Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Гидролитические ферменты и их ингибиторы как компоненты взаимодействия системы «растение – патоген» (обзор литературы) 11
1.1. Гидролитические ферменты фитопатогенных микроорганизмов и их роль в патогенезе 11
1.2. Белковые ингибиторы растений как регуляторы активности чужеродных гидролаз 21
1.2.1. Ингибиторы протеиназ 23
1.2.2. Ингибиторы амилаз 26
1.2.3. Ингибиторы пектиназ 29
1.2.4. Ингибиторы целлюлаз 32
1.3. Использование сигнальных молекул и элиситоров хитиновой природы для регуляции активности ингибиторов гидролаз 34
1.3.1. Салициловая кислота 35
1.3.2. Жасмоновая кислота 38
1.3.3. Хитин и его производные 41
Экспериментальная часть 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы 46
2.1. Объекты исследований 46
2.1.1. Характеристика возбудителей болезней 46
2.1.1.1. Септориоз пшеницы (Septoria nodorum Berk.) 46
2.1.1.2. Корневые гнили злаковых (Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoenaker) 47
2.1.1.3. Твердая головня пшеницы (Tilletia caries (DC.) Tul.) 48
2.1.2. Индукторы устойчивости и способы их применения 50
2.1.3. Условия проведения экспериментов 51
2.2. Методы биохимических исследований з
2.2.1. Получение белковых экстрактов 52
2.2.2. Определение активности протеиназ (субстрат БАПНА) 52
2.2.3. Определение активности ингибиторов протеиназ (субстрат БАПНА) 53
2.2.4. Определение активности гидролаз и их ингибиторов методом агарозных пластин 54
2.2.5. Количественное определение белка 55
2.2.6. Определение содержания H2O2 56
2.3. Цитохимические исследования 56
2.4. Молекулярно-биологические методы 56
2.4.1. Выделение и очистка РНК из растений 56
2.4.2. Измерение концентрации РНК 57
2.4.3. Реакция от-ПЦР на основе матричной РНК и полуколичественный анализ экспрессии генов 57
2.4.4. Полимеразная цепная реакция ДНК 58
2.4.5. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в ПЦР 58
2.4.6. Электрофорез нуклеиновых кислот после ПЦР в ПААГ и агарозе 59
2.5. Статистическая обработка результатов 59
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 60
3.1. Активность гидролаз и их белковых ингибиторов в растениях пшеницы при инфицировании некротрофным грибом Bipolaris sorokiniana и обработке сигнальными молекулами 60
3.1.1. Влияние сигнальных молекул на активность гидролаз и их белковых ингибиторов в листьях пшеницы при инфицировании B. sorokiniana 61
3.1.2. Защитное действие биопрепаратов на основе Bacillus thuringiensis и Bacillus subtilis против корневой гнили 69
3.2. Активность гидролаз и их белковых ингибиторов в растениях пшеницы при инфицировании биотрофным грибом Tilletia caries и обработке сигнальными молекулами 72
3.3. Активность гидролаз и их белковых ингибиторов в растениях пшеницы при инфицировании гемибиотрофным грибом Septoria nodorum и обработке сигнальными молекулами 79
3.3.1. Сравнительный анализ активности гидролаз и их ингибиторов в растениях пшеницы различных по устойчивости сортов при септориозе 79
3.3.2. Динамика активности гидролаз и их ингибиторов в листьях пшеницы, зараженных штаммами S. nodorum различной агрессивности и обработанных СК и ЖК 85
3.4. Использование элиситоров для индукции активности ингибиторов гидролаз и повышения устойчивости растений пшеницы к возбудителям болезней с различной стратегией питания 93
3.4.1. Влияние хитоолигосахаридов с различной степенью ацетилирования на активность ингибиторов протеиназ и экспрессию гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 в патосистеме «Triticum aestivum – Bipolaris sorokiniana» 94
3.4.2. Влияние хитоолигосахаридов с различной степенью ацетилирования на активность ингибиторов протеиназ и экспрессию гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 в патосистеме «Triticum aestivum – Septoria nodorum» 98
3.5. Сравнительная оценка экспрессии гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 в
листьях пшеницы в связи с устойчивостью к Septoria nodorum 102
Заключение 105
Список литературы 111
- Белковые ингибиторы растений как регуляторы активности чужеродных гидролаз
- Корневые гнили злаковых (Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoenaker)
- Реакция от-ПЦР на основе матричной РНК и полуколичественный анализ экспрессии генов
- Защитное действие биопрепаратов на основе Bacillus thuringiensis и Bacillus subtilis против корневой гнили
Белковые ингибиторы растений как регуляторы активности чужеродных гидролаз
Интерес к гидролитическим ферментам, секретируемым микроорганизмами, обусловлен рядом причин, среди которых одна из важнейших связана с их участием в инициации и развитии патологического процесса в растительных тканях. Выяснение их роли в патогенезе создает возможность подавления или ослабления патогенного процесса путем регуляции активности гидролаз, участвующих в этом процессе (Мосолов, Валуева, 2006; Basaran et al., 2007; Ревина и др., 2008; Van den Brink, De Vries, 2011). Наиболее широко и разнообразно у патогенных микроорганизмов представлены деполимеризующие ферменты, такие как целлюлазы, пектиназы, протеазы, фосфолипазы и ксиланазы, которые участвуют в деградации компонентов клеточных стенок растений (Желдакова, Мямин, 2006; Дунаевский и др., 2008; Feng et al., 2009; Protsenko et al., 2010; Кудрявцева и др., 2013; Silva et al., 2013).
Клеточная стенка растений является основным физическим барьером на пути проникновения микроорганизмов. Остов растительной клеточной стенки составляют переплетенные микро- и макрофибриллы целлюлозы, которые погружены в аморфную желеобразную массу – матрикс. Матрикс состоит из гемицеллюлоз, пектиновых веществ и белка (Проценко и др., 2008). Пектин представляет собой гетерополисахарид, который состоит из молекул галактуроната, связанных в линейную цепь посредством -1,4-гликозидных связей. Природные пектины имеют, как правило, высокий процент (от 40 до 65 %) метилированных карбоксильных групп галактуронатных остатков. Остатки галактуроновой кислоты могут также содержать некоторое количество ацетил-эстерифицированных гидроксильных групп (Смирнов, Климочкин, 2008). Совместное действие различных ферментов приводит к эффективной деградации пектиновых веществ стенки и последующему использованию образующихся пектиновых олигомеров в качестве источника углерода для роста микроорганизмов.
Пектиназы по природе атакуемых связей подразделяются на две группы: эстеразы (пектинметилэстеразы и пектинацетилэстеразы) и деполимеразы (пектатлиазы, пектинлиазы и полигалактуроназы) (Arunachalam, Asha, 2010). Деполимеразы, в свою очередь, различаются по предпочитаемому ими субстрату – пектин (пектинлиазы, КФ 4.2.2.10) или полигалактуроновая кислота (пектатлиазы, КФ 4.2.2.2. и полигалактуроназы КФ 3.2.1.15.) и, кроме того, по механизму действия на -1,4-гликозидные связи в молекулах пектина или полигалактуроновой кислоты – -элиминация (пектатлиазы и пектинлиазы) либо гидролиз (полигалактуроназы). По типу атаки полимерной молекулы субстрата (терминальный или неупорядоченный) деполимеразы принадлежат к экзо- и эндотипу (Желдакова, Мямин, 2006; Basaran et al., 2007; Смирнов, Климочкин, 2008; Van den Brink, De Vries, 2011). Показано, что именно начальное действие пектолитических ферментов на нативную растительную клеточную стенку определяет доступность ее составных компонентов для остальных энзимов (Синицына и др., 2007; Protsenko et al., 2010). Кроме того, доступность полимеров клеточной стенки действию пектиназ определяется и размером молекул данной группы ферментов. К примеру, воздействие очищенной эндополигалактуроназы Colletotrichum lindemuthianum на клеточную стенку стимулирует высвобождение из нее наряду с галактуроновой кислотой, галактозы, арабинозы, рамнозы и ксилозы, которые соединены с пектиновыми полимерами ковалентной связью (Van den Brink, De Vries, 2011). В тоже время, энзим Erwinia chrysanthemi вызывает освобождение более 50% сахаров пектиновой фракции, входящих в состав клеточных стенок, не оказывая влияния на гемицеллюлозы (Проценко и др., 2008). Первым ферментом, который выделяется возбудителями болезней растений на начальных этапах поражения растений, является полигалактуроназа (ПГ) (Federici et al., 2006). Он считается одним из основных факторов патогенеза (Protsenko et al., 2010). Полигалактуроназа необходима для внедрения в растительные ткани широкому кругу эндобионтов: бактериальным и грибным патогенам, служащим причиной мягких гнилей; круглым червям; насекомым; грибам-микоризообразователям; представителям высших растений, ведущих паразитический образ жизни (Niture, 2008; Maulik et al., 2009).
Исследована кристаллическая структура молекул полигалактуроназ грибных и бактериальных патогенов растений (Проценко и др., 2008). Молекула полигалактуроназы представляет собой -слой из параллельных слоев с гидрофобным центром и обращенными к растворителю случайно ориентированными аминокислотами, образующими петли разной длины. Полигалактуроназа выявлена в спорах грибов рода Puccinia, Botrytis, Penicillium, Neurospora и Aphanomyces (Kars, Jan, 2008; Niture, 2008). В сочетании с протопектиназой она была обнаружена в спорах Aspergillus niger и у трех видов Botrytis — Botrytis cinerea, Botrytis anthophila и Botrytis allii, а также у Sclerotinia sclerotiorum и в сочетании с пектинметилэстеразой у Ceratocystis fimbriata и Verticillium dahliae, а с обоими этими ферментами у Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (Basaran et al., 2007; Niture, 2008; Van den Brink, De Vries, 2011).
Пектолитические ферменты представлены также у ряда фитопатогенных бактерий. Так, продуцируемые бактериями рода Erwinia пектатлиазы играют основную роль в развитии симптомов заболевания у растений (Manjurul, Tsuyumu, 2005). Пектатлиазы у продуцирующего их вида бактерий представлены несколькими изоформами ферментов, отличающимися друг от друга кинетическими и физико-химическими свойствами. Подавляющее число изоферментов пектатлиаз секретируется клетками в окружающую среду, где они проявляют свою активность в отношении пектиновых полимеров и олигомеров, однако описаны пектатлиазы, имеющие внутриклеточную локализацию (Payasi et al., 2009). Так, большая часть пектолитической активности бактерий Erwinia chrysanthemi, выявляемая на синтетических средах, является результатом совместного действия пяти основных изоферментов, различающихся по значению изоэлектрической точки: PelA, PelB, PelC, PelD и PelE. Однако бактерии, у которых во всех пяти основных генах пектатлиаз были мутации, все еще обладали мацерирующей активностью на растительных тканях. Это способствовало обнаружению еще пяти новых изоформ пектатлиаз, вносящих меньший вклад в суммарную пектолитическую активность бактерий Erwinia chrysanthemi (Creze et al., 2008).
Для функционирования секретируемых микроорганизмами эндопектатлиаз необходимы ионы Ca2+, другие использованные ионы либо не оказывали существенного влияния (Cu2+, Mg2+) либо сильно ингибировали (Zn2+,Ba2+, Co2+) активность изоферментов пектатлиаз. рН-Оптимум ранее указанных ферментов находится в слабощелочной-щелочной области рН(Gummadi et al., 2007).
Корневые гнили злаковых (Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoenaker)
Стрессовый фитогормон жасмоновая кислота является ключевым фактором индукции иммунитета растений к некротрофным патогенам, некоторым растительноядным насекомым и нематодам (Васюкова и др., 2009). При инфицировании, действии элиситоров или повреждении тканей растений в них происходит быстрое накопление жасмоновой кислоты, что вызывает «включение» жасмонат-зависимого сигнального пути и активацию синтеза ряда белков, принимающих участие в защитных реакциях растений (Озерецковская и др., 2009).
Жасмоновая кислота синтезируется из линоленовой кислоты, источником которой служат мембранные липиды. Биосинтез протекает в несколько этапов, контролируемых своим специфическим ферментом. В результате последовательного действия липоксигеназы, алленоксидсинтетазы и алленоксидциклазы, линоленовая кислота превращается в 12-окси-фитодиеновую кислоту, которая подвергается трехкратному -окислению и метаболизируется в жасмоновую кислоту (Howe, 2001; Hofmann et al., 2006). Отмечено, что алленоксидсинтетаза синтезируется de novo именно при травмировании клеток растения, и только в этих условиях осуществляется конверсия гидропероксидов жирных кислот в алленэпоксиды, которые, в свою очередь, являются предшественниками ЖК (Zerbe et al., 2007). Если вышеуказанные реакции осуществляются в пластидах, то дальнейшие энзиматические превращения октадеканоидов происходят в пероксисомах, в которые транспортируется 12-окси-фитодиеновая кислота. В пероксисомах 12-окси-фитодиеновая кислота превращается в 3-оксо-2-(2-пентил)-циклопентан-1-октаноидную кислоту. В пероксисомах также протекают заключительные этапы синтеза ЖК с помощью трех циклов -окисления (Schaller,Stintzi, 2008).
В повышении резистентности растений к стрессорам биотической и абиотической природы принимает участие также летучее производное ЖК – метилжасмонат (Ме-ЖК) (Yoon et al., 2009; Sampedro et al., 2011; Egger, Koschier, 2014). Метилжасмонат является мобильным сигналом, осуществляющим взаимодействия между отдельными растениями, а возможно, и устанавливает контакты между растениями разной видовой принадлежности. Выдвинуто предположение (Delano-Frier et al., 2013), что метилжасмонат служит запасным веществом, которое выделяется из клеток наружу, и клетки могут воспринимать метилжасмонат как сигнал тревоги. ЖК запускает экспрессию генов специфических полипептидов, обеспечивающих защиту растительных клеток от патогенов и стрессов – ферментов флавоноидного биосинтеза (халконсинтазу, фенилаланинаммиаклиазу, полифенолоксидазу), сесквитерпеноидного биогенеза, тионина, осмотина (антигрибных белков), ингибиторов протеиназ (Васюкова, Озерецковская, 2009; Antico et al., 2012). Выделяют два возможных варианта участия жасмонатов в индуцировании защитных генов: ЖК и Ме-ЖК могут сами выступать в качестве элиситоров, запускающих образование в растениях защитных соединений; жасмонаты, не индуцируя или слабо индуцируя реакции устойчивости, способны усиливать действие элиситоров (Яковлева и др., 2013). Установлено, что экзогенный Ме-ЖК в концентрации 10 -6-10 -5 М даже в отсутствии элиситоров индуцирует в суспензионной культуре клеток различных растений синтез вторичных метаболитов. Жасмонат и его предшественник 12-оксофитодиеновая кислота стимулируют образование фитоалексинов в культурах клеток более 30 видов растений (Kazan, Manners, 2008). Однако у других видов растений при добавлении жамоната не наблюдается синтеза вторичных защитных метаболитов. К примеру, в суспензионной культуре петрушки, обработанной метил жасмонатом, выявлены лишь незначительные количества кумарина. Тем не менее, прединкубация суспензионной культуры с Ме-ЖК увеличивает ее восприимчивость к низким концентрациям биогенных элиситоров, запускающих защитные реакции: усиление секреции кумарина, отложения фенолов в клеточных стенках и продукции активных форм кислорода (Wasternack, 2007).
Жасмонатный сигналинг относительно подробно изучен у двудольных – арабидопсиса (Arabidopsis thaliana), томатов (Solanum lycopersicum), табака (Nicotiana tabacum) и в меньшей степени некоторых однодольных – ячменя (Hordeum vulgare) и риса (Oryza sativa) (Kazan, Manners, 2008). Одним из ключевых компонентов жасмонатного сигналинга считается ген COI1 (coronative insensitive1) (Balbi, Devoto, 2008; Kazan, Manners, 2008). Установлено, что белок COI1 необходим для удаления белков-репрессоров транскрипт-факторов генов сигналинга ЖК.
Жасмоновая кислота также оказывает влияние на процессы роста и развития, вызывает старение растений и опадение листьев, подавляет процессы прорастания семян. Старение листьев сопровождается потерей хлорофилла, деградацией хлоропластных белков, накоплением белков de novo (Liechti, Farmer, 2002). Кроме того, ЖК ингибирует рост корней (Головацкая, Карначук, 2008), индуцирует клубнеобразование (Ладыженская и др., 2009; Аксенова и др., 2012), регулирует водный дефицит (Shana, Liang, 2010). В ряде работ показано повышение устойчивости растений к абиотическим стрессорам под влиянием экзогенной ЖК. Например, при обработке ЖК повышалась устойчивость ячменя к водному стрессу (Walia et al., 2007), засолению (Bandurska et al., 2003) и действию индуктора окислительного стресса параквата (Hristova, Popova, 2002), пшеницы – к облучению УФ-В (Liu et al., 2012) и токсическим концентрациям NaCl (Шакирова и др., 2010), сои – к действию хлорида кадмия (Keramat et al., 2009).
Реакция от-ПЦР на основе матричной РНК и полуколичественный анализ экспрессии генов
Проростки пшеницы наиболее восприимчивы к грибу в течение первой недели прорастания. Весь вегетационный период гриб развивается под апикальной меристемой, не вызывая значительных изменений в фенотипе инфицированного растения. Во время цветения мицелий проникает во все части цветков, разрушает зерновку и продуцирует телиоспоры, вся масса телиоспор находится под семенной оболочкой зерна. Внешне болезнь проявляется в начале фазы молочной спелости зерна. Зараженные растения отличаются от здоровых пониженным ростом и колосьями сине-зеленого цвета. Высоко устойчивые сорта, в фазе проростка тоже заражаются патогеном, но в период выколашивания пораженных колосьев не наблюдается (Каратыгин, 1981; Кривченко, 1984).
Выявить головневую инфекцию на ранних этапах развития растений можно только с помощью микроскопических методов, что является весьма трудоемким и кропотливым процессом. Вероятно, этим объясняется немногочисленность работ, посвященных изучению, как механизма защитного ответа растений, так и эффективности новых биопрепаратов против твердой головни пшеницы (Каратыгин, 1981; Максимов, Хайруллин, 2012; Чекмарев, 2012).
Обнаружено, что на 7 сутки после инокуляции спорами T. caries активность амилаз и протеиназ в колеоптилях пшеницы незначительно понижалась (рисунок 9, рисунок 10). При предобработке сигнальными молекулами гидролитическая активность также снижалась, что, вероятно, обусловлено повышением антигидролитической активности в растительных тканях (рисунок 11
Биотрофные патогены обладают более низким разнообразием и концентрацией токсичных для растения метаболитов, в частности гидролитических ферментов, по сравнению с некротрофами. Так, у возбудителя мучнистой росы ячменя Erysiphe graminis гидролитические ферменты выделяются только из кончика инфекционной гифы, и их активность проявляется только на расстоянии 0.1 мкм от гифы (Feng et al., 2009). Кроме того, некоторые ферменты, губительно действующие на растительную ткань, могут и вовсе исчезать. Например, у биотрофа Uromyces fabae не выявлена активность ряда ферментов, участвующих в деградации углеводов клеточной стенки растений: эндополигалактуроназы, эндопектатлиазы, целлюлазы (Antico et al., 2012). В то время как некротроф Verticillium albo-atrum характеризуется достаточно высокой активностью вышеназванных ферментов (Novo et al., 2006). Рисунок 10. Активность протеиназ в колеоптилях пшеницы при заражении T. caries и обработке сигнальными молекулами. 1 – контроль; 2 – T. caries; 3 – обработка СК; 4 – обработка СК + T. caries; 5 – обработка ЖК; 6 – обработка ЖК + T. caries.
В процессе эволюции растения выработали систему подавления активности чужеродных протеаз с помощью ингибиторов протеолитических ферментов (Мосолов, Валуева, 2005). Предполагается, что быстрый синтез и длительно поддерживаемая их высокая активность в зараженных растениях может защищать молекулярные структуры хозяйских клеток от протеаз патогенов и фитофагов (Gomes et al., 2011; Кудрявцева и др., 2013). Ранее было выявлено, что устойчивость пшеницы к головневым болезням положительно связана с активностью ингибиторов протеиназ, в частности ингибиторов трипсина, в зародыше зерновки, что может быть одним из решающих факторов взаимодействия растения с возбудителем головни, и предполагает возможность использования этого свойства для создания болезнеустойчивых форм пшеницы (Ибрагимов, 1999). К сожалению, механизмы регуляции активности ингибиторов протеиназ в растениях пшеницы, инфицированных T. caries, на сегодняшний день малоизучены. В связи с этим, следующим этапом работы стало изучение влияния СК и ЖК на активность ингибиторов протеиназ в растениях пшеницы, инфицированных T. caries. Выявлено, что на 7 сутки после заражения активность ингибиторов протеиназ возрастала (рисунок 11). Предобработка семян пшеницы СК или ЖК стимулировала повышение уровня антипротеолитической активности в колептиле как зараженных, так и незараженных растений. Причем, наибольшее возрастание активности ингибиторов протеиназ наблюдалось в варианте с ЖК. Так, активность ингибиторов протеиназ в этом варианте повышалась в 8 раз по сравнению с необработанным и инфицированным вариантом.
Если сопоставить литературные сведения об этапах инфекционного процесса, вызванного грибом T. caries (Каратыгин, 1981), с полученными результатами анализа антипротеолитической активности в колеоптиле пшеницы (рисунок 11), то можно утверждать, что ответное повышение функциональной активности исследованной группы белков вызывалось прорастанием телиоспор патогена и его проникновением в ткани хозяина. Следует отметить, что ингибиторы протеиназ могут блокировать биосинтез хитина грибов, что объясняется посттрансляционным механизмом созревания хитинсинтаз с участием протеаз (King et al., 2011). Результатом данного процесса является подавление роста и развития патогенов в растительных тканях.
Гриб T. caries способен выделять в растительные ткани гормоны, в частности цитокинины (Barna et al., 2008). Эти соединения запускают экспрессию ряда генов стрессовых белков (Abu et al., 2006) и регулируют синтез этилена и жасмоновой кислоты (Trione, Sayavedra, 1988). В то же время, известно, что и ЖК - эффективный индуктор накопления цитокининов (Васюкова, Озерецковская, 2009). Можно предположить, что значительное возрастание активности ингибиторов протеиназ в варианте с ЖК обусловлено накоплением цитокининов, продуцируемых растением под влиянием жасмоновой кислоты, и гормональной активностью самого гриба.
Так как салициловая и жасмоновая кислоты выполняют сигнальную функцию, влияя на экспрессию генов защитных белков, нами была исследована экспрессия гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 (рисунок 12).
Исследование показало, что при инфицировании T. caries, обработке СК или ЖК экспрессия гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 усиливалась (рисунок 12). Причем, уровень экспрессии гена в инфицированных необработанных растениях был ниже, чем в предобработанных и инокулированных растениях пшеницы. ЖК оказывала наибольший индуцирующий эффект на экспрессию гена ингибитора протеиназы по сравнению с СК. Так, в растениях, предобработанных ЖК и инокулированных, экспрессия гена исследуемого белка была в 2 раз выше, чем в необработанных сигнальными молекулами и зараженных растениях (рисунок 12).
Защитное действие биопрепаратов на основе Bacillus thuringiensis и Bacillus subtilis против корневой гнили
Одним их первых проявлений атаки патогенов является экскреция ими гидролитических ферментов, в частности протеиназ и карбогидраз (пектиназ, целлюлаз, амилаз). Протеиназы патогенных микроорганизмов принимают участие как в разрушении структурных и защитных белков (Carlile et al., 2000; Olivieri et al., 2002; Дунаевский и др., 2005; Poloni et al., 2009), так и в процессинге собственных внеклеточных белков, существенных для развития заболевания (Shevchik et al., 1998; Chand et al., 2014). Роль пектиназ и целлюлаз, в свою очередь, сводится к деградации полимеров растительной клеточной стенки. Причем, доступность составляющих ее полимеров обеспечивается начальным действием пектолитических ферментов (Синицына и др., 2007; Protsenko et al., 2010). Значение же амилаз связано с расщеплением запасной формы углеводов растений – крахмала. В ответ на действие гидролаз патогена в растении индуцируется синтез белковых ингибиторов, которые подавляют активность чужеродных ферментов. Учитывая, тот факт, что течение патологического процесса определяется как растением-хозяином, так и патогеном, возникает необходимость рассмотрения комплекса «гидролаза – ингибитор гидролазы» в каждой конкретной патосистеме.
В наших исследованиях показано, что инфицирование растений пшеницы возбудителями грибных болезней различной трофности (некротроф Bipolaris sorokiniana, биотроф Tilletia caries, гемибиотроф Septoria nodorum) приводит к изменению активности гидролаз и их ингибиторов в тканях пшеницы восприимчивого сорта. В патосистемах «Triticum aestivum – некротроф Bipolaris sorokiniana» и «Triticum aestivum – гемибиотроф Septoria nodorum» наблюдается повышение активности гидролаз. Динамика активности ферментов в растениях пшеницы соотносится с развитием патогенов в тканях растения-хозяина и свидетельствует об активно развертывающемся патологическом процессе. В патосистеме «Triticum aestivum – биотроф Tilletia caries» активность гидролаз, напротив, снижается, что, вероятно, связано с активным воздействием гриба на метаболизм растения, обусловленное гормональной активностью патогена. В тоже время активность ингибиторов экзогенных протеиназ возрастает во всех рассмотренных патосистемах. Активация ингибиторов протеиназ в растениях пшеницы способствует эффективной инактивации чужеродных ферментов при прорастании семян, обеспечивая тем самым неспецифическую устойчивость.
Эффективным подходом к изучению механизмов развития устойчивости растений к фитопатогенам может служить сравнение защитных реакций контрастных по устойчивости сортов растений к одной форме патогена и изучение реакций растений одного сорта на инфицирование штаммами патогена различной степени агрессивности. Нами показано, что в инфицированных Septoria nodorum листьях растений пшеницы устойчивого сорта наблюдается активация ингибиторов гидролаз по сравнению с растениями восприимчивого сорта. Соответственно, высокий уровень активности ингибиторов гидролаз в растительных тканях предполагает участие этих соединений в формировании устойчивости пшеницы к септориозу.
Анализ динамики активности гидролаз и их белковых ингибиторов в листьях пшеницы, инфицированных различными по агрессивности штаммами S. nodorum, позволяет говорить о том, что снижение устойчивости растений при заражении высоко агрессивным штаммом, обусловлено способностью патогена снижать экспрессию гена ингибитора протеиназы и активность белкового продукта.
Важную роль во взаимоотношениях растений и патогенов играют сигнальные молекулы, такие как салициловая и жасмоновая кислоты. Предполагается, что салицилатный сигналинг влияет на устойчивость к биотрофам, а жасмонатный сигналинг определяет развитие устойчивости к некротрофам. Однако нет однозначного ответа о взаимодействии сигнальных путей, поскольку в процессе роста и развития растения взаимодействуют с различными патогенами. В наших исследованиях показано, что обработка жасмоновой и салициловой кислотами способствует активации ингибиторов экзогенных гидролаз в растительных тканях, инфицированных Bipolaris sorokiniana, Tilletia caries и Septoria nodorum. Наибольший индуцирующий эффект на активность ингибиторов амилаз и протеиназ оказывает жасмоновая кислота. Результаты исследований механизмов патогенности и устойчивости при инфекционных болезнях растений служат фундаментальной основой для разработки высокоэффективных мероприятий по защите растений от болезней и вредителей. Одно из направлений в стратегии защиты растений – стимулирование естественных защитных механизмов растительного организма при обработке препаратами на основе биогенных элиситоров. Наиболее эффективными элиситорами являются полисахаридные компоненты клеточных стенок фитопатогенов, в частности производные хитина и хитозана (Озерецковская и др., 2002; Трошина и др., 2004; Варламов и др., 2010; Максимов и др., 2011; Васюкова и др., 2012). Особый интерес при изучении механизмов индуцирующего действия на иммунный потенциал растительных клеток среди них представляют водорастворимые низкомолекулярные хитоолигосахариды. В индукции развития ответных защитных реакций растительных клеток важным показателем является степень ацетилирования хитоолигосахаридов. Олигомеры хитина активируют транскрипцию множества генов, кодирующих стрессовые белки (De Jonge et al., 2010; Васюкова и др., 2012).
Наши исследования свидетельствуют о том, что в патосистеме «Triticum аestivum – гемибиотрофный патоген Sestoria nodorum» наибольший индуцирующий эффект на экспрессию гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 оказывают хитоолигосахариды со степенью ацетилирования 30%, напротив, в патосистеме «Triticum аestivum – некротрофный патоген Bipolaris sorokiniana» более значительным было влияние хитоолигосахаридов со степенью ацетилирования 65%. Полученные данные позволяют расширить представления о механизмах регулирования резистентности растений к воздействию факторов биотической природы и могут служить теоретической основой при разработке технологии применения индукторов устойчивости.
Таким образом, гидролитические ферменты патогена, растений и их ингибиторы из растительных тканей вовлечены в процесс взаимодействия растений-хозяев с патогенами различной пищевой специализации. Изменение баланса активности гидролаз и их ингибиторов в тканях растений может служить одним из механизмов повышения устойчивости к возбудителям грибных болезней пшеницы с различным типом трофности. Наиболее перспективным в этом плане является использование препаратов на основе сигнальных молекул и элиситоров, приводящих к длительной индукции активности ингибиторов чужеродных гидролитических ферментов в растениях.