Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. ССМ цианобактерий и микроводорослей 8
1.1.1. История открытия ССМ 8
1.1.2. Происхождение и эволюция ССМ 10
1.1.3. Общая схема действия ССМ 16
1.1.4. Организация ССМ цианобактерий 19
1.1.4.1. Транспорт неорганического углерода 19
1.1.4.2. Энергетические эквиваленты 26
1.1.4.3. Роль карбоксисом в функционировании ССМ 27
1.1.5. Организация ССМ зеленых микроводорослей 30
1.1.5.1. Транспорт неорганического углерода 31
1.1.5.2. Энергетические эквиваленты 33
1.1.5.3. Роль пиреноидов в функционировании ССМ 33
1.1.6. Cj-стресс и С02-концентрирующий механизм 36
1.1.6.1. Индукция СОг-концснтрирующего механизма 36
1.1.6.2. Адаптация клеток цианобактерий и микроводорослей к Ct-стрессу 38
1.1.7. ССМ и условия окружающей среды 44
1.2. Структура, функции и биологическая роль карбоангидраз 49
1.2.1. Распространение карбоангидраз в живых организмах 49
1.2.2. Функции и биологическая роль карбоангидраз 50
1.2.2.1. Каталитический механизм работы карбоангидраз 53
1.2.3. Общая характеристика классов карбоангидраз, их распространение и филогенез 55
1.2.3.1. Карбоангидразы цианобактерий 66
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования 71
2.1. Объект исследования 71
2.2. Условия культивирования R. lineare и определение параметров роста культуры 73
2.3. Выделение клеточных фракций R. lineare 74
2.4. Измерение активности карбоангидразы 75
2.5. Определение содержания белка и хлорофилла 76
2.6. Электрофорез и иммунодетекция 76
2.7. Световая, флуоресцентная и иммуноэлектронная микроскопия 77
2.8. Определение цитоплазматического рН с помощью ЛР-ЯМР спектроскопии 78
2.9. Измерение внутриклеточного пула неорганического углерода 78
2.10. Биоинформатика 79
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 80
3.1. Влияние условий окружающей среды на рост R. lineare 80
3.1.1. Влияние концентраций бикарбоната на рост R. lineare 80
3.1.2. ВлияниерН на рост, lineare 82
3.2. Поиски активности карбоані идразы в различных фракциях клеток R. lineare и ингибиторный анализ фермента 85
3.3. Идентификация классов КА в клетках R. lineare 90
3.4. Локализация КА а- и [3-классов в клетках R. lineare 95
3.4.1. Исследование локализации КА а-класса 95
3.4.2. Исследование локализации КА Р-класса 98
3.5. Динамика изменений пулов неорганического углерода и системы карбоангидраз у R. lineare в зависимости от параметров окружающей среды 102
3.5.1. Влияние бикарбоната на концентрацию неорганического углерода и активность карбоангидраз в клетках R. lineare 103
3.5.2. Влияние рН на концентрацию неорганического углерода и активность карбоангидраз в клетках R. lineare 106
3.5.3. Динамика изменений системы карбоангидраз R. lineare в зависимости от параметров окружающей среды 110
Заключение 116
Выводы 122
Приложения 123
- Роль карбоксисом в функционировании ССМ
- Общая характеристика классов карбоангидраз, их распространение и филогенез
- Поиски активности карбоані идразы в различных фракциях клеток R. lineare и ингибиторный анализ фермента
- Влияние бикарбоната на концентрацию неорганического углерода и активность карбоангидраз в клетках R. lineare
Введение к работе
На протяжении 3.5 миллиардов лет - со времени возникновения фотосинтеза в верхнем Докембрии - концентрация С02 в атмосфере Земли постепенно снижалась. Недостаток этого газа в современную эпоху стал одним из основных факторов, лимитирующих скорость фотосинтеза. Преодолеть эту проблему можно было двумя путями:
увеличить количество и активность ключевого фермента фиксации С02 -рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы/оксигепазы (РБФК/О). По этому пути пошли растения Сз-тина;
увеличить внутриклеточную концентрацию С02 - то есть, создать С02-концентрирующий механизм.
К настоящему моменту достаточно подробно изучены механизмы концентрирования ССь, функционирующие у растений с С4- и САМ-типами фотосинтетического метаболизма углерода.
Долгое время считалось, что способность разобщать процессы концентрирования и фиксации С02 определяет преимущество С4-растсний в продуктивности и является их отличительным свойством от Сз-растениий (Пронина, 2000). Но в начале 80-х годов у водных фотосинтезирующих организмов, которые фиксируют С02 по С3-типу метаболизма углерода (а именно, у микроводорослей и цианобактерий), был обнаружен третий тип концентрирования С02, известный сейчас под аббревиатурой ССМ (от англ. - «carbon concentration mechanisms») (Семенснко, 1985; Aizawa & Miyachi, 1986; Badger, 1987; Пронина и Семененко, 1991).
Наличие ССМ у фотосинтезирующих прокариот и низших растений ломает устоявшиеся представления об отличительных особенностях С4- и Сз-растениЙ и показывает, что первичные процессы поглощения С02, внутриклеточного транспорта и преобразования соединений неорганического углерода (С,-) являются важным регуляторньтм звеном жизнедеятельности фотосинтезирующей клетки (Пронина, 2000).
Данный механизм за счет слаженной работы карбоангидраз и системы переносчиков соединений неорганического углерода (Q) создаст в районе активного сайта РБФК/О концентрацию С02, в 1000 раз превышающую таковую в среде, окружающей клетку (Badger & Price, 2003); обеспечивает способность клеток эффективно осуществлять фотосингез как при низких, так и при экстремально высоких (до 100%) концентрациях С02 (Sasaki et ah, 1999).
ССМ играет важную роль не только на организменном, но и на биосферном уровнях. Данный механизм оказался более эффективным, чем САМ- и даже С4-пути метаболизма. В настоящее время микроводоросли и цианобактерии составляют важное звено биосферы, на долго которого приходится около половины всей фотосинтстически образованной биомассы Земли (Пронина, 2000).
Исследование ССМ имеет и важное практическое значение. Можно надеяться, что знание тонкостей регуляции этого механизма позволит добиться значительных успехов в получении биомассы водорослей и цианобактерии для пищевой, химической и фармацевтической промышленности. Персі гективным подходом для снижения уровня фотодыхания, а, следовательно, и для повышения эффективности фотосинтеза может стать генно-инженерное внедрение элементов ССМ в клетки высших растений.
ССМ - сложный процесс с множеством участников. Особое место в функционировании ССМ занимает цинке од ержащий мсталлофермент карбоапгидраза (КА). Этот фермент участвует во всех стадиях ССМ (поглощение Q, предотвращение утечки Q из клетки, внутриклеточное преобразование форм СО- Он представлен несколькими классами (а, р, у), не имеющими гомологии между собой, но выполняющими одну функцию - взаимопревращение СОг и НС03" (Badger & Price, 2003).
Крайне перспективным объектом для изучения автотрофной ассимиляции С, и, в частности, участия в этом процессе КА являются алкалофильные цианобактерии содовых озер (Куприянова с соавт., 2003). С эволюционной точки зрения они примечательны тем, что, вероятно, являются реликтами древней наземной микробиоты, сохранившейся в экстремальных условиях содовых озер (Заварзин, 1993). Таким образом, исследование организации КА системы у этих организмов представляет интерес для понимания эволюции ССМ и эволюционных
взаимодействий отдельных классов КА. Помимо этого, способносгь расти при сильнощелочных значениях рН, а значні, в присутствии исключительно карбонатных и бикарбонатных форм неорганического углерода (Дубинин с соавт.. 1995) позволяет более определенно говорить о поглощаемой клетками форме С, и о роли КА в этом процессе.
Целью настоящей работы являлось исследование особенностей организации системы КА у реликтовой гало- и алкшюфильной циапобактерии Rhabdoderma lineare, а также изучение функциональной роли фермента в концентрировании Сі.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Исследовать распределение активности КЛ в различных фракциях клеток R. lineare.
Идентифицировать классы, к которым принадлежа!' КА данного организма.
Определить локализацию КА в клетках R. lineare.
Охаракгеризовать способность R. lineare концентрировать Cj и выяснить условия индукции ССМ.
Исследовать роль КА в функционировании ССМ.
Роль карбоксисом в функционировании ССМ
Мультифсрментные комплексы НАД(Ф)Н-дегидрогеназы (англ. NAD(P)H dehydrogenase, NDH) действуют в донорном (низкопотенциальном) участке дыхательной электронтранспортной цепи, катализируя перенос электронов от НАД(Ф)Н к окисленному хинону. В зависимости от наличия в их составе сопрягающего сайта, осуществляющего перенос Н через мембрану, все НАД(Ф)Н-дегидрогеназы подразделяются па две группы. Ферменты, имеющие сопрягающий сайг, обозначаются как НАД(Ф)Н-дегидрогсназы 1, а не имеющие его - как НАД(Ф)Н-дегидрогеназы 2 (Пиневич и Аверина, 2002).
Анализ полной геномной базы Synechocystis РСС6803 показал, что гены НЛД(Ф)Н-дсгидрогеназиого комплекса 1 могут быть представлены как единичными (ndhAIGE, ndhB, ndhCJK, ndhH, ndhL), так и множественными копиями (например, обнаружено по крайней мере шесть гомологов ndhD и три гомолога ndhF) (Badger & Price, 2003). Именно эволюционные изменения последних и привели к образованию нескольких типов НАД(Ф)Н-дегидрогеназ 1, играющих различные функциональные роли, в том числе, и участвующих в поглощении С02 (Price et al., 1998; Ohkawa et al., 2001) (рис. 7).
В С02-поглощающих НАД(Ф)Н-дегидрогеназных комплексах 1 полипептиды NdhDl/D2 совместно с NdhFl, вероятно, вовлечены в окисление НАДФ-Н и НАД-Н и восстановление пластохинонов. При этом они принимают участие в циклическом транспорте электронов вокруг ФС I (Ohkawa et al., 2001). NdhD3/D4 вместе с NdhF3 и NdhF4 предположительно образуют часть переносящего протоны канала (Ohkawa et al., 2001; Shibata et al., 2001; Maeda et al., 2002). Точная роль NdhD5/D6 белков до сих пор неизвестна. Кроме того, для этого типа НАД(Ф)Н-дегидрогеназных комплексов 1 характерны уникальные гены chpXu chpY (в работах Shibata и Ohkawa эти гены обозначаются как сирА и сирВ), которые вовлечены в инициацию С02-поглощающей активности (Shibata et al., 2001, 2002; Maeda et al., 2002; Price et al., 2002).
Недавние исследования (Shibata et al., 2001; Maeda et al., 2002) ясно показали, что гены ndhF3/ndhD3/chpY кодируют полипептиды, которые являются частью высокоаффинного комплекса НАД(Ф)Н-дегидрогеназ 13, поглощающего С02, тогда как гены ndhF4/ndhD4/chpX кодируют комплекс НАД(Ф)Н-дегидрогеназ 14, вовлеченный в низкоаффинное поглощение С02. Исследования локализации обоих типов дегидрогеназ показали, что они находятся в тилакоидных мембранах (Ohkawa et al., 2001). Таким образом, они могут быть непосредственно связаны с фотосинтетической электронтранспортной цепью. Предполагается, что С02 проходит через периплазматическую мембрану за счет пассивной или облегченной диффузии и только при последующем активном перемещении через тилакоидную мембрану трансформируется в менее подвижный НСОз , пополняя внутриклеточный пул С.
Price с соавторами (Price el al., 2002) предполагают, что ChpX и ChpY могут быть общей частью НАД(Ф)Н-дсгидрогепазного комплекса 1 д/4, поглощающего С02. Па рис.7 отражена схема, основанная на теорегической возможности Chp белков связываться с атомом Zn способом, аналогичным КА. В этом случае при атаке С02 комплекс Zn-OH" действует как сильный пуклеофил. Подобное предположение основано на том факге, что в последовательностях Chp белков десяти альфа- и бста-цианобактсрий встречаются консервативные участки, схожие с таковыми у КА (Maeda et al., 2002; Price et al.. 2002). Это два гистидиновых и один цистеиновый остаток, которые могут действовать как Zn-коорд и пирующие участки по тому же механизму, что и в КА (см. гл. 1.2.2.1). В этом случае данная система может играть важную роль в быстром преобразовании поглощенного С02 в НС03", в форме которого С] накапливается в цитозоли.
В то же время Chp белки не имеют значительной гомологии с известными КА и, самое главное, до сих пор не удалось продемонстрировать способность этих белков к гидратации С02.
Анализ экспрессии генов Synechocystis РСС 6803 с помощью метода микрочипов при переносе high-C02 клеток на среду, лимитированную по С02, позволил выявить, что к кластеру ndhF3/ndhD3/chpX принадлежат еще два гена -sill735 и sill736. Подобно ndhF3/ndhD3/chpX, их экспрессия активируется при С,-стрессе (Wang et al., 2004). Продукты этих генов и их роль в функционировании высокоаффинного комплекса НАД(Ф)Н-дегидрогеназ 13 остаются пока невыясненными.
НАД(Ф)П или ФДвоссг. то доноры, которые поставляют электроны ИАД(Ф)Н-дегидрогеназному комплексу 1Ш Далее С02 конвертируется в НСОз" по обычному для КА механизму. При этом отведенный за счет молекул буфера прогон переносится через тилакоидную мембрану в люмен по протонному шунту. Аналогично НАД(Ф)П-дсгидрогеназному комплексу 1 Е. coli (Friedrich & Scheide, 2000) субъединицы NdhD и F являются частью протонного канала и специализируются на взаимодействии с ChpX либо с ChpY субъединицами. В результате гидратация С02 до НСОз" активирует транспорт электронов и протонов через НАД(Ф)Н-дегидрогеиазные комплексы Ьм- Важной частью этой гипотезы является последний шаг, когда за счет спето-зависимого транспорта протонов к люмену тилакоидов осуществляется необратимая гидратация С02. Гидратация С02 может активизироваться за счет работы Q-цикла, подобного тому, который действует в цитохромном bf комплексе (Badger & Price, 2003).
Правильность предложенной схемы дискутируется и нуждается в дальнейших исследованиях и доказательствах.
В настоящее время известно, что только геномы пяти бета-цианобактерий содержат единичные копии ndhF, ndhD и chp генов, кодирующих и низко-, и высокоаффинное поглощение С02. Морские бета-цианобакгерии Trichoidesmium erythraeum имеют только низкоаффинную форму поглощения. Морская альфа-цианобактерия Synechococcus WH8I02 имеет единичные копии ndhF4, ndhD4 и chpX генов, кодирующих предполагаемую низкоаффинпуго систему поглощения С02, в то время как два вида Prochlorococcus marinus вообще не имеют гомологии к каким-либо низко- или высокоаффинным NDH-I3/4 генам. Это отсутствие гомологии означает, что данные организмы либо не способны к активному поглощению С02, либо осуществляют его с помощью иных, еще не изученных систем (Badger et al., 2002).
Общая характеристика классов карбоангидраз, их распространение и филогенез
В большинстве случаев ССМ деятельность может быть нарушена дефицитом макроэлементов или железа в среде. Количество ресурсов, которые клетка тратит на приобретение Cj с помощью ССМ, похоже, зависит от наличия других элементов питания (Giordano et al., 2005). К сожалению, этот вопрос изучен еще далеко не полно. Здесь мы остановимся на роли таких элементов, как азот, фосфор, сера, железо, натрий и цинк.
Азот. Поскольку развитие ССМ требует синтеза ряда белков de novo, для функционирования ССМ требуется клеточный азот (Giordano et al., 2005).
Chlorella emersonii (Beardall et al., 1991) и D. tertiolecta (Young & Beardall, 2005) при жестком лимитировании среды по азоту демонстрируют повышение аффинности клеток к ССЬ. Клетки С. reinhardtii при более мягком оірапичепии по азоту, наоборот, показывают снижение активности ССМ и митохондриальных Р-КА (Giordano et а!.. 2005). При увеличении концентрации NH/ в среде эффективность фотосинтетического использования С02 этими водорослями тоже растет (Beardall & Giordano, 2002). Возможно, некоторый разброс реакции клеток на ограничение по азоту связан с необходимостью достигнуть оптимального соотношения С: N (Beardall el al., 1991; Young & Beardall, 2005).
Клетки D. salina и D. parva., растущие на NH4+, имеют более высокую аффинность к С02. чем растущие на N03 (Giordano et al., 2005; Beardall & Giordano, 2002). Этот эффект независим от внешнего присутствия С02 и обеспечивает дополнительные доказательства того, что ССМ может быть вовлечен в контроль соотношений элементов в клетке (и особенно соотношения С : N) даже больше, чем в поглощение С; (Beardall & Giordano, 2002).
Фосфор. При лимитировании среды культивирования по фосфору индуцируется его поглощение, но начинает угнетаться любая другая активность клетки (Giordano et al., 2000). Это в совокупности с зависимостью іранспорта Cj от АТФ делает ССМ чувствительным к дефициту фосфора (Beardall & Giordano, 2002). Гак происходит, например, с С. emersonii (Giordano et al., 2005).
Сера. Как и при лимитировании по фосфору, ограничение клеток по сере индуцирует поглощение этого элемента и угнетает иные аспекты активности клетки. При дефиците серы стратегия клетки направлена на деградацию высокосерных и синтез пизкосерных белков (Giordano et al., 2000). РБФК -основной резервуар серы в клетке. Поэтому ожидаемо, что при голодании по сере его количество начнет снижаться. Это существенно снижает эффективность фотосинтеза (Giordano et al., 2000) и усвоения С; (Beardall & Giordano, 2002). Если фотосинтез при серпом голодании остается на том же уровне, клетка гибнет, как это было показано на примере мутанта С. reinhardtii по реї улирую щему фотосинтез гену sac! (Davics et al., 1995).
Примечательно, что активность периплазматической КА D. salina не угнетается при дефиците серы (Giordano et al., 2000), несмотря на снижение аффинности клеток К Cj.
Железо. Дефицит железа, как и азота, может угнетать фотосинтез. Экваториальный Тихий океан. Южный океан и вообще большая часть мирового океана является потенциально лимитированными но железу (Giordano el al., 2005). Несмотря на это, имеется довольно мало информации о взаимодействии между ССМ и дефицитом по этому элементу.
К немногим известным фактам относится то. что в хемоетатной культуре D. tertiolecta, лимитированной по железу (как и по азоту), наблюдается повышение аффинности клеток к Cj и снижение скорости роста (Young & Beardall, 2005), что, вероятно, отражает увеличение инвестиций в ССМ при этих условиях.
Цинк. Цинк используется как металл-кофактор для а-, р- и у-КА и непосредственно вовлечен в каталитический механизм этих ферментов (Moroney et al., 2001). Таким образом, предполагается, чго ограничение по цинку воздействует на ССМ на уровне работы КА.
Натрий. Еще одним важным для функционирования ССМ элементом является натрий. Активность CCV и №+-зависимого поглощения НС03" в цианобактериях требует натрия в микромолярных и миллимолярных дозах соответственно (Price et al., 1998). В условиях low-Q натрий становится жизненно необходимым элементом для тех видов цианобактерий, которые не имеют эффективных систем Na+-независимого транспорта НСОз" (например, Synechocysiis РСС6803) (So et al., 1998). Этот элемент действует как встречный ион для Na+ / Н1 ашипортеров, обеспечивающих рН-статированме, что также важно для нормального функционирования клетки, например, при повышении внутриклеточных концентраций СОг Таким образом, несмотря на то, что в ходе исследований механизмов развития ССМ накоплена масса разрозненных данных, их явно недостаточно, чтобы четко представить себе ход развития ССМ и сопутствующих Cj-стрессу изменений во всем многообразии их причинно-следственных связей.
Поиски активности карбоані идразы в различных фракциях клеток R. lineare и ингибиторный анализ фермента
Среди гипотетических у-КА можно выделить целый кластер белков СстМ цианобакгерий, обнаруженных у Synechococcus РСС7942, Synechococcus РСС7002 и Synechocystis РСС6803 (Smith & Ferry, 2000). Предполагается их участие в работе ССМ этих водных фотосиптстиков.
Помимо этого были исследованы гомологичные Cam белки СаІЕ из Е. coli и PhaM из Pseudomonas putida. Хотя КА активность у них не зарегистрирована, представляется вероятным, что оба этих белка являются цинк-содержащими, поскольку они оба имеют консервативные гистидиновые остатки.
Белок Е. coli CaiE - продукт гена caiE, входящего в оперон caiABCDE. Гены данного опсрона кодируют белки, вовлеченные в метаболизм карнитина (Eichler et al., 1994). Предполагается, что CaiE участвует либо в синтезе кофактора, необходимого для функционирования карнитиндегидратазы и карнитинрацемазы, либо в его активации (Eichler et al., 1994).
Функция белка PhaM у P. putida до сих пор не ясна. Предполагается, что он вовлечен в аэробную деградацию фенилуксусной кислоты (Olivera et al., 1998). Однако каким именно образом PhaM влияет на ее катаболизм, до сих пор не известно. В то же время PhaM демонстрирует большую степень идентичности с белком CaiE у Е. coli, из чего можно предположить, что он может играть сходную с ним роль активатора.
Интересно отметить, что у одного и того же организма могут обнаруживаться сразу несколько последовательностей, имеющих гомологию с Cam. Например, у Е. coli и Synechocystis РСС6803 есть две таких последовательности, в то время как P. aeruginosa содержит три гипотетических КА у-класса.
До сих пор у эукариог не было обнаружено ни одной последовательности, которая могла бы кодировать КА у-класса. Однако найдены отдельные участки нуклеотидной последовательности у A. thaliana и человека, не представляющие собой целого гена, но имеющие гомологию с у-КА. Примсчагельно, что в их составе обнаружены гистидиновые остатки, аналогичные формирующим активный центр у-КА, и консервативные Arg-59, Asp-61 и Gln-75 (Smith & Ferry, 2000).
В 1997 году в литературе появилось сообщение о новой КА, выделенной из морской диатомовой водоросли Thalassiosira weissflogii и получившей название TWCAl (Roberts et al., 1997). Очищенный фермент оказался мономером, ион Zn в котором координировался тремя гистидиновыми остатками и молекулой воды, что указывает на сходство фермента со структурой активного центра КА а- и у-клаесов (Сох et al., 2000).
Кинетические характеристики TWCA1 до сих нор не изучены, однако присутствие молекулы воды в качестве четвертого лигаида предполагает наличие у этого фермента механизма катализа, сходного с таковым у изученных классов КА. И хотя по биохимическим свойствам TWCA1 подобна всем известным КА, оказалось, что возведенная для этого белка нуклеотидная последовательность не имеет гомологии ни с одним классом фермента. Поиск по базам данных у эу- и прокариот открытых рам ко к считывания, идентичных этой нуклеотидной последовательности, таюке не дал результата (Tripp et al., 2001). Это позволило отнести TWCA1 к новому, четвертому классу КА, который авторы обозначили как 5-класс (Tripp et al., 2001). Тем не менее, этот вопрос до сих пор остается дискуссионным, - существует предположение, что TWCA1 является отдаленным гомологом а-класса КА (Lane & Morel, 2000).
До недавнего времени белок CsoS3, входящий в состав оболочки альфа-карбоксисом (Price et al., 1998; Cannon et al., 2001), считали просто одной из структурных составляющих этого компартмента. Но в начале 2004 года So с соавторами (So et al., 2004) представили экспериментальные доказательства того, что CsoS3 из Halothiobacillus neapolitanus, Prochlorococcus marinus MHD4, P.marinus MIT9313 и Synechococcus WH8102, іегерологично экспрсссируемые в Е. coli, обладают КА активностью. Очищенный посредством аффинной хроматографии CsoS3 из И. neapolitanus имел высокий уровень активности КЛ, составляющий около 30% от активности а-КЛ из эритроцитов быка. Активность CsoS3 ингибировалась классическим ингибитором КА - этокс и зол амидом - и хелатами двухвалентных металлов типа дипиколиновой и нитрилотриацеловой кислот. Чувствительность этого фермента к дитиотрейтолу позволила предположить, что в осуществлении его каталитической реакции важную роль играют остатки цистсина. Таким образом, вероятно, что механизм реакции этого фермента сходен с механизмом, характерным для остальных известных КА (So et al., 2004).
Пространственная близость CsoS3 к РБФК/О и его малая доля в оболочке карбоксисом позволяют предположить, что данная КА является скорее не структурным элементом, а катализатором преобразования внуїриклеточного пула НСО," в С02 - субстрат для РБФК/О (So et al., 2004).
Хотя CsoS3 катализирует классическую реакцию КА, его аминокислотная последовательность и предполагаемая вторичная структура значительно отличаются от ферментов, принадлежащих к другим классам КА. Филогенегический анализ не обнаружил даже отдаленного сходства между CsoS3 и другими классами КА. Это позволило предположить, что он представляет новое эволюционное направление фермента - е-класс (So et al., 2004).
Поиск гомологов к CsoS3 из Н. neapolitanus по базам данных показал, что, помимо уже упомянуты организмов, гомологичные ему белки присутствуют в хемолитоавтотрофах Thiobacillus denitrificans, Acidothiobacillus ferrooxidans и Thiomonas intermedia и фотолитоавтотрофах P. marinus SSI20 (или CCMP1375) и P. marinus subsp. pastoris CCMP1378. Причем степень гомологии между ними очень высока и может достигать 99% (например, между P. marinus MED4 и ССМР1378) (Soetal.,2004).
Отсутствие значимой гомологии последовательностей между известными классами КА позволяет предположить, что они появились в процессе эволюции независимо друг от друга и представляют пример конвергентной эволюции (Liljas & Laurberg, 2000). Анализ распространения различных классов КА в живых организмах показывает, что а-класс является самой молодой группой - по сравнению с древними р- и у-ферментами (Smith & Ferry, 2000).
Согласно одним литературным данным а-класс (более характерный для животных и не имеющий даже гипотетических гомологов среди архей) эволютшонировал от общего родоначального гена примерно 200-300 млн. лет назад (Tripp et al., 2001), по мнению других авторов это событие произошло примерно 500-600 млн. лет назад (Hewctt-Emmett & Tashian, 1996).
Определению времени, когда класс р-КА эволюционировал из своей родовой формы, мешает сильное расхождение в структуре р-КА из различных подгрупп, которое ведет к отклонению от так называемых «молекулярных часов». Однако это же разнообразие первичных последовательностей р-КА позволяет предположить древнее происхождение этого класса. Дополнительным доводом в пользу этого служит тот факт, что Р-класс обнаруживается у представителей одной из наиболее древних ветвей живых организов - термофилов (Smith & Ferry, 2000).
Влияние бикарбоната на концентрацию неорганического углерода и активность карбоангидраз в клетках R. lineare
Измерение активности КА осуществляли электрометрическим способом (Wilbur & Andersen, 1948) по изменению концентрации Н+ в реакции гидратации диоксида углерода с помощью рН-метра М-901 с самописцем М-951 (Orion Research, США). Реакционная смесь содержала интактньте клетки, отмытые от культуральной среды, суммарный гомогенат или его фракции (0.3-0.7 мг белка/мл) в фосфатном буфере, аналогичном описанному в разделе 2.2. с рН 8.1. При ингибиторном анализе в реакционную смесь добавляли различные концентрации ингибиторов КА (ацетазоламид или этоксизоламид). Реакцию начинали быстрым введением 2 мл насыщенного водного раствора С02 в равный объем реакционной среды и проводили при 2С. Параметры кинетической реакции регистрировали в течение 100 сек. после ее начала. Контролем служила неферментативная реакция. Активность КА рассчитывали по разнице начальной скорости реакции гидратации С02 в контроле (ТІ) и образце (Т2) и выражали в условных единицах Вильбура-Андерсена (усл. ед.) на мг хлорофилла или мг белка. Для расчетов использовали формулу:
Содержание белка определяли методом Lowry (Lowry et al., 1951) согласно протоколу Bio-Rad Laboratories с использованием набора стандартных растворов.
Содержание хлорофилла измеряли спектрофотометрически в метанольных экстрактах (Porra et al., 1989). Для этого к пробам объемом 50 мкл добавляли по 1.5 мл абсолютного метанола. Экстракцию осуществляли в течение 10-12 часов при температуре 4С, после чего пробы осшкдали (5 мин, 12 000 g) и определяли адсорбцию полученных экстрактов при длинах волны 650 и 665 им, оберегая их от солнечного света для предотвращения распада хлорофилла.
Концентрацию хлорофилла и белка рассчитывали в мг/мл и использовали для расчета активности КА и объема пробы, необходимого для проведения электрофореза.
Электрофоретическое разделение белков проводили в денатурирующих условиях в 12% полиакриламидном геле (Laemmli, 1970). В качестве метчиков использовали смесь белковых стандартов (Pharmacia Biotech, LWW calibration kit for electrophoresis) следующего состава: фосфорилаза b из мускулатуры кроликов (97 кДа), бычий сывороточный альбумин (66 кДа), овалъбумин из куринных яиц (45 кДа), карбоапгилраза из бычьих эритроцитов (30 кДа), ингибитор трипсина из соевых бобов (20Л кДа), а-лактальбумин из коровьего молока (14.4 кДа).
Количество нанесенного белка составляло 20 мкг на дорожку. Предварительно пробы выдерживали 20 минут при 55С для солюбилизации белков. После электрофореза гель окрашивали серебром в соответствие с протоколом Pharmacia Biotech, используя набор стандартных растворов или Кумасси.
Для вестерн-блот-анализа белки после разделения электрофорезом переносились на нигроцеллюлозную мембрану. Иммуноблоттинг осуществляли согласно протоколу Bio-Rad Laboratories с использованием стандартных реагентов. В качестве первичных антител использовали афинно очищенные антитела к а-КА Cah3 С. reinhardlii и к [3-КА из Соссотуха sp., любезно предоставление проф. Samuelsson (Umea University, Швеция). В качестве вторичных антител использовали анти-кроличьи антитела, меченые пероксидазой хрена (Amersham Life Science). Специфическое связывание визуализировали, используя хемолюминесцентиые растворы (ECL, Amersham Life Science).
Для контроля физиологического состояния и чистоты культуры использовали световую микроскопию. Внешний вид клеток и чистоту культуры оценивали с помощью светового микроскопа Jcnaval (Karl Zeiss, Германия) при 250 или 400-кратном увеличении. Исследование прижизненной флуоресценции хлорофилла проводили е помощью микроскопа Ergaval (Karl Zeiss, Германия) с флуоресцентной насадкой при увеличении в 300 или 600 раз, используя возбуждающие фильтры В-223 и В-224 и запирающий фильтр G-249 (Маркслова с соавт., 2000).
Ультраструктуру клегки исследовали с помощью электронной микроскопии, используя методику Маркеловой с соавторами (1990). Согласно данной методике клетки R. lineare предварительно фиксировали 4% параформальдегидом при температуре 4С в течение 4-Ю суток. Затем образец промывали фосфатным буфером, содержащим 0.5% NaII2P04 и 2.3% Na2HP04, рН 7.4. Постфиксацию 1% OsC 4, обезвоживание в градиенте спиртов и заключение в эпоксидную смолу проводили по стандартным методикам.
Для проведения электронно-иммунохимического анализа в соответствии с методикой (Маркелова с соавт., 1990) между этапами фиксации параформальдегидом и OsC клетки подвергали иммуноцитохимической обработке. Первый этап иммуноцитохимической реакции осуществляли, выдерживая пробирки с опытным материалом при температуре 24С в течение 1 часа, а затем 23 часа при 4С, используя антитела кролика к а-КА (Cah3) из С. reinhardtii. Отмывка проводилась троекратно буфером в течение 24 часов. Второй этап иммунохимической реакции и отмывку выполняли в тех же условиях, используя Protein-A-Gold (Sigma). Параллельно с каждым опытным образцом фиксировали два контрольных образца. Для контроля специфичности иммунохимических реакций один из образцов не обрабатывали первичными антителами, подвергая его всем остальным процедурам наравне с опытными образцами (включая реакцию с Protein-A-Gold).
Образцы резали на ультрамикротоме и анализировали на трансмиссионном электронном микроскопе JEM JEOL Х-100 (Япония) без дополнительного контрастирования.
Значение цитоплазматического рН клеток R. Ипеаге определяли с помощью спектроскопии 31Р-ядерного магнитного резонанса (31Р-ЯМР) на MSL-200 (Bruker, І ермапия) в ампулах диаметром 10 мм. При приготовлении образцов осажденные клетки R. Ипеаге промывали 2 mM K2S04 и ресусиендировали в буфере HEPES-KOH следующего состава: 50 mM HEPES, 2 тМ ЕДТА, рН7.2 или 9.6. В качестве стандарта использовали 85%-ную ортофосфорную кислоту. Спектры снимали при температуре 22С и частоте электромагнитного излучения 81 МГц с числом сканирований 3-6 тыс. Цитоплазматический рИ определяли, используя зависимость химического сдвига пика неорганических фосфатов цитоплазмы от рП. Для построения стандартной кривой использовали клегочный экстракт R. Ипеаге в 6 М НСІО-! согласно Kuchitsu et al. (1989). Индивидуальные пики резонансных сигналов идентифицировали па основе имеющихся литературных данных (Bental et al., 1987; Kuchitsu et al., 1989).
