW-15 IPPAS D-221.
Культивирование водорослей проводили в накопительном режиме в стерильных условиях при круглосуточном освещении, оптимальной для каждой культуры температуре и непрерывном барботировании газо-воздушной смесью, содержащей 1.7-2% СС>2 (Владимирова, Семененко, 1962).
Скорость роста культур определяли по упакованному объему клеток (packed cells volume - PCV; Kodama et al., 1993) и спектрофотометрически по оптической плотности при 750 нм (D750) на спектрофотометре "Specol".
Дезинтеграцию клеток осуществляли в гомогенизаторе со стеклянными бусами (Семененко, Касаткина, 1972).
Выделение субхлоропластных фракций проводили по методу, предложенному Bruce and Malkin (1989) и Knoetzel et al. (1992). Схема выделения представлена на рис. 1.
Выделение комплексов ФСІ и ФСІІ проводили солюбилизацией мембран хлоролластов октилглюкозидом и холатом натрия и центрифугированием при 60 000 об/мин, 1 ч. Фотосистемы солюбилизирова-ли Тритоном Х-100 и центрифугировали 10 мин при 38 000 д.
супернатант
разрушение
ц/ф ЗВОООд, 5 мин
осадок
супернатант
октилглюкозид+яолат Ыа ц/ф 6D000g, 1ч
осадок
Тритон Х-100
ц/ф 38000д, Юмин
I
додецилмальтозид
+ цвиттергент
лин.гр.плотности
сахарозы
ц/ф б00.00об/мин,3ч
ФСІ-
лин. гр. плотности сахарозы
ц/ф 27000об/мин,17ч
Ч /
Тритон' Х-100 + SDS
препаративный электрофоров
СС!
D-РЦ! С
в - ссга а - ссга
Элюция
Рис. 1.
Схема выделения субхлоропластных фракций из D.salina.
Очистку ФСІ проводили центрифугированием фракции, обогащенной ФСІ 17 ч при 27 000 об/мин в линейном градиенте плотности сахарозы (0.4 - 1.0 М).
Разделение ФСІ на ССКІ и РЩ достигалось двумя способами: (1) обработкой ФСІ цвиттергентом и додецил-(3-0-мальтозидом с последующим центрифугированием 3 ч при 60 000 об/мин в линейном градиенте плотности сахарозы (0.1-1.0 М); (2) действием Тритона Х-100 и SDS в соотношении Тритон'.БОЭ'.Хл, 5:5:1 по массе и разделением с помощью препаративного электрофореза в плоском геле толщиной 2 мм в течение 12 ч.
Определение молекулярных масс полипептидов осуществляли с помощью электрофореза в SDS-ПААГ по методу Laemmli (1970).
Содержание хлорофилла определяли спектрофотометрически в метанольных зкстрактах(МагІшеІІ, 1986).
Спектр низкотемпературной флюоресценции измеряли при 77 К (Ikeuchi et al„ 1991).
Содержание белка в полученных фракциях определяли по методу Bradford (1976).
Пектиновую активность определяли с помощью гем- и альгоагглютинации методом микротитрования по Такачи (Kishinevsky etal., 1988).
Углевод-связывающую специфичность определяли по
способности различных углеводов к подавлению
гемагглютинирующей активности (Kishinevsky et al., 1988).
Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей проводили с использованием компьютера IBM PC/AT и пакета программ IBI/Pustell Sequence Analysis Programs (США).
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТИНОВОЙ АКТИВНОСТИ С ПОМОЩЬЮ КЛЕТОК МИКРОВОДОРОСЛЕЙ - АЛЬГОАГГЛЮТИНАЦИЯ.
В связи с тем, что пектины служат ценным инструментом в биологических и медицинских исследованиях, актуальным является поиск новых способов тестирования лектиновой активности, которые позволят выявить ранее неизвестные лектины.
Микроорганизмы широко используются для определения лектиновой активности, однако фотосинтезирующие клетки микроводорослей до сих пор не применялись для тестирования пектинов. Можно предположить, что благодаря огромному разнообразию видов, возможности культивирования в полностью контролируемых условиях, одноклеточные водоросли послужат удобным объектом для поиска специфичных пектинов.
Для определения лектиновой активности использовали одноклеточные зеленые водоросли - Chlamydomonas reinhardtii CW-15, мутант, лишенный клеточной стенки; Chlorella vulgaris, имеющую целлюлозную клеточную стенку; Dunaliella salina, природную форму, лишенную клеточной стенки. Реакцию альгоагглютинации в присутствии коммерческого препарата СопА сравнивали с наиболее распространенным способом тестирования пектинов гемагглютинацией.
Активность СопА по агглютинации клеток микроводорослей, сравнимая с активностью реакции гемагглютинации, была получена в случае использования С. reinhardtii С\ЛМ5(табл. 1). Высокое значение концентрации СопА при агглютинации клеток С. vulgaris могло быть связано с тем, что клеточная стенка ограничивает доступ
к углеводным детерминантам, связывающим пектины. Клетки D. salina, несмотря на отсутствие клеточной стенки, не взаимодействовали с СопА, вероятно из-за свойств оболочки этих водорослей или отсутствия углеводных участков, специфичных к СопА.
Таблица 1, Сравнительная характеристика вызываемой СопА агглютинации клеток различных культур микроводорослей и эритроцитов кролика.
Реакция альгоагтлютинации имела меньшую чувствительность по сравнению с реакцией гемагглютинации, однако позволяла судить об активности через 1 час, тогда как гемагглютинации - через 2 часа после начала реакции.
Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности использования фотосинтезирующих микроорганизмов в качестве тест-объекта для определения лектиновой активности и указывают на наличие в плазмапемме С. reinhardtii углеводсвязывающих участков, специфичных к маннозе.
ЛЕКТИНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ХЛОРОФИЛЛ-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ DUNALIELLA SAUNA.
Исследование возможной роли "узнавания" в самосборке хлоропластных мембран выдвигает на первый план задачи выделения и очистки отдельных компонентов, изучения их молекулярных и спектральных характеристик.
Выделение и характеристика хлорофилл-белковых комплексов D. salina.
Фракции, обогащенные ФСІ и ФСИ, были получены с помощью солюбилизации хлоропластных мембран D.salina Тритоном Х-100 с последующим дифференциальным центрифугированием (рис. 1). Фракция, обогащенная ФСІ (рис. 2, трек 1), содержала преимущественно полипептиды с молекулярными массами около 60 кДа, фракция, обогащенная ФСИ (рис. 2, трек 2), - белки около 30 кДа. Полипептидный состав полученных фракций характерен для комплексов ФСІ и ФСИ из высших растений и одноклеточных водорослей.
Чистая фракция ФСІ (рис. За,б, трек 1), состоящая из полипептидов с молекулярными массами около 60 кДа и от 29 до 18 кДа, была получена с помощью центрифугирования фракции, обогащенной ФСІ, в градиенте плотности сахарозы. Отношение Хл а/Ь равнялось 4.8. Спектр низкотемпературной флюоресценции характеризовался двумя пиками - 686 и 706 нм (рис. Зв).
Разделение ФСІ на CCKI и РЦІ осуществляли обработкой цвиттергентом и додецил-р-О-мальтозидом и фракционированием в градиенте плотности сахарозы. CCKI содержал узкую яркую полосу с молекулярной массой 29 кДа, а также широкую мажорную полосу,
^ 1
J і l_
-1 і-J.
.і І L.
Рис. 2.
Денсйтограммы белковых фракций, полученных при разделении суммарной' 'фракции мембран хлоропластов D.salina с помощью солюбилизации Тритоном Х-100 и центрифугирования 38 000 д.
1 - фракция, обогащенная ФСІ, 2 - фракция, обогащенная ФСИ.
соответствующую, возможно, двум полипептидам с молекулярными массами 27 и 28 кДа (рис. За,б, трек 2). Отношение Хл а/Ь составляло 3.6. Максимум низкотемпературной флюоресценции находился при 685 нм (рис. Зв). РЦІ (трек 3), содержал все те же белки, что и ФСІ (трек 1), за исключением полипептидов от 27 до 29 кДа, характерных для CCKI. Отношение Хл а/Ь - 13, максимум флюоресценции 713 нм (рис. Зв).
Представленные характеристики полипептидного состава, отношения Хл а/Ь и значения максимумов низкотемпературной
м
94 67.
43,
3.
З0'і«мі
20.1
14.4
}Ш&: Ш
ДЛИНА ВОЛНЫ (нм)
Рис. 3.
Электрофореграммы (а), денситограммы (б) и спектры низкотемпературной флюоресценции (в) белковых комплексов D.salina, полученных с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы.
1 - ФСІ; 2 - CCKI; 3 - РЦІ; м - метчики: фосфорилаза b (94), альбумин (67), овальбумин (43), карбоангидраза (30), ингибитор трипсина (20.1) и лактапьбумин (14.4 кДа).
флюоресценции присущи комплексу ФСІ и составляющим его компонентам, и свидетельствуют о чистоте полученных ХБК (Ладыгин, Лебедев, 1986).
При .разделении комплекса ФСІ с помощью препаративного электрофореза, помимо РЦІ (зона D, рис. 1), удалось получить два CCKI (зоны А и В). Зона С была представлена минорными компонентами и в дальнейшем, к сожалению, не исследовалась.
Подкомплекс CCKI-A представлен главным образом полипептидом с молекулярной массой 28 кДа и следовыми количествами белков 29 и 24 кДа. ССК1-В содержал мажорные полипептиды 28 и 29 кДа и минорный белок 24 кДа (рис. 4а,б). Полипептид с молекулярной массой 24 кДа возможно являлся одной из субъединиц РЦІ, мигрирующей вместе с CCKI, как это описано при выделении CCKI из ячменя (Knoetzel et al., 1992). Максимум низкотемпературной флюоресценции комплексов CCKI-A и CCKI-B соответствовал 685 нм (рис.4в).
Известно, что CCKI у многих объектов состоит из двух подкомплексов с максимумами низкотемпературной флюоресценции около 680 и 730 нм. Отсутствие у D. salina CCKI с максимумом флюоресценции выше 700 нм может быть особенностью объекта, либо следствием наличия у комплексов одинаковых белков, т.к. зоны А и В при разделении располагались очень близко друг от друга (рис. 1), и оказалось невозможно чисто разделить комплексы, состоящие из полипептидов со столь близкими молекулярными массами.
Таким образом, в ходе постепенной разборки тилакоидных мембран D. salina выделены и исследованы электрофоретически и спектрофлюориметрически белковые фракции, обогащенные ФСІ и ФСН, а также содержащие: чистую ФСІ, РЦІ и CCKI D. salina. Электрофоретические характеристики ФСІ и РЦІ полностью
94 С7 43 20 10.1 14.4 04 С7 43 3^
Рис. 4.
Электрофореграммы (а), денситограммы (б) и спектры низкотемпературной флюоресценции (в) белковых комплексов ФСІ D.salina, полученных после разделения ФСІ в препаративном электрофорезе. м - метчики, А - CCKI-680A, В - ССК1-680В
МАВ
67 :;'Ш;
43 Щ
ЗО ЧІ^ЦІ^Й**
>*іяв*4
20.1 і?
14.4'у
ДЛИНА ВОЛНЫ (нм)
соответствовали описанным ранее для этого объекта (Bruce and Malkin, 1988). Полипептидный состав CCKI D. salina исследован впервые. Установлено, что CCKI включает два подкомплекса: CCKI-А, содержащий белок 28 кДа, и ССК1-В, состоящий из полипептида(ов) 29 (28) кДа.
Идентификация лектиноподобных полипептидов в хлорофилл-белковых комплексах D.salina.
Для идентификации лектиноподобных белков в хлоропластах D.salina все фракции хлоропластных мембран, полученные при постепенной разборке мембран до отдельных комплексов и индивидуальных белков, тестировали на проявление лектиновой активности.
Таблица 2. Пектиновая активность субхлоропластных фракций D.sa//na.
ФСІ* - фракция, обогащенная ФСІ
ФСП* - фракция, обогащенная ФСП
Величина лектиновой активности фракции, обогащенной ФСІ, почти в 5000 раз превышала это значение для фракции, содержащей преимущественно полипептиды ФСП (табл. 2). Исходя из этого, было сделано заключение, что лектиноподобные полипептиды D. salina входят преимущественно в состав ФСІ.
Очистка ФСІ и разделение ее центрифугированием в градиенте плотности сахарозы показала, что лектиновой активностью обладают полипептиды, входящие в состав ССКІ. Белки РЦІ не проявляют агглютинирующей активности (табл. 2).
Увеличение удельной гемагглютинирующей активности ССКІ по сравнению с ФСІ также свидетельствует о локализации лектиноподобных белков у D.salina в ССКІ. Снижение агглютинирующей активности по мере очистки ФСІ могло быть обусловлено присутствием сахарозы во фракции ФСІ, т.к. в предварительных экспериментах было установлено, что в растворах сахарозы пектиновая активность снижается.
Таблица 3. Агглютинирующая активность белковых фракций, выделенных из D.salina с помощью препаративного электрофореза.
CCKI-680A и CCKI-680B, полученные с помощью препаративного электрофореза, проявляли близкую по значениям агглютинирующую активность (табл. 3), а РЦІ, как и в случае выделения в градиенте плотности сахарозы, не обладал лектиновой активностью. Как было показано выше (рис. 4), CCKI-680A состоит из мажорного полипептида с молекулярной массой 28 кДа и следов белка 29 кДа, CCKI-680B содержит примерно в равной концентрации полипептиды 28 и 29 кДа. Исходя из этого можно сделать вывод, что белок 28 кДа несомненно обладает лектиновой активностью. Не исключено,
однако, наличие агглютинирующей активности и у полипептида 29 кДа.
Как известно, пектинами называются углеводсвязывающие белки, способные обратимо агглютинировать клетки, или преципитировать полисахариды или гликоконьюгаты. Для подтверждения пектиновой природы полипептидов CCKI D.salina была исследована их углеводная специфичность. Агглютинирующая активность фракции, обогащенной ФСІ, ингибировалась D-галактозой и D-галактозамином и не ингибировалась рядом других углеводов (табл. 4). Поскольку агглютинирующая активность полипептидов ФСІ обусловлена белками CCKI, можно сделать заключение, что полипептиды CCKI являются галактозоспецифичными.
Таблица 4. Действие различных углеводов на гемагглютинирующую активность пектина из D.salina.
Поиск гомологии аминокислотных последовательностей лектинов и полипептидов хлорофилл-белковых комплексов
хлоропласта.
Поскольку полипептиды CCKI обладают пектиновой активностью и способны узнавать и связываться с галактозными лигандами, можно предположить существование гомологичных аминокислотных последовательностей у полипептидов ССК и лектинов. В настоящее время установлены первичные структуры как белков ССК, так и лектинов, в том числе, их углеводсвязывающих сайтов, из многих растительных объектов.
Сравнение известных аминокислотных последовательностей
углеводсвязывающих сайтов лектинов бобовых позволило
представить консенсус, ответственный за связывание с углеводами
следующим образом: DTXXNXXW (где X - позиции
неконсервативных аминокислот) (рис. 5). На рисунке представлены последовательности только галактозо-специфичных лектинов, хотя следует отметить, что углеводную специфичность определяют неконсервативные аминокислоты.
Последовательность, гомологичная сайту связывания лектинов с углеводами, обнаружена у большинства белков CCKI и ССКП на С-конце. Гомология составляет от 20 до 50 %, что является довольно большой величиной, если принять во внимание, что сравнивались эволюционно очень далеко отстоящие друг от друга белки. Гомология между углеводсвязывающим сайтом лектинов и белками РЦ не выявлена.
Эти результаты хорошо согласуются с представленными выше экспериментальными данными о локализации лектиноподобных полипептидов в CCKI. Не менее важным представляется
установленный факт отсутствия углеводсвязывающего сайта у полипептидов РЦІ, что показано в результате анализа аминокислотных последовательностей и исследования лектиновой активности этого комплекса.
Рис. 5.
Гомология аминокислотных последовательностей
углеводсвязывающих сайтов лектинов и белков светособирающих комплексов.
лектины бобовых: Cytisus scoparius Bauhinia purpurea Griffonia simplicifolia Phaseolus vulgaris Phaseolus vulgaris Erythtina corallodendron Dolichos biflorus Glycine max
белки ССК томата:
Компьютерное исследование профилей гидрофобное углеводсвязывающих сайтов лектинов и гомологичных им участков аминокислотных последовательностей полипептидов ССК показало, что эти участки представлены, в основном, гидрофобными аминокислотами.
На основании установленного нами факта существования лектиновой активности у полипептида(ов) CCKI D. salina можно представить, что углеводсвязывающие центры лектиноподобных полипептидов CCKI взаимодействуют с остатками галактозы, входящими в состав галактолипидов липидного бислоя тилакоидных мембран, образуя единый глико-липопротеиновый комплекс хлоропласта (рис.6).
В пользу этой гипотезы свидетельствуют следующие факты:
наличие гемагглютинирующей активности у полипептидов, входящих в состав CCKI D. salina;
специфичность лектиноподобных белков CCKI D. salina к галактозе и, следовательно, их способность "узнавать" и связывать галактозу;
характеристика липидного состава тилакоидных мембран, основными компонентами которых являются галактолипиды;
- обнаружение гомологии аминокислотных последовательностей
углеводсвязывающих сайтов лектинов и белков ССК;
- локализация гидрофобного углеводсвязывающего сайта
полипептидсв ССК на границе липидного бислоя и люмена
(Kuhlbrandt et al., 1994), что не препятствует его взаимодействию с
гидрофильными детерминантами;
широкий оптимум рН для проявления лектиновой активности (Datta, 1991) и вытекающая из этого возможность функционирования лектинов даже при кислом значении рН люмена на свету;
топология белков CCKI на границе ХБК с липидным бислоем и ориентация галактозных остатков галактолипидов в межмембранное пространство.
CH2OH
он 9 Строма
Внутритилакоидное пространство
Рис. 6.
Схема возможных взаимодействий полипептидов ССКІ, обладающих лектиноподобными свойствами, с галактолипидами липидного бислоя тилакоидных мембран хлоропласта.
Таким образом, липид-белковое взаимодействие через галактозу лектиноподобных галактозоспецифичных полипептидов ССКІ е.. галактолипидами липидного бислоя мембран тилакоидов может иметь существенное значение для понимания особенностей липид-белковых взаимодействий в тилакоидных мембранах по принципу молекулярного узнавания и рассматриваться, как еще один механизм самосборки и функционирования мембран хлоропластов.
Актуальность темы. Важной проблемой современной экологической физиологии растений является изучение механизмов устойчивости растений к различным неблагоприятным условиям, в том числе к действию морозов. Среди факторов, положительно влияющих на низкотемпературное закаливание и морозоустойчивость растений, особое внимание необходимо уделить кальцию. Кальциевые удобрения способствуют лучшей перезимовке озимых культур (Авдонин,I960), полезны» биохимическим изменениям и увеличению холодостойкости кукурузы (Колоша, 1962,1963). Ионы кальция повышают жизнеспособность культуры клеток листьев озимой пшеницы после действия отрицательных температур (Рогаегоу,Andrews, 1985,1986) и увеличивают сопротивляемость изолированных протопластов закаленных клеток коры бузины красной к вредным последствиям замерзания - сокращению объема и обезвоживанию (Исабеков, Красавцев, 1989).
Физиологическое значение кальция связывалось с его субстратной ролью (Бушуева, 1964) ввиду компартмектализации катиона в клеточных стенках, вакуолях (Kauss, 1987; Kinzel, 1989), мембранах и органеллах (Moore, Akerman, 1984), а также в связи с наличием хелатированного кальция, ассоциированного с белками/ органическими кислотами, нуклеотидами (Левицкий, 1990).
Пусковым механизмам, лежащим в основе многих процессов роста и развития растений (митоза и цитокинеза, клеточного растяжения, полярного роста, движения протоплазмы, секреции и др.), в 80-е годы была дана более глубокая трактовка на основании появления данных, свидетельствующих об участии ионов кальция в регуляции клеточного метаболизма растений в качестве вторичного посредника (Маггае, 1985; Hepler, Wayne, 1985; Poovaiah, 1987). Восприятие и передача таких внешних стимулов, как свет, гормоны и гравитация, сопрождается возникновением в клетках растений кальциевого сигнала, означающего увеличение концентрации свободного Сай+ в ци-тозола (Hepler, 1938). Зти данные позволяют считать, что значение кальция в позышении устойчивости растений может быть связано с его мессенджерной функцией з системе "сигнал - клеточный ответ". Высказано предположение об участии кальция в трансдукции температурного сигнала как вторичного посредника при холодовом повреждении (Minorsky, 1985) и закаливании (Хохлова и др.,3993а)
_ 4 -растений. Однако механизмы функционирования Са2+ в процессах адаптации растений к температурным условиям существования остаются недостаточно изученными.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в выяснении закономерностей действия Саг+ на содержание растворимых белков, их компонентный и аминокислотный состав и уровень свободных аминокислот как важных составляющих механизма закаливания и морозоустойчивости растений.
При проведении исследований были поставлены следующие задачи:
-
изучить динамику общего содержанья Са2+ в тканях и изменение проницаемости клеточных мембран в условиях длительного осеннего и кратковременного контролируемого закаливания озимой пшеницы при внесении в почву кальциевых удобрений и использовании различных Са2+-содержащих сред:
-
исследовать влияние Са2+ на содержание растворимых бел-коБ, их полиморфизм и аминокислотный состав;
-
изучить аккумуляции свободных аминокислот а тканях в связи с разной обеспеченностью кальцием закаленных и промороженных растений;
-
установить елияниє ингибиторов и активаторов поступления Саї+ в клетки на растворимость белкового комплекса и накопление свободного пролина при низкотемпературном воздействии.
Научная новизна. Впервые проведены систематические исследования, связанные с изучением физиологической роли Ca2v в процессе низкотемпературного закаливания растений. При изучении динамики общего содержания Са2+ в тканях и экзоосмоса электролитов из них в условиях длительной осенней адаптации, а также после краткосрочного контролируемого закаливания и промораживания ус-тановлэно регуляторное влияние проницаемости мембран на содержание Са2+.
На основании впервые установленной прямой корреляции между, уровнями Са2+ и растворимых белков сделано заключение о том, что изменение содержания белкоз в процессе низкотемпературного закаливания растений относится к Са2+-зависимым физиолого-биохими-ческим реакциям. Показано индуцированное кальцием повышение гетерогенности растворимых белков и содержания гидрофильных аминокислот в их составе в период устойчивой адаптации оастений к
- 5 -низким температурам. Отмечено сохранение относительной доли связанного пролина на постоянном уровне в белках растений, обеспеченных кальцием, в течение продолжительной естественной адаптации, что может свидетельствовать об увеличении в составе растворимых белков пролинсодержащих фракций. Обнаружено, что Са24 у незакаленных растений вызывает накопление свободных аминокислот, а у закаленных - более позднюю их аккумуляцию в осеннее время по сравнению с контролем.
Впервые продемонстрирована тесная отрицательная корреляция между содержанием Саг+ и свободного пролина в растениях во время закаливания, которая нарушалась после промораживания. Обсуждаются разные механизмы накопления свободного пролина при действии низких закаливающих и повреждающих температур. Предполагается, что одной из причин аккумуляции пролина к концу осеннего закаливания является уменьшение общего содержания Са2+ в тканях растений, которое.ограничивает использование аминокислоты для синтеза растворимых белков. После промораживания растений доминирующей причиной резкого увеличения содержания свободного пролина может быть деструкция белков.
На основании полученных данных в работе дается физиологическое обоснование приспособительной роли Са2+ в развитии морозоустойчивости растений.
Практическая значимость.Проведенные исследования вносят новое в понимание механизмов закаливания растений с участием Сас+ и способствуют выяснению первичных температурозависимых реакций клеточного метаболизма, лежащих в основе адаптации и устойчивости озимых культур к действию морозов. Некоторые из полученных результатов могут найти применение при тестировании морозоустойчивости озимой пшеницы. Целесообразно также использовать теоретические обобщения при чтении спецкурсов по физиологии устойчивости и стрессолсгии растений.
Применение кальциевых удобрений, приводящее к увеличению накопления растворимых батков, обладающих криопротекторными защитными свойствами, создает предпосылки для повышения выживаемости и, в конечном итоге, продуктивности растений озимой пшеницы.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на III Всесоюзном симпозиуме "Клеточные механизмы адаптаиии"(Чернигов, 1991г.), Международной конференции "Успехи
современной криобиологии"(Харьков, 1992г.), отчетных научных конференциях Казанского университета (1991,1992,1995гг.), на совместном с Гиссеьским университетом семинаре " Механизмы адаптации растений к холоду" (Германия, 1994rJ.
Публикации.По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводоз, списка литературы и приложения. Работа изложена на - стр. машинописного текста, содержит 23 рис.,18 таблиц. Список цитированной литературы включает наименований, из них - на иностранных языках.
