Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1 Глубокое замораживание как способ сохранения биоразнообразия растений
1.1.1 Преимущества криосохранения 7
1.1.2 Особенности криосохранения растительных клеток. 8
1.1.3 Криосохранение семян 9
1.1.4 Криосохранение изолированных клеток и органов, культивируемых vitro 10
1.1.5 Криосохранение орхидных 12
1.2 Механизмы повреждения растительных клеток при криосохранении:
1.2.1 Образование льда и витрификация в воде и растворах 13
1.2.2 Повреждения, вызванные образованием внутриклеточного льда 18
1.2.3 Повреждения, вызванные образованием внеклеточного льда 19
1.2.4 Другие механизмы повреждений 22
1.2.5 Роль плазматической мембраны в повреждении клеток при криосохранении 25
1.3 Криопротекторы 28
1.4 Основные методы в криосохранении. 38
1.4.1 Медленное замораживание. 39
1.4.2 Витрификация 44
1.4.3 Другие методы криосохранения 46
1.5 Методические особенности криосохранения
1.5.1 Предварительная подготовка культуры
1.5.2 Рекультивирование и регенерация 53
1.6 Влияние криосохранения семян и культур in vitro на последующее развитие растений 56
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Объект исследований 62
2.2 Криосохранепие семян 62
2.3 Получение ювенильныхрастений. 62
2.4 Получение культуры почкующихся протокормое 64
2.5 Глубокое замораживание протокормое 65
2.6 Оценка повреждений протокормое при замораживании-оттаивании . 67
2.7 Изучение влияния глубокого замораживания на развитие семян, протокормое и ювенильных растений 69
Глава 3. Результаты
3.1 Криосохранепие семян 70
3.2 Получение ювенильных растений. 70
3.3 Получение культуры почкующихся протокормое 71
3.4 Глубокое замораживание протокормое 75
3.4.1 Медленное замораживание 76
3.4.2 Витрификация 76
3.5 Оценка повреждений протокормое при замораживании-оттаивании. 83
3.5.1 Окрашивание 83
3.5.2 Исследование фотосинтетической активности 85
3.6 Влияние глубокого замораживания на развитие семян, протокормое и ювенильных растений 93
Глава 4. Обсуждение 98
Выводы 116
Заключение 118
Благодарности 119
Список литературы 120
- Криосохранение изолированных клеток и органов, культивируемых vitro
- Роль плазматической мембраны в повреждении клеток при криосохранении
- Оценка повреждений протокормое при замораживании-оттаивании
- Влияние глубокого замораживания на развитие семян, протокормое и ювенильных растений
Криосохранение изолированных клеток и органов, культивируемых vitro
Культуры in vitro могут быть высокоэффективным способом сохранения генофонда тех растений, у которых трудно получить способные к прорастанию семена, а также растений, размножение которых происходит в основном вегетативно. В этих случаях сохранение может осуществляться с помощью культивирования in vitro (в стандартных условиях или в условиях депонирования) изолированных почек, меристем, эмбрионов, суспензий клеток и целых растений [Высоцкая 1994; Бутенко 1999; Engelmann 2000; Gonzalez-Benito et al 2002]. Такие культуры не только используются в роли дополнительного инструмента для сохранения выбранных генотипов, но часто сами становятся объектом, требующим сохранения в качестве модели для научных исследований и/или продуцента ценных биологически активных веществ [Носов 1999; Reinhoud et al 2000а].
Однако поддержание коллекций in vitro, особенно в течение длительного времени, таит в себе серьезную опасность, связанную как: 1. с возможностью инфицирования, которая влечет за собой необходимость применения антибиотиков и других препаратов [Reed et al 1988; Tanprasert, Reed 1997] 2. с потерей клетками морфогенетического потенциала, т. е. способности формировать целые растения и 3. с явлением, получившим общее название «сомаклоналыюй изменчивости», т. е. вариабельности индивидуальных растений в рамках одного клона [Долгих 2005]. Последнее проявляется как в морфологических изменениях регенерированных растений, так и в изменении их свойств, например, устойчивости к определенным заболеваниям или иным воздействиям. Причинами сомаклональной изменчивости могут быть изменение числа хромосом, хромосомные аберрации, метилирование ДНК, изменение уровня экспрессии генов и синтеза метаболитов. При этом изменения тем больше, чем больше длительность культивирования [Бутенко 1999, с. 37; Долгих 2005]. Разработанный и успешно применяемый для многих культур метод депонирования in vitro [Высоцкая 1994; Negash et al 2001] позволяет существенно снизить частоту возникновения и проявления этих нежелательных эффектов, но все же не гарантирует длительной сохранности и стабильности генома. Таким образом, криосохранение - это, по-видимому, единственный реально возможный надежный метод длительного сохранения растительного материала, культивируемого in vitro [Engelmann 2000].
Первые работы по замораживанию культивируемых in vitro тканей и клеток растений были проведены в 60-х гг Тумановым и Бутенко на тканях плодовых деревьев [цит. по Бутенко, Попов 1979] и клеточных культурах льна [Quatrano 1968]. В этих работах, однако, замораживание проводили до температуры не ниже -50С, но уже использовали криопротекторы и закаливание тканей. Последовавшее затем замораживание закаленных к холоду каллусных тканей тополя до температуры жидкого азота позволило развить новое направление [Sakai, Sugawara 1973].
За прошедшие 30 лет были разработаны и применены для создания банков суспензий клеток, каллусных тканей, зиготических и соматических эмбрионов, почек, выделенных из растений in vivo и in vitro различные методы криосохранения, а также значительно расширены представления о механизмах повреждений замораживаемых клеток и их возможной защиты. Эти достижения освещены в ряде обзоров, сборников и научных трудов, представляющих собой живую историю развития криобиологических исследований растений [Lyons 1973; Самыгин 1974, 1994; Kartha 1985; Попов 1981, 1993; Li, Sakai 1978; Mazur 1984; Вепринцев, Ротт 1991; Benson et al 1998; Тихонова 1985, 1991, 1999; Engelmann 2004; Reed 2001; Fuller 2004; Harding 2004].
В настоящее время созданы и широко развиваются криобанки редких и исчезающих дикорастущих видов [Тихонова 1985, 1992; Decruse et al 1999; Wilkinson et al 2003; Hirano et al 2005], ценных природных древесных растений [Gonzalez-Benito et al 2002; Harvengt et al 2004; Panis, Lambardi 2005], сельскохозяйственных культур [Mix-Wagner et al 2002; Lambardi et al 2002; Baek et al 2003; Agrawal et al 2004] и декоративных растений [Hitmi et al 1999; Homung et al 2001; Teixeira 2003]. Научные исследования по криосохранению различных типов растительных объектов и разработка соответствующих методик ведутся в США [Reed 2001; Towill, Wildrlechner 2004], Великобритании [Dumet et al 2000; Fuller 2004], Испании [Gonzalez-Benito et al 2002; Clavero-Ramarez et al 2005], Германии [Mix-Wagner et al 2002; Schoenweiss et al 2005], Италии [Engelmann 2004; Lambardi et al 2005], Японии [Sakai et al 1990; Kamata, Uemura 2004], Китае [Bachiri et al 2001] и во многих других странах [Norman 2000; Thinh, Takagi 2000; Garliardi et al 2003].
Работа по криосохранению орхидей была начата Pritchard с соавт. на семенах [Pritchard 1984; Pritchard, Seaton 1993; Pritchard et al 1999]. В этих исследованиях была показана не только принципиальная возможность криосохранения зрелых семян орхидей (в основном умеренного климата), но и преимущество глубокого замораживания по сравнению с другими режимами хранения. На преимущество глубокого замораживания для сохранения семян орхидных указывали и другие авторы [Koopowitz, Thornhill 1994]. Следующим шагом стало криосохранение зрелых семян орхидей средней полосы в альгинатных капсулах вместе с гифами грибов-симбионтов методом инкапсуляции-дегидратации. Хранение в жидком азоте в течение 30 суток практически не повлияло на выживаемость гиф и семян, которая резко снижалась до 45 и даже 5% после выдерживания капсул в течение суток при -70 и - 20С соответственно [Wood et al 2000]. Показана эффективность глубокого замораживания для сохранения семян исследованных генотипов тропических орхидных [Никишина и др. 2001; Попова и др. 2003]. Криосохранение незрелых семян орхидей и семян, имеющих сравнительно большую влажность, стало возможным благодаря применению специальных методик. Использование метода витрификации позволило получить до 63% выживаемости после глубокого замораживания семян тайской орхидеи Doritis pulcherrima, имеющих 31% влажности [Thammasiri 2000]. Витрификацию применили также Ishikawa с соавт. для криосохранения зиготических эмбрионов японской орхидеи Bletilla striata. Регенерация растений из криосохрапенных эмбрионов составила около 60% [Ishikawa et al 1997]. Есть данные об успешном криосохранении методом витрификации апексов орхидей рода Cymbidium (86.6% выживаемости) [Thinh, Takagi 2000] и суспензии клеток Doritaenopsis [Tsukazaki et al 2000], а также о криосохранении методом высушивания выделенных из протокормов и размноженных in vitro апексов Vanda pumila [Na, Kondo 1996].
Роль плазматической мембраны в повреждении клеток при криосохранении
Современные методики криосохранения позволяют добиться замораживания и оттаивания клеток без образования льда как внутри, так и вне их [Sakai 2000; Engelmann 2004]. С этой целью из клеток с помощью различных обработок удаляется свободная вода [Engelmann 2000]. Часто такой обработкой является предварительное культивирование на средах с повышенным содержанием осмотически активных веществ (сахаров, сахарных спиртов и др.), высушивание, выдерживание в высококонцентрированных растворах криопротекторов непосредственно перед замораживанием [Sakai 2000; Reinhoud et al 2000a] и т.п. Гибель клеток при таких способах замораживания может быть обусловлена дегидратацией и плазмолизом, происходящих на этапах подготовки, а также токсическим действием высоких концентраций криопротекторов. При этом, поскольку удается избежать образования как внутриклеточного, так и внеклеточного льда, на первое место выходят вторичные повреждения [Самыгин 1994].
В литературе имеются несколько мнений по поводу того, что полагать первичными и вторичными повреждениями клеток при замораживании-оттаивании. К первичным повреждениям большинство авторов относят повреждения плазмалеммы [Попов, Федоровский 1992; Попов 1993; Самыгин 1994]. Вторичные повреждения часто развиваются как следствие первичных, однако могут быть намного более растянуты во времени. К вторичным повреждениям относят инактивацию АТФ-аз, изменение липидного и белкового состава мембран, изменения цитоскелета [Попов 1993; Самыгин 1994]. Длительным действием во времени обладают и другие деструктивные процессы, такие как образование АФК и ПОЛ [Reinhoud et al 2000а; Benson 2003]. Такие повреждения могут развиваться постепенно и проявляться не сразу, а спустя некоторое время после оттаивания, приводя к гибели клеток в том случае, если с ними не справляются процессы репарации [Самыгин 1994].
Низкие температуры сами по себе могут оказывать деструктивное влияние на клетки. К элементам такого влияния можно отнести фазовые переходы липидов мембран из жидкокристаллического в гелевое состояние (переход La - Lp), увеличение вязкости цитоплазмы, снижение скорости биохимических реакций, инактивацию ферментов и другие изменения. По мнению Туманова, в большинстве случаев такие изменения обратимы и не вызывают гибели клеток, основной причиной которой является действие внутриклеточного либо внеклеточного льда [Туманов 1979]. Однако, действуя синергетически с обезвоживанием, низкие температуры могут усиливать его повреждающие эффекты [Самыгин 1994].
Исследования последних лет заставляют обратить большее внимание на повреждения клеток, происходящие в процессе криосохранения, но проявляющиеся позднее при их рекультивировании, которые Самыгин называл «вторичными» [Самыгин 1994]. Одним из таких повреждающих факторов является неконтролируемое образование активных форм кислорода (АФК) и органических гидропероксидов, т.е. окислительный стресс. Окислительный стресс возникает в растениях в результате воздействия неблагоприятных факторов различной природы, таких как засуха, засоление, действие тяжелых металлов, пониженных или повышенных температур и т.п., являясь, таким образом, неотъемлемым компонентом многих других стрессов [Лукаткин 2002; Балнокин 2005]. Существует мнение, что развитие окислительного стресса является начальным звеном повреждений клеток растений при охлаждении [Лукаткин 2005].
АФК могут индуцировать в остатках полиненасыщенных жирных кислот цепные реакции с образованием липидных радикалов, т.е. перекисное окисление липидов (ПОЛ), вызывая повреждения плазмалеммы и мембран органелл [Dumet, Benson 2000; Балнокин 2005]. Кроме того, вторичные продукты ПОЛ, такие как малоновый диальдегид, высокотоксичны и обладают мутагенными свойствами [Benson et al 1992; Dumet, Benson 2000]. Еще одним результатом действия АФК является перекисное окисление нуклеотидов, что приводит к разрывам цепей ДНК и повреждениям хромосом, а также окисление аминокислот белков, следствием которого является нарушение третичной структуры, денатурация и, в конечном итоге, потеря биологической активности [Fleck et al 2003; Балнокин 2005].
В настоящее время представлены очевидные доказательства того, что охлаждение, дегидратация и осмотический стресс, сопровождающие процесс криосохранения приводят к развитию окислительного стресса в сохраняемых тканях [Benson 1990, цит. по Dumet, Benson 2000; Benson et al 1992; Benson 2003]. Так, охлаждение усиливает генерацию АФК и увеличивает общее число перекисей в тканях теплолюбивых растений [Лукаткин 2002]. Величина низкотемпературного усиления перекисного окисление липидов (ПОЛ) коррелирует с чувствительностью видов и сортов к охлаждению [Лукаткин 2002], а в клетках, подвергшихся криосохранению, обнаружено повышенное содержание АФК [Benson et al 1992]. Известно, что даже при сверхнизкой температуре (например, при температуре жидкого азота, -196С) могут происходить реакции с участием свободных радикалов [Benson 1990, цит. по Wilkinson et al 2003; Benson 2003]. Эти реакции тем более опасны, что при низких температурах ферментная антиоксидантная система клеток не может справиться с возрастающим уровнем АФК [Лукаткин 2002], а сразу после оттаивания не имеет возможности полностью восстановить свои защитные функции из-за многочисленных повреждений, полученных в ходе криосохранения. Основной мишенью для свободных радикалов при развитии окислительного стресса становятся биологические мембраны и макромолекулы, что препятствует процессам восстановления после криосохранения и приводит к ингибированию деления клеток. В настоящее время окислительный стресс признан одним из важнейших факторов, вызывающих и усиливающих повреждения клеток при криосохранении [Dumet, Benson 2000; Benson 2003; Fleck et al 2003].
На ведущую роль повреждений биологических мембран при замораживании клеток растений указывали Steponkus с соавт. В опытах на изолированных протопластах шпината и ржи они показали, что при осмотическом сжатии незакаленных протопластов плазмалемма теряет липидный материал, который образует эндоцитозные везикулы внутри клетки. При оттаивании и обратном втягивании воды такие везикулы не встраиваются или частично встраиваются в плазмалемму, которая в итоге не может восстановить свой первоначальный размер, что является основной причиной гибели незакаленных протопластов. В то же время при сжатии закаленных протоплатов «лишний» липидный материал оказывается с наружной стороны плазмалеммы и полностью встраивается в нее при последующем набухании [Wiest, Steponkus 1978; Steponkus 1984; Самыгин 1994; Uemura, Steponkus 1999]. Похожие явления наблюдал Wilkinson при криосохранении апексов Cosmos [Wilkinson et al 2003]. Попов и Федоровский, оценивая деструктивные повреждения плазмалеммы клеток диоскореи и женьшеня при медленном замораживании или осмотическом сжатии при 2С, показали, что они происходят как при плазмолизе, так и при деплазмолизе и являются одной из основных причин гибели клеток [Попов, Федоровский 1992; Федоровский и др. 1993; Попов 1998].
Оценка повреждений протокормое при замораживании-оттаивании
В составе криозащитного раствора для медленного замораживания чаще всего используются стандартные криопротекторы, такие как ДМСО, глицерин и сахароза. Например, Kartha с соавт. применяли для криосохранения апексов земляники 5%-ный раствор ДМСО [Karhta et al 1980]. Раствор, содержавший 6% сахарозы + 7-10% ДМСО применяли при криосохранении апексов малины [Высоцкая и др. 1998]. Похожий раствор (10% ДМСО + 10% сахарозы) использовали Стрибуль с соавт. для апексов винограда [Стрибуль и др. 2000]. Для сохранения меристем картофеля разные авторы использовали как растворы ДМСО, так и его сочетание с глицерином и сахарозой, при этом эффективность выбранного криопротектора зависела как от вида (сорта), так и от программы замораживания [обзор данных в работе Манжулина, 1986]. Fukai при криосохранении апексов хризантем заменял сахарозу на глюкозу более низких концентраций, однако использовал сахарозу в среде для предварительного культивирования. Такой подход позволял получить до 87% выживших апексов после хранения в ЖА [Fukai 1990]. Преимущество глюкозы перед сахарозой на всех этапах криосохранения, включая действие криозащитного раствора, было показано для апексов земляники [Высоцкая и др. 1999]. Более сложный раствор криопротекторов, включавший по 10% ПЭГ, глюкозы и ДМСО, успешно использовали Reed с соавт. для апексов Rubus [Reed, Lagersted. 1987], а позднее - для апексов травянистых растений Zoysia и Шит [Chang et al 2000].
Для криоеохранения суспензий клеток использовали сходные по составу криозащитиые растворы, включающие также глицерин. Например, раствор, содержащий по 10% сахарозы и глицерина, применяли для клеток женьшеня [Федоровский и дР. 1993], а сочетание сахароза + глицерин + ДМСО (10, 5 и 10% соответственно) для клеток Bromus [Ishikawa et al 1996]. Растворы со сходными концентрациями криопротекторов применяли и для суспензий других видов растешш [Волкова и др. 1982; Попов и др. 1982, 1986, .991; Dietrich е« al 1982; Butenko et а. 1984] При криосохранении клеток Panax и Polysclas 20%-ный раствор сахарозы не оказывал защитного эффекта; более эффективным оказался раствор 15%-ного глицерина либо смеси его с сахарозой [Кривохарченко и др. 1999]. Для суспензии клеток левзей было испробовано 48 криозащитньгх растворов, наилучшим из которых оказался раствор, включавший 2% ДМСО + 5% трегалозы + 4% глицерина [Баскакова и др. 2003].
В некоторых случаях в состав криозащитньгх растворов для медленного замораживания вводили и другие, менее распространенные вещества, например, пролий [Withers, King 1979; Moukadiri et al 2002].
Есть примеры замораживания с низкими скоростями в сочетании с криозащнтными растворами высоких концентраций, таких как PVS2. Для апексов frunus domesnea результаты, полученные в таких опытах, оказались заметно хуже, чем после криоеохранения методом витрификации [De Carlo е. а. 2000], а для апексов другого генотипа рода Рпт - Ferienain - метод оказался вполне успешным и позволял получить до 50-60% выживаемости, причем даже при использовании сравнительно высокой скорости охлаждения, 5С/мин [Helliot, De Boucaud 1997].
Способ добавления криопротекторов к сохраняемым объектам также оставался камнем преткновения для исследователей. Долгое время использовали постепенное добавление криопротекторов на льду в течение 30-40 мин для апексов [Kartha et al 1980; Reed, Lagerstedt 1987] и суспензий клеток [Федоровский, Попов 1992] а также при замораживании каллусов [Moukadiri et al 2002]. Позднее Кривохарченко с соавт. показали, что способ добавления криопротектора постепенное при 0С, либо одномоментное при 25С - не оказывал достоверного влияния на выживаемость клеток женьшеня [Кривохарченко и др. 1999], однако при криосохранении клеток других видов растений способ постепенного добавления криозащитного раствора позволяет получить хорошую выживаемость, как это было, например, для клеток левзей сафлоровидной и василистника (60-70% выживаемости) [Баскакова и др. 2003].
Скорость охлаждения имеет ключевое значение при криосохранении. Например, при криосохранении черенков ивы наилучшие результаты были получены при использовании минимальной из исследованных скоростей охлаждения, 0.21С/мин [Towill, Wildrlechner 2004]. В опытах Стрибуль с соавт. на апексах винограда использование низких скоростей (0.5-1С/мин) на начальном этапе замораживания давало лучшие результаты, чем высоких (3-5С/мин) [Стрибуль и др. 2000]. В опытах Kartha на апексах земляники медленное охлаждение с минимальной исследованной скоростью 0.84С/мин давало лучшие результаты, чем быстрое замораживание в ЖА [Karhta et al 1980]. Высоцкая с соавт. получали до 47% регенерации апексов малины при медленном охлаждении со скоростью 0.3-0.5С/мин до -45С и последующем более быстром охлаждении со скоростью 10С/мин до -75 С, однако быстрое охлаждение в парах ЖА позволяло получить еще большую регенерацию - до 70% [Высоцкая и др. 1998]. Еще меньшие скорости охлаждения успешно использовали другие авторы: 0.2С/мин для апексов хризантем [Fukai 1990], 0.1/мин для апексов травянистых растений [Chang et al 2000].
Низкие скорости охлаждения 0.3-0.5С/мин использовали и для сохранения суспензий клеток [Волкова и др. 1982; Попов и др. 1986; Федоровский и др. 1993; Butenko et al 1984; Ishikawa et al 1996; Jitsuyama et al 2002; Баскакова и др. 2003]. Однако хорошие результаты могли быть получены и при охлаждении с большими скоростями, 1-2С/мин [Попов и др. 1978; Kim et al 2001; Moukadiri et al 2002].
Температура, до которой ведется замораживание с низкой скоростью, также является фактором, существенным для выживаемости после криосохранения. Так, в опытах Towill с соавт. по криосохранению черенков ивы наилучшие результаты были получены, если медленное охлаждение велось до -30 —35С. Использование более высокой, как и более низкой критической температуры существенно снижало число ростков и корней, сформированных в ходе регенерации [Towill, Wildrlechner 2004]. В опытах Fukai все апексы хризантем погибали, если медленное охлаждение вели до температуры -10 —20С, тогда как снижение конечной температуры замораживания до -25 —40С позволило получить до 87% выживаемости после хранения в ЖА [Fukai 1990]. Более низкую конечную температуру -40С использовали Kartha с соавт. для апексов земляники [Karhta et al 1980], Reed с соавт. для апексов Rubus, Zoysia и Lolium [Reed, Lagerstedt 1987; Chang et al 2000] и Helliot с соавт. для апексов Prunus [Helliot, De Boucaud 1997]. Высоцкая с соавт. вели медленное охлаждение до -45С [Высоцкая и др. 1998]. Успешное криосохранение суспензий проводили при медленном охлаждении до температуры -30 —40С [Ishikawa et al 1996; Kim et al 2001; Баскакова и др. 2003].
Искусственную инициацию кристаллизации при замораживании с низкими скоростями применяли многие авторы как для апексов [Diettrich et al 1987; Fukai 1990; Chang et al 2000], так и для суспензий клеток [Butenko et al 1984; Попов, Федоровский 1992; Федоровский и др. 1993; Ishikawa et al 1996; Jitsuyama et al 2002; Баскакова и др. 2003]. При этом инициация может осуществляться как внесением в замораживаемый раствор кристалла льда [Jitsuyama et al 2002], так и путем касания контейнера концами пинцета, предварительно выдержанного в ЖА [Кривохарченко и др. 1999], либо кратковременным касанием ЖА донышком ампулы [Diettrich et al 1987; Федоровский и др. 1993]. В группе криосохранения ИФР РАН инициация кристаллизации осуществляется с помощью разработанного для этой цели специального устройства, встроенного в программный замораживатель [Попов и др. 1987].
Влияние глубокого замораживания на развитие семян, протокормое и ювенильных растений
Влажность протокормов Bratonia, культивируемых in vitro, составила 88.5 ± 0.9 %. Это свидетельствовало о том, что клетки протокормов содержат большое количество свободной воды, которая может кристаллизоваться при замораживании-оттаивании. Криосохранепие таких объектов требует разработки многоэтапной методики, включающей предварительное культивирование, обработку растворами крнопротекторов, глубокое замораживание, оттаивание, рекультивирование и регенерацию [Попов 1993; Sakai 2000].
Исходя из имеющихся литературных данных [Dubus 1980; Wang ct al 1998] и опыта предыдущей работы, для криосохранения протокормов Bratonia были выбраны два метода - медленное замораживание, где охлаждение ведется с низкими скоростями, а обезвоживание объектов достигается в результате медленного роста внеклеточного льда, и метод витрификации, где замораживание производится с высокой скоростью, а обезвоживание достигается предварительно за счет выдерживания объектов в растворах крнопротекторов высоких концентраций (Табл. 1). Ключевые моменты медленного замораживания, такие как скорость замораживания на разных этапах, необходимость инициации кристаллизации и температура, до которой ведется программное замораживание до поіружения в жидкий азот, были в достаточной степени разработаны в ряде исследований, проведенных ранее в нашей группе [Волкова и др. 1982; Попов и др. 1982, 1986, 1991; Diettrich et al 1987; Попов, Федоровский 1992; Федоровский и др. 1993; Высоцкая и др. 1999; Баскакова и др. 2003] и поэтому, но нашему мнению, не требовали дополнительного исследования. В то же время нитрификация являлась для нас сравнительно новым методом применение которого требовало дополнительных исследований.
Обработка раствором ГСД в течение 2 ч при комнатной температуре, затем 40 мин при 7-8С не оказывала влияния на выживаемость протокормов Bratonia, которая составила 100% (Табл. 5), однако после глубокого замораживания не было получено ни одного выжившего протокорма. Возможно, степень обезвоживания при медленном замораживании была недостаточной для сильно оводпенных протокормов Bratonia. Однако наиболее вероятная причина неудачи может состоять в том, что обезвоживание в методе медленного замораживания происходит в течение длительного времени (более часа) при отрицательных температурах, что, как показали наши дальнейшие исследования, могло повысить чувствительность протокормов Bratonia к криопротекторам. Более перспективным мог оказаться метод витрификации, с успехом применяющийся для культур изолированных эксплантов многих тропических растений [Sakai et al 1990; Niino et al 2000; Agrawal et al 2004].
Из литературы известно, что наибольшее значение для успешного криосохранения методом витрификации имеют свойства объекта (его размеры, физиологическое состояние), а также условия обработки раствором криопротекторов [Reinhoud et al 2000а]. Оптимальные значения этих параметров зависят от генетически предопределенных особенностей объектов, от свойств, приобретенных ими в культуре in vitro, и некоторых других факторов, что заставляет экспериментально подбирать их для каждого нового объекга. Эго было справедливо и для протокормов Bratonia.
Было показано, что размеры объектов являются существенным фактором, определяющим их выживаемость после обработок крионротекторами и глубокого замораживания. Так, в опытах Back с соавт. по замораживанию апексов чеснока размером от 1.5 до 4.5 мм методом витрификации наилучшие результаты были получены для апексов среднего размера - около 3 мм [Back et al 2003]. При криосохранении орхидеи Cymbidium апексы среднего размера, с частично покрытым меристематическим куполом, лучше выживали после криосохранения методом витрификации, чем мелкие меристемы с полностью обнаженным куполом или большие с куполом, полностью закрытым примордиями [Thinh, Takagi 2000]. В нашей работе размер протокормов оказывал существенное влияние на их выживаемость после обработки PVS2: «большие» протокормы диаметром 1-1.5 мм оказались более устойчивы к воздействию витрификационного раствора, чем протокормы меньшего диаметра, которые полностью погибали уже через 40 мин обработки при комнатной температуре (Табл. 6). Такие результаты могут объясняться тем, что объекты большого размера часто имеют большую влажность, т.е. содержат значительное количество свободной воды. В то же время слишком мелкие объекты часто хуже выживают и регенерируют в условиях in vitro, как это имело место в случае контрольных протокормов размером до 1 мм, не подвергавшихся воздействиям (Табл. 6, столбец «без воздействий»). Учитывая, что регенерация после воздействия PVS2 чаще всего происходила путем образования новых протокормов на фоне постепенной гибели старых, можно предположить, что в результате воздействия раствора не- или малоповрежденными оказываются группы клеток (скорее всего меристематических), которые и дают начало новому протокорму. Важное значение в таком случае должен иметь размер группы выживших клеток, который в мелких протокормах по определению меньше, чем в более крупных. То есть, можно сказать, что мелким протокормам просто «не хватает сил» для регенерации.
Продолжительность культивирования протокормов после отделения от материнского конгломерата также имела большое значение для их выживаемости после обработки витрификационным раствором без замораживания (Табл. 7). Наибольшая выживаемость, близкая к выживаемости в контроле, была получена при культивировании отделенных протокормов в течение 15 суток. Это можно, по-видимому, объяснить тем, что микрохирургическое отделение протокормов от конгломератов в большинстве случае приводит к их частичному поранению и является, таким образом, стрессовым воздействием. Последствия такого стресса нивелируются в ходе последующего культивирования отделенных протокормов. Еще одним объяснением может стать кондиционирование среды, которое происходит в ходе культивирования отделенных протокормов. Можно предположить и совместное действие этих двух факторов.
Ключевым этапом процедуры витрификации является выдерживание в растворах криопротекторов чрезвычайно высоких концентраций, что обеспечивает удаление из объектов свободной воды, способной кристаллизоваться при замораживании-оттаивании [Engelmann 2000; Sakai 2000J. В данной работе мы использовали два криозащитных раствора. Нагружающий раствор (LS), содержащий 18.4% глицерина и 13.68% сахарозы в воде, применяли для предварительной обработки протокормов перед выдерживанием в более концентрированном витрификационном растворе PVS2 (30% глицерина, 15% ПЭГ6оо(ь 15% ДМСО и 14% сахарозы в воде).