Индуцибельность ключевых ферментов метаболизма С4-кислот и их роль в фотосинтезе при водном дефиците Юзбеков, Ахмед Кадималиевич

Введение к работе

Актуальность проблемы. Исследование механизмов и путей регу-яции фотосинтетической ассимиляции COg - одно из актуальных нап-авлений современной фитофизиологии. Оно представляет интерес в лане разработки принципов управления процессом фотосинтеза и полу-ения растений с высокоактивным фотосинтезом, способных создавать аиболее совершенные системы высокой продуктивности в условиях гло-ального потепления и аридизации климата.

В настоящее время высшие растения в соответствии с особенности механизма фотосинтетической ассимиляции COg условно разделятся на три группы.

К первой группе относятся С^-растения, продуцирующие трифос-эглицериновую кислоту (3-ФГК) в качестве первичного стабильного родукта фиксаций СО? на рибулозо-І,5-бисфосфате (РБФ) при помощи Зі- карбоксигеназы (РБФК/О); основу фотосинтетического метаболизму гл еро да у данной группы, как у всех без исключения растений, эставляет общепризнанный цикл Кальвина (Calvin,Benson, 1948). зи этом функционирует и вторая карбоксилирувцая система с учас-іем фосфоенолпируваткарбоксилаза (#ЕПК) (вапйигэку, 1955). По это-1 каналу восстанавливается около 20$ от общей фиксированной угле-юлоты с образованием органических кислот и аминокислот ( Bass-am, 196*).

Во вторув группу вклвчены С^-растения, у которых С^-кислоты цавелевоуксусная, яблочная и аспарагиновая) являются первичными зодуктами фиксации COj на фосфоеиолпнрувате (ЙШ) при участии 5ПК (Тарчевский, Карпилов, I963;Kortschak et al., 1965;Hatch , lack, 1966; Магомедов, 1974). Эти кислоты выполняет роль источ-!ков COg для функционирования цикла Кальвина. В литературе С^~ гть углерода в фотосинтезе рассматривается как новая "надстрой-i" к циклу Кальвина, возникшая в ходе адаптациогенеза растений їй дефіците COg, воды в сочетании о повыаенной температурой (Жу-!Нко. 1988).

В трет»бй группе объединены растения, с,так называемым, об-
!Ном кислот по типу толстянковых (САя), фотосинтез которых вмеет
[д обцих черт как с С^-, їак ж С^-растеииями (Ting et al., 1972;
>yse, I976;Oamond , 1978). У представителей данной группы расте-
ій, помимо атмосферной СС^, источником углерода для фотосинтеза
іужит яблочная кислота, образовавшаяся при гетеротрофной фикса-
га С0₂. -

- k -

До недавнего времени С^-путь углерода (С^-фотосинтез) исследовался как механизм концентрирования COg в центрах карбок-силирования РБ# при посредстве РБФК/0. Более того, как свидетельствуют многочисленные данные литературы, С^-растения характеризуются устойчивостью к засухе, повышенной температуре и засоление. В то же самое время специфические и неспецифические а< пекты сопряженной устойчивости С^-растений к различным условия) среды освещены в литературе далеко неполно. Поэтому необходимо изучение связи между функционированием С^-фотосинтеза и устойчивостью С^-растений к различным экстремальным факторам внешне! среды. С другой стороны, поскольку оптимальные условия функционирования Cjj-фотосинтеза у С^-растений являются стрессорами дл) С^-растений, необходимо также выявление возможной общности механизмов адаптации C-j- и С^-растений к неблагоприятным факторш окружающей среды.

Современная теория биохимической адаптации уделяет основні внимание ферментным системам, обеспечивающим жизнь организма в стрессорных условиях (Хочачка, Сомеро, 1988). При этом биологическая роль ряда ферментов метаболизма С^-кислот, синтез которі предшествует становлению С^-фотосинтеза у С^-растений изучена слабо у Co.- и САМ-растений.

К началу наших исследований (1973) было известно, что болі шинство ферментов метаболизма С^-кислот представлены у Со-, С^-и САМ-растений, причем в зависимости от типа углеродного метабе лизма активность и кинетическая характеристики их различаются (Hatch et al.,I969; Hatch , Slack, I970;0ra-bam et el.,1970; Ting, Osmond, 1973 а.Ъ.с; 'Иіаіогко et al.,I974).

Можно было полагать, что пути регуляции активности ферментов ФЕП-карбоксилазной системы факторами внешней среды в листы Cjj-растений сильно отличаются от таковых у Cj-видоб. Представлг лось важным выяснить сущность различий ферментов метаболизма С_; кислот у Со- и С^-растений при становлении фотосинтетического і парата листа и определить роль их в "фотосинтезе поддержания "& растений в условиях водного дефицита.

Основой для выполнения настоящей работы послужили наши даі ные (Юзбеков и др., 1978; 1985) о высокой степени гетерогенности и стойкости к повреждению некоторых ферментов йШ-карбоксиле ной системы у Cj- и С^-растений в различных условиях светового температурного режимов, а также водного дефицита. Можно было oi дать и специфические черты углеродного метаболизма, характерные

, ' ' '"' *'⁵-- -''': '

для Со-растениЗ, определяемые экстремальными условиями роота и ' развития: использование С^-кислот в качестве источников COg для . цикла.Кальвина, когда одним из факторов, лимитирующих'^отосинте- тический газообмен, является' увеличение устьичного сопротивления. I Особый интерес как.для полного понимания фотосинтеза в целом -так. и-понимания эволюции углеродного-метаболизма у высших расте-

ний представляют,исследования некоторых параметров сходства*в ме-

табс-лизме Cjj-кислот у растений с .-фотосинтезом -и САМ.

Решение этих .вопросов особенно актуально в связи с проблема
ми эволюции первичной фиксации-002 У Cfj-растений, изучения мета- .
болическ'их-путей адаптации растений 'к.-водному дефициту .и поиска
' механизмов концентрирования -СО^ у С-3-растений. .

Цель « оснбвные задачи исследования» Основной целью работы являлось внявлеиие различий в функционировании -ключевых'ферментов метдйолизма С^-кислот у Cj- и С^-растений діри- становлении фото- * синтетического аппарата листа и установление ролитигв фотосинт'е- . -зе C-j-растений.в условиях водного дефицита* когда-одним из факторов, лимитирующих, фотосинтетический -газообмен, является увели-

. 'чение .устричного сопротивления.. При этом особое внимание' уделя- . лось изучению энзиматических механивмов устойчивости 'фотосинтети-ческогЬ аппарата СЦ-раетений' к воздействию различного по времени и силе обезвоживания, а также разработке нетрадиционных методов

. оценки" засухоустойчивости растений,- . . * '

В^ связи-с поставленной целью в задачи исследования входило і

1. Сравнительное изучение,индукции ключевых.ферментов мета-'болизна Cjj-^кислот и цикла Кальвина в зеленеющих, листьях-С^ и С^~ .ра'стений 'в различных условиях" еветоврго и температурного режимов.

2. Определение некето'рых параметров сходства и различия в »

- метаболизме' С^-кислот у растений с' С^-фотосинтезом и.САМ.-

3.. Исследование активности и- внутриклеточной локализации не
которых 'ферментов' ЕП-карбоксилазной системы в листьях C-j-расте-
ний. . " - - . . ,'

k. Выявление-тканесгецифич'еской активности ключевых фермен-
. тов метаболизма С/,~кислот и цикла Кальвина у С^-растений при вод-»
, ном дефиците.' , . ''.'' '-.-

5-. 'Изучение воздействия различного по вр'емени и .силе обезво
живания на фотооинтетический газообмен и состав_продуктов фикса
ции .^МС0'₂' листьев Сз-растений. ' . '.

6. Установление связи между степенью изменения активности

- б -

ферментов ЙЗП-карбоксилазной системи и устойчивостью фотосинтетического аппарата листа к водному дефициту, а также разработка на этой основе экспресс-методов оценки засухоустойчивости растений.

Основные положения, выносимые на защиту.

3. Синтез de novo изоэнэимов ключевых ферментов метаболиэ ма Cjj-кислот и цикла Кальвина в листьях С^-растений при становлении фотосинтетического аппарата листа.

4. Сходство и различие в метаболизме С^-кислот у растений с С^-фотосинтезом и САМ.

5. Локализация ЕПК в цитоплазме клеток мезофилла С^-.С^-v САМ растений.

6. Избирательный характер действия водного дефицита на активность некоторых ферментов ФЕП-карбоксилазной системы и цикла Кальвина в листьях Со- и С^-растений.

7. йндуцибельность ключевых ферментов метаболизма С*-кисло - один из факторов формирования специализированных механизмов устойчивости фотосинтетического аппарата к водному дефициту.

8. Связь между степенью изменения активности ферментов метаболизма С^-кислот, цикла Кальвина и параметрами водообмена.

9. Схема возможных реакций участия С^-кислот в фотосинтетк ческом метаболизме C-j-растений в условиях водного дефицита; об-сукдение гипотезы об использовании С^~кислот в качестве источи» ков COg для "фотосинтеза поддержания", когда одним из факторов, лимитирующих фотосинтетический газообмен, является увеличение диффузионного сопротивления листа.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное многопланої исследование активности и индукции ряда ферментов метаболизма С кислот и цикла Кальвина в листьях Со-, С^- и САМ-растений в pas личных условиях светового и температурного режимов, а тааке во/ ного дефицита. Установлено, что принципиальные различия в функционировании ферментов ЙЭД-карбоксилазвой системы у данных груг растений обусловлены различной ролью их в фотосинтетическом метаболизме. Доказано, что светоактивация ключевых ферментов метг болизма С^-чсислот - ФЕПК и НАДФ - специфичного маликэнзимаОВДЗ -МЭ) в зеленеющих листьях С^-растений связана с синтезом ферме* тов ае novo, в частности, с появлением дополнительного изоэнзи-ма в электрофоретическом спектре ФЕПК- с относительной электро-форетичоской подвижностью (ОЭП) 0,25 и синтезом основного изо-

- 7 -фермента НАДФ-МЭ.

Выявлены основные параметры сходства метаболизма Сл-кислот у С^~ и САМ-растений. Последние выражаются в синтезе яблочной кислоты в листьях С^- и САМ-растений путем прямого J, -карбокси-лирования КЗП, локализации ЕПК в цитоплазме и наличии среди САМ-растений, по аналогии с С^-растениями, третьей, ранее неизвестной, подгруппы с НАД-МЗ декарбокешшрованием яблочной кислоты.

Установлено, что в листьях и частях колоса пиеницы представлен комплекс ферментов метаболизма С^-кислот, включающий ФЕПК, НАД-специфичнуп малатдегидрогеназу (НАД-МДГ), НАДФ-МДГ, НАД-$Э, НАД$-ИЭ, аспартатаминотрансферазу (АспАТ) и аланинамино-трансферазу (АлаАТ). Основными ферментами, осуществляющими восстановление оксалоацетата в малат и декарбоксилирование малата, являются соответственно НАД-МДГ и НАД-МЭ. Активность фосфоенол-пируваткарбоксикиназы (ФЕПКК) и оксалоацетатдекарбоксилазы не выявлена.

Показано, что при длительной засухе у Cj-растений индуцируется активность ферментов метаболизма С^-кислот. В результате ее среди продуктов фиксации *^COg на свету и в' темноте усиливается образование Cg-, Cj- и С^-кислот (глицкна, аланина, серина, треонина, аспарагиновой и яблочной кислот).

Полученные результаты свидетельствуют о возмозетом механизме образования аланина на свету в результате метаболизма С^-кис-лот:

Аспартат —— Малат —«- Пируват .-Алании

Выявлена аналогия начальных этапов хода этих реакций с реакциями в клетках обкладки проводящих пучков аспартатных форм Сц--растений и некоторых представителей САМ с НАД-МЭ декарбокешшрованием яблочной кислоты.

Экспериментально установлено, что ферменты $ЕП-карбоксилаз-ной системы (ШК, НАД-МДГ, НАД-МЭ,АспАТ и АлаАТ) являются более стойкими к длительному действию водного дефицита, чем РБ$К/0 и НАД~ГА$Д. Выявлена взаимосвязь нежду активностью ключевых ферментов метаболизма С^-кислот, цикла Кальвина и длительностью сохранения"фотосинтеза поддержания" у устойчивых к водному дефициту растений. Меньшая повреждаемость ферментов ФЕП-карбокси-лазной системы в условиях продолжительного обезвоживания, наряду о другими компенсаторными процессами обмена, составляет комплекс адаптивных реакций, обеспечивающих выживание растений

в экстремальных условиях. Именно таким комплексом адаптивных
реакций обладают- G^-растения.. . ' . . . ,

На основании обобщения .результатов исследования впервые , предложена я^ема возможных реакций участия С^-кйсЛот в фотбсий-тетическбм метаболизме, Co-растений при-водном дефиците. Выска-' зана- и экспериментально обоснована идея й возможном механизме . адаптации фртосинтетиче'ского аппарата Со~расте.ний к,длительно- " му действие водного дефицита путем осуществления у них метаболизма С_д-кислот. Вероятно, последние мопут быть использованы в . качестве источников COg для "фотосинтеза поддержания", когда одним из факторов, лимитируйщих фотосинтетичёский СО^-газообмен, является.увеличение диффузионного-сопротивления-листа. , * <

' Научно-практическая значимость работы. - \ ' , '

Результаты .комплексного многопланового исследования' фермен
тов" метаболизма С^-кислот, цикла їальвина и их роли в фотосинте
зе" важнейших' сельскохозяйственных культур имеют' первостепенное
значение для разработки принципов 'управления фотосинтезом в' ус
ловиях обостряющейся экологической ситуации (глобальное потепле
ние и аридиз,ация климата). - - ' . _ ' .

Они представляют интерес, в частности, для разработки способов выращивания растений в засушливых условиях, создания тестовых систем для селекциойного. отбора устойчивых'к засухе .видов и' сортов, а также для программирования урожая контрастных ,по засухоустойчивости растений. ...,-'.'

Результаты исследований -позволили разработать: .

а} способ оценки устрйчивости.растений к продолжительному обезвоживанию,' основанный на определении активности ключевых ферментов, цикла Кальвина и метаболизма Є^г-кислот (РБФ-карбокси-геназы, НАЛ$-'глицеральдегидфоефатдегидрогеназы и'ФЕПК)-(Рац. предложение. Ъ 339 от\ОЭ.02.92г.);.

" б) оп'особ выращивания амаранта, в-засушливых условиях (При-
-орит.етная справка от" 15.12.92г; по заявке 93010077 на изобре
тение); ' . - .

- " в) методическое пособие: '"Спектрофотометрические способы, определения активности ферментов фотосинтетического метаболизма; углерода у Cj- и Cjj-растёний" 1990);

г) научно-обоснованные рекомендации производству Физиологические основы орошения и окучивания амаранта"(1993).

Полученные нами экспериментальные -результаты и выводы дйс-

сертации вклвчены в программу лекционного курса по физиолог биохимии растений в Новгородском сельскохозяйственном институте. Методические разработки используются при выполнении научно-исследовательских работ в Днепропетровском, Кабардино-Балкарском, Санкт-Петербургском, Томском государственных университетах, Новгородском сельскохозяйственном институте и институте физиологии растений и генетики АН Украины. (Акты о внедрении прилагаются). Материалы диссертации о механизме светоиндукции ключевых ферментов метаболизма С^-кислот и цихла Кальвина в зеленевших листьях C-j- и С^-растений использованы при составлении монографии "Фотосинтез и органические кислоты" (Магомедов, 1988).

Апробация работы. Исследования проводились по плану научно-исследовательских работ лаборатории фотосинтеза Биологического научно-исследовательского института Ленинградского (Санкт-Петербургского) государственного университета (1973-1982 гг.), Новгородского сельскохозяйственного института (1983-1987 гг.), Института физиологии растений и генетики АН Украины (1988-1993 гг.) и являются составной частью государственных заданий и целевых комплексных программ.

Результаты, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались: на научных семинарах кафедры физиологии и биохимии растений Ленинградского государственного университета (1974,1978) лабораторий фотосинтеза Биологического научно-исследовательского института Ленинградского университета (1974, 1978, 1981) и ВИР им.Н.И.Вавилова (Ленинград-Пушкин, 1978), на юбилейной сессии кафедры физиологии и биохимии растений Ленинградского университета, посвященной 100-летию со дня рождения ак.С.П.Кос-тычева (Ленинград, 1977), на 13-ом научно-координационном совещании "Изучение первичных и вторичных продуктов фотосинтеза и их метаболизма в растениях" (Душанбе, 1977), на Всесоюзном симпозиуме "Продуктивность фотосинтезирующих систем в экстремальных условиях" (Улан-Удэ, 1978), на научно-практических конфе- ренциях профессорско-преподавательского состава Ленинградского и Новгородского сельскохозяйственных институтов (1983-1986),на Всесоюзной конференции по проблемам современной биотехнологии и физико-химической биологии (Москва-Звенигород, 1985), на научных семинарах отдела физиологии водного режима растений Института физиологии растений и генетики АН Украины (Киев, 1984, [985, 1988, 1990, 1991), на расширенном заседании кафедры фи-

- 10 -зиологии растений Московской сельскохозяйственной академии и> К.А.Тимирязева (1968), на Республиканской конференции "Методі интенсификации селекционного процесса (Одесса, 1990), на II съезде Всесовзного общества физиологов растений (Минск, 1990 ^ на научном семинаре группы экологии растений Биологического научно-исследовательского института Ленинградского государственного университета (1991), на научно-практической конферені "Вклад молодых ученых в интексификацип сельского хозяйства УС (Киев-Чабаны, 1991), на Всесоюзной конференции "Фиэиолого-геи тические механизмы регуляции азотного питания растений (Киев, 1991), на объединенном семинаре отделов экологии фотосинтеза фиэиологии водного режима растений Института физиологии расте ний и генетики АН Украины (Киев, 1992),.на Международном симп эиуме "Амарант - кормовая, пищевая и лекарственная культура" (Чехо-Словакия, 1992), на III съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), на II съезде Украинского общества физиологов растений (Киев, 1993), на Специ лизированных научных семинарах Института физиологии растений генетики АН Украины (Киев, 1992, 1993), на научном семинаре л боратории фотосинтеза ВИР им.Н.И.Вавилова (Санкт-Петербург-Пу кин, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 р бот, 3 статьи находятся в печати. Приоритетная справка от 15. 92г. по заявке № 93010077 на изобретение; разработаны: I рац. предложение № 339 от 03.02.92г., научно-обоснованные рекомендации производству "Физиологические основы орошения и окучива ния амаранта" (1993), I методическое пособие "Спектрофотометр ческие способы определения активности ключевых ферментов фото синтетического метаболизма углерода у Cj- и С^- растений" (1991

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из вв дения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части (8 глав), заключения, вы. дов и библиографии, включающей 489 наименований, из них 319 на иностранных языках; работа изложен на на 292 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц : 35 рисунков.